專利名稱：一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多糖組分分析領(lǐng)域，具體涉及一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法。
背景技術(shù)：
云芝糖肽是從擔子菌綱云芝Cov-1菌株的液體發(fā)酵菌絲體中提取得到的一種中成藥，其活性成分為結(jié)合蛋白多糖，臨床研究證明云芝糖肽具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、促進受損肝細胞恢復等作用，用于食管癌、胃癌及原發(fā)性肺癌患者放、化療所致的氣陰兩虛、心脾不足證。云芝糖肽是一類天然高分子有機物，其結(jié)構(gòu)復雜多樣。云芝糖肽國家標準WS3-228 (Z-047)-2003 (Z)中記載了多糖含量測定、蛋白含量測定等主要質(zhì)控指標。其中，多糖含量測定是采用分光光度法，以葡萄糖(C6H12O6)作為多糖含量的測定指標，不得少于38.0%?？梢?，我們目前缺乏監(jiān)控云芝糖肽中多糖組分的專屬性方法。如今，市場上來源于云芝的產(chǎn)品較多，不僅有以云芝Cov-1菌株的菌絲體為原料制備而成的云芝糖肽，還有以其他云芝菌株菌絲體為原料的云芝胞內(nèi)糖肽以及以云芝子實體為原料制備而成的云芝多糖。由于原料不同以及提取工藝的差異導致不同產(chǎn)品質(zhì)量的巨大差異，臨床療效也各不相同，如云芝糖肽的適應(yīng)癥是腫瘤，云芝胞內(nèi)糖肽和云芝多糖的適應(yīng)癥主要是肝炎。然而由于現(xiàn)有云芝糖肽質(zhì)量標準中檢測方法缺乏專屬性，尚不能有效區(qū)分采用不同原料和不同工藝制備而成的多糖肽類產(chǎn)品。目前單糖組分色譜分離測定的方法有氣相色譜法、薄層色譜法和高效液相色譜法。但是各種色譜方法均存在一定的不足之處。氣相色譜法是測定單糖組分的經(jīng)典方法，由于糖本身沒有足夠的揮發(fā)性，所以必須在色譜分析之前預(yù)先進行乙酰化或硅烷化衍生化處理，將糖轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性強的衍生物。從而導致單糖組分在衍生化過程中發(fā)生異構(gòu)化，產(chǎn)生的異構(gòu)化衍生物影響了組分的分離及定量。薄層色譜法雖然比較簡單，但是由于存在靈敏度低的缺點，有些含量低的單糖不易檢測出來。采用HPLC檢測單糖的難點也在于單糖不具有紫外吸收的基團，因此必須先對單糖進行衍生化處理，使它帶上能紫外吸收的基團，才能進行分析。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法，曾被嘗試用于云芝糖肽中單糖組分的分析，雖然采用了非常復雜的梯度洗脫法也未能實現(xiàn)D-木糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖三種單糖的有效分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，從云芝糖肽中有效分離出8種單糖組分，得出該8種單糖間的摩爾比。本發(fā)明所采用的檢測方法為1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法，通過如下步驟實現(xiàn)(I) HPLC色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗；(2)單糖組分測定，分別吸取混合對照品溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中分析得到色譜圖，并根據(jù)各單糖分子量及其衍生物的色譜峰面積計算各單糖的摩爾比；所述對照品溶液為D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-鹽酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖對照品的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液；所述供試品溶液為云芝糖肽酸水解產(chǎn)物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液。所述步驟(I)中的色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相是乙腈-磷酸緩沖液，其中乙腈的體積百分比為16-20%，磷酸緩沖液的濃度為O. 01-0. lmol/L,pH值為6. 8-7. 2 ;紫外檢測器檢測波長為250-260nm，理論塔板數(shù)按葡萄糖1_苯基_3_甲基-5-吡唑啉酮衍生物計算不得低于2000，為2000-20000。優(yōu)選的，所述磷酸緩沖液的濃度為O. 03-0. 07mol/L, pH值為6. 9-7.1。所述步驟(2)中混合對照品溶液液的制備方法是，將D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-氨基葡萄糖和L-鼠李糖的對照品溶解于水；在對照品水溶液中加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加熱， 糖的總量與NaOH和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的摩爾比為1:35-40 :47-55 ;冷卻后在混合液中加入HCl溶液中和，HCl與所述NaOH的摩爾比為1:1 ;烘干、萃取、取水相過濾，即得混合對照品溶液。所述步驟(2)中供試品溶液的制備方法是，將研細的云芝糖肽待測樣品用三氟乙酸酸解；酸解的待測樣品反復經(jīng)過蒸干、乙醇溶解、再蒸干三個步驟，直至無三氟乙酸酸性氣味產(chǎn)生為止；在蒸干的樣品中加入蒸餾水溶解，再加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加熱，樣品與NaOH和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的加入比例為Ig 0. 1-0. 15mol :0. 1-0. 2mol ;冷卻后在混合液中加入HCl溶液中和，HCl與所述NaOH的摩爾比為1:1 ;烘干、萃取、取水相過濾，即得供試品溶液。所述三氟乙酸的濃度為2-4mol/L，酸解時間為2_6小時。所述加熱溫度為65°C -75°C，所述烘干溫度為65°C -75°C。所述步驟(2)中的萃取劑為氯仿，再加入等體積的蒸餾水，充分振搖，待靜置分層后吸取上層水相，再重復3次萃取操作，最后把上層水溶液通過O. 22-0. 45 μ m的濾膜過濾。所述步驟(2)中，分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各5-20 μ L并注入高效液相色譜儀中分析得到色譜圖，根據(jù)各單糖分子量及其衍生物的色譜峰面積計算各單糖的摩爾比。經(jīng)過檢測，云芝糖肽中的D-葡萄糖D_甘露糖D_木糖L_巖藻糖D_半乳糖D-阿拉伯糖L-鼠李糖D-氨基葡萄糖的摩爾比為1:0. 50±0. 40:0. 45±0. 35:O. 21±0· 20 :0. 21±0· 20 :0. 21±0· 20 :0. 11±0· 10 :0. 11±0· 10。本發(fā)明提供的云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，可以用于檢測云芝糖肽原料藥及其制劑的單糖組分分析。包括云芝糖肽的硬膠囊劑、軟膠囊劑、片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、口含片劑、口崩片劑、口服液劑、顆粒劑、粉劑、丸劑、丹劑、散劑、膏劑、混懸劑、注射劑、溶液劑、噴霧劑、滴劑。本發(fā)明的有益效果是采用本發(fā)明公開的檢測方法，在HPLC上實現(xiàn)了 D-木糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖衍生物的有效分離，建立了在同一色譜條件下同時檢測云芝糖肽中8種單糖組分的摩爾比例；通過檢測組分中各單糖組分的摩爾比來有效區(qū)分云芝糖肽、云芝胞內(nèi)糖肽、云芝胞外糖肽和云芝多糖等多糖肽類產(chǎn)品，從而確保云芝糖肽的質(zhì)量和療效。


圖1是混合對照品的高效液相色譜圖。圖2是實施例1的云芝糖肽供試品的高效液相色譜圖。圖中1、D-甘露糖，2、D-氨基葡萄糖，3、L-鼠李糖，4、D-葡萄糖，5、D-木糖，6、D-半乳糖，7、D-阿拉伯糖，8、L-巖藻糖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明實施例1按照中國藥典2010版(一部)附錄VI D高效液相色譜法測定。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗用Phenomenex Luna C18 (4. 6mmX250mm, 5 μ m)柱；流動相是乙腈-磷酸緩沖液，其中乙腈的體積百分比為18%，磷酸緩沖液的濃度為0. 05mol/L,磷酸緩沖液的pH值為7. 0,紫外檢測器檢測波長為255nm，理論塔板數(shù)按葡萄糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物計算為6560?；旌蠈φ掌啡芤旱闹苽渚芊Q取經(jīng)105°C干燥至恒重的D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖操糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-鹽酸氨基匍萄糖和L-鼠李糖對照品適量，加水配制成各單糖濃度為2mmol/L的混合對照品溶液，取250 μ L置于EP管中，加入250 μ L0. 6mol/L NaOH溶液和500 μ L O. 4mol/Ll_苯基-3-甲基_5_吡唑啉酮的甲醇溶液，70°C水浴反應(yīng)I小時。冷水浴冷卻IOmin后加入500 μ L 0. 3mol/L HCl中和，70°C烘干，再加入氯仿lmL，蒸餾水lmL，充分振搖，待靜置分層后吸取上層水相，再重復3次萃取操作，最后把上層水溶液通過0. 22 μ m的濾膜過濾，即為混合對照品標準液。供試品溶液的制備將云芝糖肽待測樣品置于碾缽中研細將云芝糖肽待測樣品置于碾缽中研細，精密稱定5. 0mg置于5mL安瓿中，加入ImL 3mol/L三氟乙酸并封管,在110°C條件下酸解4小時；酸解樣品轉(zhuǎn)移至小坩堝中蒸干，再加入5mL乙醇溶解后再蒸干，反復3次上述蒸干、溶解步驟后樣品無三氟乙酸酸性氣味產(chǎn)生；加入ImL蒸餾水，輕輕搖晃充分溶解樣品，精密吸取250μ L到5mL EP管中，加入250 μ L 0. 6mol/L Na0H,500y L0. 4mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，70°C水浴反應(yīng)I小時。冷水浴冷卻10min，W；v500yL 0. 3mol/L HCl中和，70°C烘干，再加入氯仿lmL，蒸餾水lmL，充分振搖，待靜置分層后吸取上層水相，再重復3次萃取操作，最后把上層水溶液通過0. 22 μ m的濾膜過濾，即為供試品溶液。單糖組分測定分別精密吸取混合對照品溶液液和供試品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀，根據(jù)各單糖分子量及其衍生物的色譜峰面積計算各單糖的摩爾比，結(jié)果如圖1、圖2。分析結(jié)果表明，云芝糖肽原料中D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖L-巖藻糖D-半乳糖D-阿拉伯糖L-鼠李糖D-氨基葡萄糖的摩爾比為1:0. 22 :0. 19 :0. 14 :0. 09 :0. 07 0. 04 :0. 02。實施例2按照中國藥典2010版(一部)附錄VI D高效液相色譜法測定。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗用Hypersil BDS C18 (4. 6mmX 200mm, 5 μ m)柱；流動相是乙腈-磷酸緩沖液，其中乙腈的體積百分比為16%，磷酸緩沖液的濃度為O0. 03mol/L,磷酸緩沖液的pH值為6. 9，紫外檢測器檢測波長為250nm，理論塔板數(shù)按葡萄糖1_苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物計算為8308?；旌蠈φ掌啡芤旱闹苽渫瑢嵤├?中的混合對照品標準液的制備方法。供試品溶液的制備取10粒云芝糖肽膠囊，將其內(nèi)容物倒出并置于碾缽中研細，精密稱定5. Omg置于5mL安瓿中，加入ImL 4mol/L三氟乙酸并封管,在120°C條件下酸解2小時；酸解樣品轉(zhuǎn)移至小坩堝中蒸干，再加入5mL乙醇溶解后再蒸干，反復3次上述蒸干、溶解步驟后樣品無三氟乙酸酸性氣味產(chǎn)生；加入ImL蒸餾水，輕輕搖晃充分溶解樣品，精密吸取 250 μ L 到 5mL EP 管中，加入 250 μ L O. 5mol/L Na0H、500yL O. 25mol/L1-苯 基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，70°C水浴反應(yīng)I小時后冷水浴冷卻lOmin，加入500 μ L O. 25mol/L HCl中和，70°C烘干，再加入氯仿lmL，蒸餾水lmL，充分振搖，待靜置分層后吸取上層水相，再重復3次萃取操作，最后把上層水溶液通過O. 45 μ m的濾膜過濾，即為供試品溶液。單糖組分測定分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀，根據(jù)各單糖分子量及其衍生物的色譜峰面積計算各單糖的摩爾比。分析結(jié)果表明，云芝糖肽膠囊中D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖L-巖藻糖D-半乳糖D-阿拉伯糖L-鼠李糖D-氨基葡萄糖的摩爾比為1:0. 28 :0. 19 :0. 13 :0. 11 :0. 09 :0. 07 :0. 03。實施例3按照中國藥典2010版(一部)附錄VI D高效液相色譜法測定。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗用Phenomenex Gemini C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)柱；流動相是乙腈-磷酸緩沖液，其中乙腈的體積百分含量為20%，磷酸緩沖液的濃度為O. 07mo 1/L，磷酸緩沖液的pH值為7. 1，紫外檢測器檢測波長為260nm，理論塔板數(shù)按葡萄糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物計算為12310。混合對照品溶液的制備同實施例1中的混合對照品標準液的制備方法。供試品溶液的制備取10片云芝糖肽片置于碾缽中研細，精密稱定5. Omg置于5mL安瓿中，加入ImL 2mol/L三氟乙酸并封管，在110°C條件下酸解6小時；酸解樣品轉(zhuǎn)移至小坩堝中蒸干，再加入5mL乙醇溶解后再蒸干，反復3次上述蒸干、溶解步驟后樣品無三氟乙酸酸性氣味產(chǎn)生；加入ImL蒸餾水，輕輕搖晃充分溶解樣品，精密吸取250 yL到5mL EP管中，加入250 μ L O. 75mol/L Na0H、500yL O. 5mol/Ll-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，70°C水浴反應(yīng)I小時后冷水浴冷卻10min，WA500yL O. 375mol/L HCl中和，70°C烘干，再加入氯仿lmL，蒸餾水lmL，充分振搖，待靜置分層后吸取上層水相，再重復3次萃取操作，最后把上層水溶液通過O. 45 μ m的濾膜過濾，即為供試品溶液。單糖組分測定分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀，根據(jù)各單糖分子量及其衍生物的色譜峰面積計算各單糖的摩爾比。分析結(jié)果表明，云芝糖肽片劑中D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖L-巖藻糖D-半乳糖D-阿拉伯糖L-鼠李糖D-氨基葡萄糖的摩爾比為1:0. 38 :0. 09 :0. 08 :0. 07 :0. 08 :0. 10 :0. 04。
權(quán)利要求
1.一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，其特征在于所述檢測方法為1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法，其步驟包括(1)HPLC色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗；(2)單糖組分測定，分別吸取混合對照品溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中分析得到色譜圖，并根據(jù)各單糖分子量及其衍生物色譜峰面積計算各單糖的摩爾比；所述對照品溶液為D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-鹽酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖對照品的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液；所述供試品溶液為云芝糖肽酸水解產(chǎn)物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，其特征在于所述步驟(I)中的色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相是乙腈-磷酸緩沖液，其中乙腈的體積百分比為16-20%，磷酸緩沖液的濃度為O. 01-0. lmol/L，pH值為6. 8-7. 2 ;紫外檢測器檢測波長為250-260nm,理論塔板數(shù)按葡萄糖1-苯基-3-甲基-5-卩比唑啉酮衍生物計算不得低于2000。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，其特征在于所述磷酸緩沖液的濃度為O. 03-0. 07mol/L, PH值為6. 9-7.1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中混合對照品溶液的制備方法是，將D-匍萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖操糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-鹽酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖的對照品溶解于水；在對照品水溶液中加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加熱，糖的總量與NaOH 和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的摩爾比為1:35-40 47-55 ;冷卻后在混合液中加入HCl 溶液中和，HCl與所述NaOH的摩爾比為1:1 ;烘干、萃取、取水相過濾，即得混合對照品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中供試品溶液的制備方法是，將研細的云芝糖肽待測樣品用三氟乙酸酸解；酸解的待測樣品反復經(jīng)過蒸干、乙醇溶解、再蒸干三個步驟，直至無三氟乙酸酸性氣味產(chǎn)生為止；在蒸干的樣品中加入蒸餾水溶解，再加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加熱，樣品與NaOH和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的加入比例為Ig O.1-0. 15mol 0. 1-0. 2mol ;冷卻后在混合液中加入HCl溶液中和，HCl與所述NaOH的摩爾比為1:1;烘干、萃取、取水相過濾，即得供試品溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，其特征在于所述三氟乙酸的濃度為2-4mol/L，酸解時間為2-6小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，其特征在于所述萃取液通過濾膜過濾，濾膜的孔徑為O. 22-0. 45 μ m。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，其特征在于所述加熱溫度為65°C _75°C，所述烘干溫度為65°C —75V。
全文摘要
本發(fā)明屬于多糖組分分析領(lǐng)域，具體涉及一種云芝糖肽中單糖組分的檢測方法，進行HPLC色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗，然后分別吸取混合對照品溶液和供試品溶液注入HPLC色譜儀中分析得到色譜圖；所述對照品溶液為D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-鹽酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖對照品的1苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物溶液；所述供試品溶液為云芝糖肽酸水解產(chǎn)物的1苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液，通過檢測供試品中8種單糖組分的摩爾比來有效區(qū)分云芝糖肽、云芝胞內(nèi)糖肽、云芝胞外糖肽和云芝多糖等多糖肽類產(chǎn)品，從而確保云芝糖肽的質(zhì)量和療效。
文檔編號G01N30/06GK103018352SQ20121037690
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者袁萍, 茅仁剛, 葉曉平, 陳浙江, 林東昊, 金丹鳳, 呂丹 申請人:上海師范大學, 上海新康制藥廠