專利名稱：檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物酶活性 的方法，尤其涉及一種檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法。
背景技術(shù)：
纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶，它包括內(nèi)切型葡聚糖酶(EC3. 2. I. 4，也稱Cx酶、CMC酶)、外切型葡聚糖酶(EC3. 2. I. 91，也稱C1、微晶纖維酶)和纖維二糖酶(EC3. 2. I. 21，也稱葡萄糖苷酶)等三種主要組分。普遍認(rèn)為在將天然纖維素降解成葡萄糖的過程中，必須依靠這三種組分的協(xié)同作用才能完成。纖維素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降解成纖維二糖，而纖維二糖酶則進(jìn)一步將纖維二糖水解成葡萄糖。目前應(yīng)用最廣、研究最為深入的纖維素酶生產(chǎn)菌種是里氏木霉(Trichodermareesei)的優(yōu)良突變株。在該菌種的纖維素酶制劑中，內(nèi)切型及外切型_葡聚糖酶活力較高，但不足之處是纖維二糖酶產(chǎn)量很低。在利用纖維素酶制劑水解纖維素的過程中，常常由于纖維二糖酶的活力很低造成纖維二糖的累積，而纖維二糖又會(huì)對(duì)纖維素酶的催化作用形成強(qiáng)烈的反饋抑制。在纖維素酶解過程中提高纖維二糖酶的活力意味著提高纖維素水解效率和葡萄糖產(chǎn)量。因此，采用純化的纖維二糖酶、固定化酶技術(shù)等多種方法被廣泛用于增強(qiáng)反應(yīng)體系中纖維二糖酶的活力，而纖維二糖酶的活性成為衡量這些方法優(yōu)越性的重要指標(biāo)。目前，對(duì)于纖維二糖酶活性的測(cè)定普遍采用的方法中，Barush和Swiain法是以水楊苷為酶反應(yīng)底物，檢測(cè)水解后產(chǎn)生的極微量的葡萄糖，反應(yīng)易受干擾，且檢測(cè)靈敏度不高；熒光法靈敏度高且快速，但是由于實(shí)驗(yàn)過程操作復(fù)雜，且重現(xiàn)性不好，現(xiàn)在應(yīng)用不多；比色法是以對(duì)硝基苯基-β -D-葡萄糖苷(pNPG)為酶底物，檢測(cè)底物水解后釋放出來的對(duì)硝基苯酚，而對(duì)硝基苯酚是一種很難被生物降解的、危害環(huán)境的高毒性有機(jī)物。因此，研究一種靈敏度及精確度高且對(duì)環(huán)境無害的纖維二糖酶活性檢測(cè)方法是亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更加快速、靈敏、精確、且具有對(duì)環(huán)境無害、成本低廉的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其步驟包括將一種可用于檢測(cè)纖維二糖酶活性的納米金探針溶液按照20 I的體積比加入到待測(cè)溶液中，其中每20體積的納米金探針溶液中含有2 4體積的納米金探針濃縮液(所述濃縮液為納米金探針制備時(shí)高速離心后的含納米金探針沉淀的濃縮液)，將檢測(cè)溫度控制在30°C 35°C，檢測(cè)pH值控制在4. O 4. 5，待納米金探針反應(yīng)完全后(一般至少反應(yīng)lOmin)，根據(jù)檢測(cè)后溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化，即可判斷待測(cè)溶液中是否含有纖維二糖酶(定性檢測(cè))(例如，紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定時(shí)，當(dāng)620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值大于O. 2631時(shí)則可認(rèn)為含有纖維二糖酶)；所述納米金探針包括納米金顆粒，所述納米金顆粒上修飾有纖維二糖和6-巰基己-I-醇。上述的檢測(cè)方法中，所述纖維二糖酶活性與納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度呈線性關(guān)系，所述線性回歸方程為A=O. 3642n+0. 6273，其中A優(yōu)選為紫外可見光吸收?qǐng)D譜中620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值(A620/A520)，根據(jù)檢測(cè)得到的吸光度比值A(chǔ)即可得到酶活相關(guān)值n，再根據(jù)表達(dá)式C=L 5 X IOn即可定量測(cè)得待測(cè)溶液中的纖維二糖酶酶活C，C的量綱為U/mL(定量檢測(cè))。在定量檢測(cè)中，所述纖維二糖酶酶活C的檢測(cè)范圍優(yōu)選為 O. 15 U/mL 150 U/mL。上述的檢測(cè)方法中，所述納米金探針的粒徑優(yōu)選為30 nm 80 nm。上述的檢測(cè)方法中，所述納米金探針的Zeta電位優(yōu)選為_30 mV -40 mV。上述本發(fā)明的納米金探針主要是基于納米金顆粒能夠在不破壞生命物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的前提下提供光電檢測(cè)信號(hào)，納米金顆粒的粒徑大小以及顆粒間的相對(duì)距離會(huì)影響其 穩(wěn)定性以及光學(xué)性質(zhì)，從而提供可供檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)。本發(fā)明的納米金探針表面修飾的纖 維二糖使納米金顆粒之間增加了排斥力，從而使得納米金顆粒之間的距離穩(wěn)定而不聚集沉降，具有穩(wěn)定劑的作用；而納米金探針表面修飾的MCH則一端通過硫醇基與納米金顆粒連接，另一端的羥基暴露在外。當(dāng)本發(fā)明的納米金探針未被用于檢測(cè)纖維二糖酶時(shí)，其表面修飾的纖維二糖能保持體系的穩(wěn)定，而當(dāng)納米金探針用于檢測(cè)纖維二糖酶時(shí)，纖維二糖作為纖維二糖酶的底物被分解，這時(shí)MCH暴露在外的羥基之間的吸引力會(huì)促使納米金顆粒之間距離變近、聚集沉降，從而使得納米金探針提供相應(yīng)的可供檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)。上述的檢測(cè)方法中，優(yōu)選的，所述納米金探針主要由以下方法制備得到在配好的纖維二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氫化鈉溶液，充分混勻且反應(yīng)完全后，將得到的反應(yīng)產(chǎn)物低速離心純化以去除沉積顆粒，再于上清液中加入6-巰基己-I-醇進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后高速離心純化，將高速離心后的沉淀(含少量水，即上述的納米金探針濃縮液)重溶于超純水中，得到含有可用于檢測(cè)纖維二糖酶活性的納米金探針的溶液。上述的檢測(cè)方法中，所述氯金酸、硼氫化鈉、纖維二糖的摩爾用量比優(yōu)選為I :(16. 3 18. 4) (I. 2 6)。更優(yōu)選的，所述氯金酸與6-巰基己-I-醇的摩爾用量比為
I (O. 002 O. 004)。上述原料摩爾用量的確定是通過以下各組反復(fù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定的。I.纖維二糖用量的優(yōu)化于20mL不同質(zhì)量濃度的纖維二糖溶液中加入O. 2mL、質(zhì)量濃度為1%的氯金酸溶液，振蕩混勻后加向上述反應(yīng)體系中加入O. 2mL、質(zhì)量濃度為I. 5%的硼氫化鈉溶液充分反應(yīng)O. 5h ;低速離心純化去除沉積顆粒后使用激光粒度分析儀檢測(cè)不同纖維二糖用量對(duì)所制納米金-纖維二糖復(fù)合物粒徑分布以及Zata電位的影響，檢測(cè)結(jié)果如下表I所示。表I :纖維二糖用量對(duì)納米金-纖維二糖復(fù)合物的影響_
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，該方法包括以下步驟將一種可用于檢測(cè)纖維二糖酶活性的納米金探針溶液按照20 I的體積比加入到待測(cè)溶液中，其中每20體積的納米金探針溶液中含有2 4體積的納米金探針濃縮液，將檢測(cè)溫度控制在30°C 35°C，檢測(cè)pH值控制在4. 0 4. 5,待納米金探針反應(yīng)完全后，根據(jù)檢測(cè)后溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化，即可判斷待測(cè)溶液中是否含有纖維二糖酶；所述納米金探針包括納米金顆粒，所述納米金顆粒上修飾有纖維二糖和6-巰基己-I-醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其特征在于所述纖維二糖酶活性與納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度呈線性關(guān)系，所述線性回歸方程為A=O. 3642n+0. 6273，其中A為紫外可見光吸收?qǐng)D譜中620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值，根據(jù)檢測(cè)得到的吸光度比值A(chǔ)即可得到酶活相關(guān)值n，再根據(jù)表達(dá)式C=L 5X IOn即可定量測(cè)得待測(cè)溶液中的纖維二糖酶酶活C，C的量綱為U/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其特征在于所述纖維二糖酶酶活C的檢測(cè)范圍為0. 15 U/mL 150 U/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其特征在于所述納米金探針的粒徑為30 nm 80 nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其特征在于所述納米金探針的Zeta電位為-30 mV -40 mV。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其特征在于，所述納米金探針主要由以下方法制備得到在配好的纖維二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氫化鈉溶液，充分混勻且反應(yīng)完全后，將得到的反應(yīng)產(chǎn)物低速離心純化以去除沉積顆粒，再于上清液中加入6-巰基己-I-醇進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后高速離心純化，將高速離心后的沉淀重溶于超純水中，得到含有可用于檢測(cè)纖維二糖酶活性的納米金探針的溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其特征在于所述氯金酸、硼氫化鈉、纖維二糖的摩爾用量比為I : (16. 3 18. 4) (I. 2 6)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其特征在于所述氯金酸與6-巰基己-I-醇的摩爾用量比為I : (0.002 0.004)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其特征在于所述低速離心時(shí)的轉(zhuǎn)速為1200rpm 1500rpm,所述高速離心時(shí)的轉(zhuǎn)速為12000rpm 15000rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法所述加入6-巰基己-I-醇進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的溫度控制在30°C 37°C，培養(yǎng)時(shí)間為2h 2. 5h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其是將一種可用于檢測(cè)纖維二糖酶活性的納米金探針溶液按照20∶1的體積比加入到待測(cè)溶液中，其中每20體積的納米金探針溶液中含有2～4體積的納米金探針濃縮液，將檢測(cè)溫度控制在30℃～35℃，檢測(cè)pH值控制在4.0～4.5，待納米金探針反應(yīng)完全后，根據(jù)檢測(cè)后溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化，即可判斷待測(cè)溶液中是否含有纖維二糖酶；納米金探針包括納米金顆粒，所述納米金顆粒上修飾有纖維二糖和6-巰基己-1-醇。本發(fā)明的方法具有快速、靈敏、精確、且對(duì)環(huán)境無害、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/55GK102798617SQ201210274918
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者曾光明, 賴萃, 黃丹蓮, 趙美花, 張辰, 危臻, 黃超, 許飄, 李寧杰, 李芳玲 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)