一種熒光探針檢測(cè)酶活性方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光探針檢測(cè)酶活性方法，本發(fā)明應(yīng)用一系列的水溶性共軛聚合物、共軛寡聚物作為熒光探針，使用這種具有高熒光量子產(chǎn)率的聚合物或寡聚物作為熒光探針，并對(duì)酶的底物進(jìn)行單標(biāo)記，在應(yīng)用于檢測(cè)酶活性時(shí)，可以具有高效、靈敏、定量、直接、簡(jiǎn)便、快速、靈敏、普適等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種熒光探針檢測(cè)酶活性方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是涉及一種熒光探針的應(yīng)用，其可用于檢測(cè)酶活性。
【背景技術(shù)】
[0002]酶是產(chǎn)生于生物體內(nèi)活細(xì)胞的一種生物催化劑，能夠高效的催化體內(nèi)各種生物化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)生物體的新陳代謝。酶是細(xì)胞賴以生存的基礎(chǔ)，細(xì)胞新陳代謝包括的化學(xué)反應(yīng)幾乎都是在酶的催化下進(jìn)行。因此對(duì)于酶活性的檢測(cè)在生物技術(shù)，生物化學(xué)以及臨床診斷
等領(lǐng)域有著重要意義。
[0003]目前常見的檢測(cè)酶活性的方法包括分光光度法、HPLC分析、電化學(xué)分析、化學(xué)發(fā)光分析、放射法等。分光光度法是利用酶促反應(yīng)前后底物吸光度的變化求出底物濃度的變化值，從而計(jì)算出酶的活性，但該方法需要依靠紫外檢測(cè)，靈敏度較低，而且酶和底物的消耗大，無法在低濃度下檢測(cè)酶活性；HPLC分析雖然具有定量分析的優(yōu)點(diǎn)，但需要較多的樣品量，且靈敏度偏低；電化學(xué)分析需要偶聯(lián)多步反應(yīng)，甚至需要其它酶的參與，使反應(yīng)體系變得復(fù)雜?；瘜W(xué)發(fā)光分析靈敏度較高，但不易操作，重復(fù)性差，難以準(zhǔn)確地定量檢測(cè)酶活性；放射法具有較高的靈敏度，但需要放射性標(biāo)記的化合物，操作上有一定的危險(xiǎn)性。
[0004]因此，設(shè)計(jì)出一種更為靈敏、有效的酶活性檢測(cè)方法是極為迫切的，而熒光探針作為一種非放射性的標(biāo)記技術(shù)，因其具有較好的安全性和較高的靈敏度，在檢測(cè)酶的活性方面越來越受到人們關(guān)注，該技術(shù)通常是將酶的底物設(shè)計(jì)成雙標(biāo)記分子，即在底物兩端共價(jià)連接兩個(gè)不同的染料分子，兩個(gè)染料分子之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移，酶作用于底物后兩染料分子分開，切斷了轉(zhuǎn)移過程，使熒光光譜發(fā)生變化。但雙標(biāo)記的成本較高，而且大多底物分子難以雙標(biāo)記修飾，酶的活性也可能受到較大影響，所以此方法也不能廣泛地應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種克服上述酶活性檢測(cè)技術(shù)的種種不足，從而應(yīng)用一系列的水溶性共軛聚合物、共軛寡聚物作為熒光探針，使用這種具有高熒光量子產(chǎn)率的聚合物或寡聚物作為熒光探針，并對(duì)酶的底物進(jìn)行單標(biāo)記，高效、靈敏、定量、直接、簡(jiǎn)便、快速、靈敏的熒光探針檢測(cè)酶活性的方法。
[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是:一種熒光探針檢測(cè)酶活性的方法，所述的熒光探針為式I，II或III所示的水溶性共軛聚合物或共軛寡聚物:
【權(quán)利要求】
1.一種熒光探針檢測(cè)酶活性方法，其特征在于:所述的熒光探針為式I，II或III所示的水溶性共軛聚合物或共軛寡聚物:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光探針檢測(cè)酶活性方法，其特征在于:所述的Rl選自下列基團(tuán)中的一種:2_磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光探針檢測(cè)酶活性方法，其特征在于:所述的R2選自下列基團(tuán)中的一種:甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-甲氧基乙基、2-(2-甲氧基乙氧基)_乙基、2- (2- (2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙基、2- (2- (2- (2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)_乙氧基)-乙基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種熒光探針檢測(cè)酶活性方法，其特征在于:為了淬滅式I或II所示的化合物，使用的淬滅劑為: Ar為荷基或苯基時(shí),或B為苯二乙炔基時(shí),使用選自對(duì)甲基紅、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、熒光素、羅丹明、聯(lián)吡啶、葉啉中的一種作為淬滅劑； Ar為噻吩基或B為苯二乙烯基時(shí)，使用選自對(duì)甲基紅、苯醌、蒽醌、吖啶、聯(lián)吡啶、卟啉中的一種作為淬滅劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光探針檢測(cè)酶活性方法，所述的酶活性定量檢測(cè)方法包括如下的步驟: 第一步，對(duì)酶底物進(jìn)行化學(xué)修飾:通過共價(jià)鍵合，在酶底物上連接一個(gè)與熒光探針?biāo)ヅ涞拇銣鐒┗鶊F(tuán)，得到修飾過的酶底物； 第二步，繪制標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線:將修飾過的酶底物與上述的熒光探針反應(yīng)，完全淬滅熒光探針的熒光:分批將第一步得到的修飾過的酶底物加入含有熒光探針的緩沖液中，修飾過的酶底物與熒光探針通過靜電作用在緩沖液中形成靜電復(fù)合物并淬滅熒光，直至熒光探針的熒光淬滅至99%以上，記錄此過程中酶底物濃度[Q]和熒光強(qiáng)度F，以(F0/F-1)為縱坐標(biāo)，[Q]為橫坐標(biāo),繪制Stern-Volmer淬滅曲線，以此作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線，建立了熒光強(qiáng)度與酶底物濃度的定量關(guān)系； 該淬滅曲線是直線的情況下，Stern-Volmer方程為:
FO/F-1 = Kapp[Q] 其中，H)是加入酶底物之前的熒光強(qiáng)度， F是加入酶底物之后的熒光強(qiáng)度， [Q]是混合液中酶底物濃度， Kapp是表觀系數(shù)，為一常數(shù)值； 該淬滅曲線是拋物線的情況下，Stern-Volmer方程為:
(FO/F-1)= A [Q] + B [Q]2 其中，H)是加入酶底物之前的熒光強(qiáng)度， F是加入酶底物之后 的熒光強(qiáng)度， [Q]是混合液中酶底物濃度， A、B為常數(shù)； 第三步，待測(cè)酶的活性分析:將不同濃度的修飾過的酶底物與熒光探針反應(yīng)后，分別加入待測(cè)的酶，熒光信號(hào)隨著酶的加入量逐漸恢復(fù)，進(jìn)行一系列熒光發(fā)射光譜測(cè)定混合液的熒光強(qiáng)度值，然后根據(jù)第二步得到的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線將熒光強(qiáng)度值轉(zhuǎn)換為底物濃度值，并以此底物濃度變化值為縱坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，在同一張圖上繪制不同底物濃度下的濃度變化曲線，斜率即為反應(yīng)初速度； 再以反應(yīng)初速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)Y，酶底物初始濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)X，繪制Lineweaver-Burk曲線,該曲線接近直線,且符合方程: Y = 61.067 + 241.90445 X，通過斜線的橫截距-Ι/Km求出Km，可以計(jì)算出酶促反應(yīng)過程中某時(shí)刻在溶液中的酶底物的濃度，從而計(jì)算酶的活性。
【文檔編號(hào)】C09K11/06GK104034705SQ201310071890
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月6日
【發(fā)明者】王樹, 王勇 申請(qǐng)人:常州欣宏科生物化學(xué)有限公司