專利名稱：一種高效價(jià)、高特異性抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高效價(jià)、高特異性抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人神經(jīng)巢蛋白簡(jiǎn)稱Nestin，是一個(gè)中等纖維骨架蛋白，屬于第VI類中間絲蛋白，因其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的瞬時(shí)性表達(dá)而被克隆，一直被作為神經(jīng)干細(xì)胞特異性的標(biāo)志。隨著分子生物學(xué)和基因治療技術(shù)的飛快發(fā)展，采用神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷(SCI)已被公認(rèn)為最新、最有前途的治療方法之一。由于國(guó)內(nèi)外科研機(jī)構(gòu)將主要精力放在神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、移植方面，因此，建立神經(jīng)干細(xì)胞檢測(cè)體系尤為重要?？谷薔estin 單克隆抗體是對(duì)人神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定最特異的方法，完全符合分子免疫學(xué)原理，但是，高效價(jià)、高特異性的抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體目前尚未見到報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效價(jià)、高特異性抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是利用細(xì)胞融合、亞克隆及多例多種組織和細(xì)胞的特異性篩選技術(shù)，獲得高效價(jià)、高特異性抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體，由于此單抗效價(jià)高、特異性好，可直接應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，或制成多種體外診斷試劑盒進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定和神經(jīng)干細(xì)胞移植后的療效評(píng)價(jià)。本發(fā)明所述抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合Nestin的活性。作為優(yōu)選，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。本發(fā)明所述“抗體”應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因子。因而，這個(gè)術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的?？贵w的實(shí)例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和雙鏈抗體(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達(dá)在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本發(fā)明所述單克隆抗體可以是，例如，單價(jià)的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見，EP. A. 184187,GB2188638A或.EP. A. 239400。還可以對(duì)雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。用于本發(fā)明的單克隆抗體也可用雜交瘤方法制得，因?yàn)榫幋a本發(fā)明人源化抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入 合適的表達(dá)載體中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然后本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體。如上所述，本發(fā)明還提供了用于實(shí)施本發(fā)明抗體的試劑、試劑盒或芯片。試劑、試劑盒或芯片至少包括如下一種或多種根據(jù)以上方法制成的抗體，編碼該抗體的核苷酸，或包含該抗體的真核細(xì)胞、原核細(xì)胞和病毒以及任選的緩沖溶液。本發(fā)明還具體公開所述抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體的制備方法，它包括如下工藝步驟(I)動(dòng)物免疫將高純度的人神經(jīng)巢蛋白片段(LASTPIP PTPQAPSPAV) Iml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人神經(jīng)巢蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其抗血清；(2)分離脾細(xì)胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪植96孔培養(yǎng)板，將換液后的Sp2/0細(xì)胞調(diào)整為細(xì)胞懸液，分離免疫的小鼠脾細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液；(3)細(xì)胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞懸液按I :10比例混合，30秒內(nèi)逐漸加入45%PEG (分子量4000)，靜止90秒，使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中滴加培養(yǎng)液，以HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(4)篩選雜交腫瘤細(xì)胞待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第七天時(shí)，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后進(jìn)行抗原特異性免疫組織化學(xué)原位測(cè)定，選高效價(jià)，高特異性的細(xì)胞株再擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)大于I :10000的陽性孔的上清，與體外培養(yǎng)的人胚神經(jīng)干細(xì)胞、多種成人正常組織、腫瘤組織、人胚胎組織及人體外培養(yǎng)細(xì)胞株進(jìn)行免疫組化特異性篩選。(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時(shí)收集，I. 44 (吸光單位)濃度為lmg/ml。本發(fā)明還提供所述的單克隆抗體在制備用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的試劑中的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種試劑、試劑盒或芯片，包含所述的單克隆抗體。本發(fā)明所取得技術(shù)進(jìn)步在于所獲得的抗人神經(jīng)巢單克隆抗體效價(jià)高、特異性非常好，可直接標(biāo)記多種示蹤物，借助目前先進(jìn)的檢測(cè)儀器如流式細(xì)胞儀、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀、磁性分選儀等進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的陽選。本發(fā)明將高純度人神經(jīng)巢蛋白經(jīng)免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合、克隆化培養(yǎng)、以及大量的組織細(xì)胞原位特異性篩選從而獲得高效價(jià)、高特異性的抗人Nesting單克隆抗體,此抗體可直接應(yīng)用于臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)研究。單克隆抗體在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中具有極大的應(yīng)用價(jià)值，是親和層析中重要的配體，是免疫組化中主要的抗體，是免疫檢驗(yàn)中的新型試劑，是生物治療的導(dǎo)向武器。作為神經(jīng)干細(xì)胞的檢測(cè)試劑，抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體可以充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。單克隆抗體的特異性強(qiáng)，可將抗原抗體反應(yīng)的特異性大大提高，減少了可能的交叉反應(yīng)，使試驗(yàn)結(jié)果可信度更大。單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應(yīng)結(jié)果便于質(zhì)量控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種高效價(jià)、高特異性抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在進(jìn)一步闡述本發(fā)明之前，我們有必要認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明并不局限于描述的特定的實(shí)施方案，也就是說，在具體形式上可能存在著變化。還有一點(diǎn)需要提醒的是，由于本發(fā)明的范圍受附加的權(quán)利要求書的限制，因此，本文使用的術(shù)語只是為了描述特定實(shí)施方案的目的，而不是為了限制本發(fā)明的目的。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可以互換使用。這些術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的術(shù)語，具體是指由能特異結(jié)合抗原的一種或多種多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)?？贵w的一種形式構(gòu)成了抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。這種形式是四聚物，它由兩對(duì)完全相同的抗體鏈構(gòu)成，每一對(duì)都有一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈。在每對(duì)抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)聯(lián)合在一起共同負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，而恒定區(qū)則負(fù)責(zé)抗體的效應(yīng)器功能。目前已知的免疫球蛋白多肽包括K和X輕鏈，以及a，Y (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), S，e和ii重鏈或它們的其它類型等價(jià)物。全長(zhǎng)的免疫球蛋白“輕鏈”(大約25kDa或大約214個(gè)氨基酸)包含一個(gè)由NH2-末端上大約110個(gè)氨基酸形成的可變區(qū)，以及一個(gè)COOH-末端上的K或\恒定區(qū)。全長(zhǎng)的免疫球蛋白“重鏈”(大約50kDa或大約446個(gè)氨基酸)，同樣包含一個(gè)可變區(qū)(大約116個(gè)氨基酸)，以及重鏈恒定區(qū)之一，例如Y (大約330個(gè)氨基酸)。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗原特異結(jié)合的抗體片段，包括但不限于Fab，F(xiàn)v, scFv和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包含抗體的抗原結(jié)合部分和非抗體蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)?？贵w可以被標(biāo)記和檢測(cè)，例如，可以通過放射性同位素、能產(chǎn)生可檢測(cè)物的酶、熒光蛋白質(zhì)、生物素等等進(jìn)行標(biāo)記并被檢測(cè)?？贵w還可以結(jié)合于固相載體，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。該術(shù)語還包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能與抗原特異性結(jié)合的抗體片段和單克隆抗體?？贵w還可以以多種形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab’)2，以及雙功能雜合抗體(例如文獻(xiàn)，Lanzavecchia 等，Eur. J. Immunol. , 1987 ; 17，105)以及以單鏈形式(例如，Huston 等,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1988 ;85，5879 和 Bird 等,Science, 1988 ；242, 423,在此引用作為參考)存在。免疫球蛋白的重鏈或輕鏈可變區(qū)由三個(gè)超變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或⑶R)組成，這些超變區(qū)被框架區(qū)(FR)間隔。框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)的范圍已被精石角定義(參見〃Sequences of Proteins of Immunological Interest, 〃E. Kabat等，U. S. Department of Health and Human Services, 1991)。此處所討論的所有抗體氨基酸序列的排序都參照Kabat系統(tǒng)。同一物種不同的輕鏈和重鏈框架區(qū)序列相對(duì)保守?？贵w的框架區(qū)用于定位和校準(zhǔn)CDR。CDR主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。嵌合抗體是其重鏈和輕鏈基因經(jīng)過構(gòu)建的抗體，特別是利用基因工程改造的屬于不同物種的抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因。例如，可以將鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)片段連接到人抗體恒定區(qū)片段如Y I和Y3。例如治療用嵌合抗體是一種嵌合蛋白質(zhì)，它由來源于兔抗體可變區(qū)片段或抗原結(jié)合區(qū)片段和人抗體恒定區(qū)或效應(yīng)區(qū)結(jié)合(如由A. T. C. C.保藏登 記號(hào)CRL 9688的細(xì)胞制備的抗Tac嵌合抗體)，當(dāng)然，嵌合抗體的基因來源也可以使用其它哺乳動(dòng)物物種?？梢岳斫獗景l(fā)明設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的人源化抗體可能會(huì)替代某些保守性氨基酸，這些氨基酸對(duì)抗原結(jié)合或抗體其他功能基本上沒有影響。換而言之，gly和ala ;val、ile和Ieu ；asp和glu ；asn和gin ；ser和thr ；lys和arg ；phe和tyr,以上各組合內(nèi)部的氨基酸可相互取代?？贵w重鏈或輕鏈的“可變區(qū)”是該鏈的N端成熟區(qū)域。所有區(qū)域、CDR和殘基編號(hào)均以序列比對(duì)、按已有的結(jié)構(gòu)知識(shí)為基礎(chǔ)進(jìn)行定義?？蚣軈^(qū)和CDR殘基的鑒定和編號(hào)按 Chothia 和他人所述(Chothia, Structural determinants in the sequences ofimmunoglobulin variable domain. J Mol Biol. 1998 ;278,457)。VH是抗體重鏈的可變區(qū)。VL是抗體輕鏈的可變區(qū)，它可能具有K和\同種型。K-I抗體具有K -I同種型而K-2抗體具有K -2同種型，VA是可變的入輕鏈?！跋鄳?yīng)的氨基酸”，是指當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列比對(duì)時(shí)，位于相同位置(也就是它們彼此對(duì)應(yīng))的氨基酸殘基。抗體序列比對(duì)和編號(hào)的方法在Chothia，見上，Kabat，見上和其他中得到詳盡闡述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知(參見如Kabat 1991Sequences of Proteinsof Immunological Interest, DHHS, Washington, DC),有時(shí)可以在抗體的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸中制造一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)缺口和/或插入1、2、3或4個(gè)殘基或者至多約15個(gè)殘基(特別是在L3和H3⑶R中)，從而完成一次比對(duì)?！翱扇〈恢谩?，指的是抗體的一個(gè)特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不會(huì)使抗體的結(jié)合活性顯著降低。鑒定可取代位置的方法和它們可以被如何取代在下面將進(jìn)行更加詳細(xì)的描述?？扇〈恢靡部梢苑Q為“變異耐受位置”。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例I :本發(fā)明所述單抗的制備本發(fā)明所述高效價(jià)、高特異性抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體的制備，包括如下工藝步驟(I)動(dòng)物免疫將高純度的人神經(jīng)巢蛋白片段(LASTPIP PTPQAPSPAV，自主設(shè)計(jì)合成序列)lml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人神經(jīng)巢蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其抗血清；(2)分離脾細(xì)胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪植96孔培養(yǎng)板，將換液后的Sp2/0細(xì)胞調(diào)整為細(xì)胞懸液，分離免疫的小鼠脾細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液；(3)細(xì)胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞懸液按I :10比例混合，加入PEG使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中滴加培養(yǎng)液，以HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(4)篩選雜交瘤細(xì)胞待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第七天時(shí)，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后進(jìn)行 抗原特異性免疫組織化學(xué)原位測(cè)定，選高效價(jià)，高特異性的細(xì)胞株再擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)大于I :10000的陽性孔的上清，與多種成人正常組織、腫瘤組織、人胚胎組織及人體外培養(yǎng)細(xì)胞株進(jìn)行免疫組化特異性篩選。(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時(shí)收集，I. 44 (吸光單位)濃度為 lmg/mlo步驟(I)將高效價(jià)、高特異性抗人神經(jīng)巢蛋白Iml加等量的完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在9周，每只腹腔注射0. 2ml，間隔2周注射一次；測(cè)定抗血清。步驟(2)進(jìn)行完畢后采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以50mmol/L、pH=9的碳酸鹽緩沖液將步驟(I)中的高純度人神經(jīng)巢蛋白I :500稀釋，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4°C保存?zhèn)溆谩、封閉每孔加入pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液200 U I洗滌、內(nèi)含1%山羊血清；C、加樣每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50li I (1:5000稀釋),每板設(shè)一正常對(duì)照、陽性對(duì)照及空白(磷酸鹽緩沖液)，洗滌；d、加入酶標(biāo)二抗每孔100 U 1，洗滌；e、顯色每孔加入底物100 ill ;f、比色以空白調(diào)零，405nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(0.D)；g、結(jié)果判斷P/N=測(cè)定標(biāo)本0. D均值/陰性血清0. D均值，P/N彡2. I為陽性。
步驟a中的聚乙烯板規(guī)格為200 U I/孔、真空抽干溫度為4°C，洗滌采用0. 05%的Tween-20磷酸鹽緩沖液洗漆3次。步驟b中的工藝參數(shù)為每孔加入pH=7. 4、含1%山羊血清磷酸鹽緩沖液200 iil，溫度為37°C、時(shí)間I小時(shí)，洗滌3次。步驟c中的工藝條件為每孔加入1:5000稀釋后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50 u 1，每板設(shè)一正常對(duì)照、陽性對(duì)照及空白(磷酸鹽緩沖液)，溫度為37°C、時(shí)間為I小時(shí)，洗滌3次。步驟d中的工藝條件加入酶標(biāo)二抗每孔100 iU，溫度為37°C、時(shí)間為I小時(shí)，洗滌3次。步驟e中的工藝條件為室溫、時(shí)間為10分鐘，然后使用終止液終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm處讀取光密度值。 步驟(3)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪植96孔培養(yǎng)板，將換液后15小時(shí)的Sp2/0細(xì)胞調(diào)整為9X 105/ml細(xì)胞懸液，分離免疫的小鼠脾細(xì)胞。步驟(4)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第I分鐘滴加4. 5ml培養(yǎng)液；間隔2分鐘滴加5ml培養(yǎng)液，然后加培養(yǎng)液50ml，以HAT選擇培養(yǎng)基按36%的孔為I個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。步驟(5)中是將細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋10%孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，然后進(jìn)行抗原特異的免疫組織化學(xué)測(cè)定，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。步驟(6)中選用的成人正常組織和人胚胎組織包括主要臟器和神經(jīng)組織，腫瘤組織包括常見和多發(fā)腫瘤組織，與以上各種組織和細(xì)胞的陽性表達(dá)低于5%，與98%以上的從胚胎中分離的神經(jīng)干細(xì)胞呈陽性表達(dá)。步驟(6)中選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將5X IO5雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周后有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時(shí)收集，吸光單位=1. 44時(shí)濃度為lmg/ml。實(shí)施例2 :本發(fā)明所述單抗各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)將實(shí)施例I篩選的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗進(jìn)行序列分析，其重鏈可變區(qū)如下QLQESGGGAVQPGRSLRLSCAASGFTFSTNLMNWVRQAPGKGLEWVIAISTYGYSYKYADAAVKGRFTISRDNSKNTIYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYADEYMLDLWGNGTVTVSSL (如 SEQ ID No. I 所示)其輕鏈可變區(qū)如下DLNISQSPGSISVSIGEDATLSCRASQSISSYIAWYQQKPGQAPRLLIYSASTKVTGVPERFSGSASGTDFTLTITRLQPVDFAAYPCQQTSQFPPTFGYGTKVSIKRS (如 SEQ ID No. 2 所示)。實(shí)施例3 :對(duì)比試驗(yàn)參照現(xiàn)有技術(shù)申請(qǐng)?zhí)枮?00610012998. 2的說明書制備抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體作為對(duì)照組，與本發(fā)明實(shí)施例I制備的抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體進(jìn)行比較，結(jié)果如下。對(duì)實(shí)施例I各個(gè)步驟的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，其各項(xiàng)指標(biāo)如下I、本發(fā)明即所述單抗實(shí)施例I制備的陽性克隆，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)效價(jià)為I :64000 ;對(duì)照組酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)效價(jià)為I :50000 ；2、用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行陽性克隆孔特異性表達(dá)實(shí)驗(yàn)與人神經(jīng)干細(xì)胞呈陽性表達(dá)，與其它組織細(xì)胞呈陰性表達(dá)，具體如下人體外原代培養(yǎng)細(xì)胞
權(quán)利要求
1.抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQID NO. I所示，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合Nestin的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
3.權(quán)利要求I至2任一項(xiàng)所述的單克隆抗體在制備用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的試劑中的用途。
4.一種試劑，包含權(quán)利要求I至2任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
5.一種試劑盒，包含權(quán)利要求I至2任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
6.一種芯片，包含權(quán)利要求I至2任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種高效價(jià)、高特異性抗人神經(jīng)巢蛋白單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明所述高效價(jià)、高特異性的單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述單抗效價(jià)及特異性高。本發(fā)明所述單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應(yīng)結(jié)果便于質(zhì)量控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，可直接應(yīng)用于臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)研究，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中具有極高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102827279SQ20121035498
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者李彬 申請(qǐng)人:李彬