專利名稱：一種tmem16a鈣激活氯離子通道抑制劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
I丐激活氯離子通道(Calcium-activated Chloride Channels, CaCCs)由于被細(xì)胞內(nèi)部鈣離子所激活而得名，最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，隨后相繼有報(bào)道表明上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、平滑肌與心肌細(xì)胞中都存在。鈣離子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是真核生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，因此CaCCs執(zhí)行多種功能，包括卵細(xì)胞的受精、跨上皮離子/液體轉(zhuǎn)運(yùn)、心肌細(xì)胞復(fù)極化和動作電位發(fā)生、嗅覺傳導(dǎo)及平滑肌伸縮的調(diào)節(jié)等。
由于技術(shù)的原因，CaCCs的分子基礎(chǔ)問題一直未能解決，導(dǎo)致相關(guān)藥理學(xué)研究進(jìn)程極為緩慢。直到2008年底，有三個研究小組獨(dú)立報(bào)道CaCCs的分子基礎(chǔ)是跨膜蛋白16A(transmembrane 16A,簡稱 TMEM16A)(Schroeder BC 等，Cell, 2008，134:1019-1029;CaputoA 等，Science, 2008，322:590-594; Yang YD 等，Nature, 2008，455:1210-1215)。這一發(fā)現(xiàn)為在特定細(xì)胞和組織中研究CaCCs的生理學(xué)和藥理學(xué)等方面的問題提供了新的研究平臺。最近發(fā)現(xiàn)TMEM16A通道與多種重大疾病密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，TMEM16A離子通道可能是肺囊性纖維化(CF)疾病的藥物靶點(diǎn)，激活TMEM16A通道可起到補(bǔ)償上皮組織上氯離子通道囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，簡稱CFTR)基因突變所致的離子/液體轉(zhuǎn)運(yùn)不平衡(Rock JR等，J. Biol.Chem.，2009，284:14875-14880)。 另外，2012 年，Wang 等(Wang M 等，Circulation,2012，125:697-707)證明TMEM16A是腦血管平滑肌細(xì)胞CaCCs的分子基礎(chǔ)，并且發(fā)現(xiàn)TMEM16A離子通道的活性與血壓呈負(fù)相關(guān)。另一方面，CaCCs的抑制劑被報(bào)道可用于治療哮喘、胃腸動力學(xué)障礙疾病和某些類型的腫瘤等。由此可見，篩選TMEM16A離子通道特異性調(diào)節(jié)劑可為CaCCs相關(guān)疾病的治療提供新的藥物靶點(diǎn)。美國生命科學(xué)技術(shù)公司Invitrogen 的試劑盒Premo 鹵化物傳感器運(yùn)用黃色突光蛋白(Yellow Fluorescence Protein, YFP)的三突變體蛋白質(zhì)YFP-F46L/H148Q/I152L的熒光作為指標(biāo)，篩選CaCCs/TMEM16A離子通道的調(diào)節(jié)劑。運(yùn)用此方法，2010年，Namkung等(Namkung W 等，The FASEB J.，2010，24:4178-4186)應(yīng)用 Premo 鹵化物傳感器試劑盒篩選得到單寧酸(tannic acid)及相關(guān)的沒食子單寧(gallotannin)為TMEM16A/CaCCs的抑制劑。遺憾的是，目前缺乏簡便易行的TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑的篩選方法，導(dǎo)致以TMEM16A/CaCCs為藥物靶點(diǎn)的高血壓、CF病、哮喘、胃腸動力學(xué)障礙和某些類型的腫瘤等疾病中的應(yīng)用研究發(fā)展緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑的篩選方法，通過該篩選方法篩選出的TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑為研究TMEM16A/CaCCs在高血壓、CF病、哮喘、胃腸動力學(xué)障礙疾病和某些類型的腫瘤等疾病中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了一種TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑的篩選方法，使用TMEM16A鈣激活氯離子通道激活劑殼寡糖作為篩選抑制劑的陽性對照物，包括如下步驟(a)將TMEM16A質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞HEK293細(xì)胞；(b)將黃色熒光蛋白YFP三突變體YFP-F46L/H148Q/I152L導(dǎo)入步驟(a)中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TMEM16A鈣激活氯離子通道的HEK293細(xì)胞；(C)將候選藥物與步驟(b)所述導(dǎo)入后的細(xì)胞孵育，再加入含有碘離子的溶液觀察，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度無變化，此時再加入殼寡糖熒光強(qiáng)度仍無變化，則確定候選藥物可能為TMEM16A通道的抑制劑，并采用步驟(d)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證；(d)用電生理學(xué)方法測定候選藥物對步驟(a)中電流的影響，其中若加入候選藥物后電流比對照減小，則確定候選藥物為TMEM16A鈣激活氯離子通道的抑制劑，若電流比對照沒有減小，則確定該候選藥物不是TMEM16A鈣激活氯離子通道的抑制劑。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的步驟(b)中，YFP三突變體YFP-F46L/H148Q/I152L由桿狀病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞。進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(d)中所述的熒光強(qiáng)度由激光顯微鏡檢測，其中激發(fā)光波長為470-540nm，檢測波長為 540_590nm。進(jìn)一步優(yōu)選，所述候選藥物為單寧酸或其他抑制劑分子。采用本發(fā)明所述的篩選方法能夠篩選出TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑，可開發(fā)為治療高血壓、CF病、哮喘、胃腸動力學(xué)障礙疾病和某些類型的腫瘤等疾病的藥物。


圖I :根據(jù)本發(fā)明所述TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑單寧酸對黃色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度無明顯增強(qiáng)作用的趨勢圖。圖2 :根據(jù)本發(fā)明所述TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑單寧酸對于TMEM16A電流有抑制作用的趨勢圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑的篩選方法，使用TMEM16A鈣激活氯離子通道激活劑殼寡糖作為篩選抑制劑的陽性對照物，包括如下步驟(a)將TMEM16A質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞HEK293細(xì)胞；(b)將黃色熒光蛋白YFP三突變體YFP-F46L/H148Q/I152L導(dǎo)入步驟(a)中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TMEM16A鈣激活氯離子通道的HEK293細(xì)胞；(C)將候選藥物與步驟(b)所述導(dǎo)入后的細(xì)胞孵育，再加入含有碘離子的溶液觀察，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度無變化，此時再加入殼寡糖熒光強(qiáng)度仍無變化，則確定候選藥物可能為TMEM16A通道的抑制劑，并采用步驟(d)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證；( d )用電生理學(xué)方法測定候選藥物對步驟(a )中電流的影響，其中若加入候選藥物后電流比對照減小，則確定候選藥物為TMEM16A鈣激活氯離子通道的抑制劑，若電流比對照沒有減小，則確定該候選藥物不是TMEM16A鈣激活氯離子通道的抑制劑。
可用于本發(fā)明篩選方法的細(xì)胞沒有特別限制，代表性的例子包括哺乳動物細(xì)胞，如HEK293細(xì)胞，CHO細(xì)胞或脊椎動物非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)卵母細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明篩選方法的電生理學(xué)測定方法沒有特別限制。代表性的例子包括膜片鉗法(用于哺乳動物細(xì)胞)、或雙電極電壓鉗法(用于非洲爪蟾卵母細(xì)胞)。可用于本發(fā)明篩選方法的熒光強(qiáng)度檢測技術(shù)沒有特別限制。代表性的例子包括激光共聚焦顯微鏡(用于熒光實(shí)時成像)、或多功能酶標(biāo)儀(用于熒光強(qiáng)度實(shí)時記錄)等。黃色熒光蛋白(YFP)是一種來源于綠色熒光蛋白(GFP)的熒光蛋白，可在波長515nm下被激發(fā)發(fā)出黃色熒光。碘離子可以與YFP結(jié)合使熒光淬滅，而突變其兩個位點(diǎn)H148Q和I152L可以使YFP對碘離子的敏感性增強(qiáng)。CaCCs通道不僅是一種氯通道，其對包括碘離子在內(nèi)的大部分陰離子都有通透作用。本藥物篩選試驗(yàn)用病毒感染的方法將外源的YFP基因?qū)際EK293細(xì)胞中，使YFP在胞內(nèi)大量表達(dá)；再將備選藥物與細(xì)胞孵育使其與通道充分作用；最后觀察加入含有碘離子的溶液以后YFP熒光的淬滅程度。用此方法可以使 YFP無明顯淬滅的藥物可以被認(rèn)為是CaCCs通道的抑制劑。殼寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)是由幾丁質(zhì)失水形成的線性均一多糖。COS是天然存在的堿性氨基寡糖，具有水溶性好、安全無毒、易被動物體吸收等優(yōu)點(diǎn)，因此其生物學(xué)活性備受關(guān)注，包括抗菌(Choi BK等，International Journalof Antimicrobial Agents, 2001:18 :553 - 557),抗病毒(Bacon A 等，Infection andImmunity, 2000, 68 :5764 - 5770),抗腫瘤(Xiong C等，Carbohydrate Research, 2009, 344 1975 - 1983)，降低血液中膽固醇(Se-Kwon K, Carbohydr. Polym. ,2005,62 :357 - 368)、免疫調(diào)節(jié)(Okamoto Y 等,Macromol. Biosci. 2003, 3:587-590),并且對哮喘(Chung MJ 等，Int. ImmunopharmacoI. ,2012,12 : 43-459)、糖尿病(Lee HW 等,Biol. Pharm. Bull. , 2003，26:1100-1103)等治療作用，但其作用位點(diǎn)與藥理學(xué)特性尚不不清楚。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I :一、先通過熒光實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行抑制劑的粗篩，具體步驟如下第一天將表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Nl-TMEM16A轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞HEK293中，在共聚焦專用皿中培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染YFP的HEK293細(xì)胞；第二天將轉(zhuǎn)染YFP并培養(yǎng)過夜的HEK293細(xì)胞用D-PBS沖洗3次，最后留下800 μ I D-PBS ;加入單寧酸孵育lOmin，記錄熒光強(qiáng)度為基線熒光強(qiáng)度；用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時記錄熒光強(qiáng)度，如圖I所示，此時加入含有150mM I-的溶液800 μ 1，使I濃度達(dá)到75mM，YFP熒光強(qiáng)度無明顯變化，再加入殼寡糖，這一過程中的熒光強(qiáng)度一直無明顯變化(圖la，lb)，結(jié)果表明單寧酸可能是TMEM16A鈣激活氯通道的抑制劑。二、使用電生理學(xué)測定方法進(jìn)行抑制劑的確定，具體步驟如下將表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Nl-TMEM16A轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞HEK293中。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24-72h之內(nèi)，進(jìn)行電生理學(xué)檢測(利用膜片鉗技術(shù))。具體方法如下HEK293細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM (高糖)培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)(加入100UI/ml的青霉素和100 μ g/ml鏈霉素)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過程用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)脂質(zhì)體進(jìn)行。細(xì)胞于37°C , 5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于實(shí)驗(yàn)。電生理檢測在室溫下進(jìn)行(約22°C)，采用內(nèi)面向外(Inside-Out)記錄模式(EPC-1OAmplifier, HEKA公司，德國)，內(nèi)液和基礎(chǔ)外液的成分為(單位mM):NaC1140，MgCl2 ·6Η20, HEPES10, EGTA5,用 NaOH 調(diào)至 ρΗ7· 4。加入藥物的外液中單寧酸的濃度設(shè)為1，10, 50, 100, 500 μ g/ml,用500nM游離鈣離子測試TMEM16A通道表達(dá)與否，用IOmM EGTA無鈣溶液做陰性對照，并與I μ M游離鈣條件下的電流作比較，如 圖2所示，加入單寧酸后電流比對照減小，則確定單寧酸為ΤΜΕΜ16Α鈣激活氯離子通道的抑制劑。
權(quán)利要求
1.ー種TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑的篩選方法，使用TMEM16A鈣激活氯離子通道激活劑殼寡糖作為篩選抑制劑的陽性對照物，其特征在于，包括如下步驟 Ca)將TMEM16A質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞HEK293細(xì)胞； (b)將黃色熒光蛋白YFP三突變體YFP-F46L/H148Q/I152L導(dǎo)入步驟(a)中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TMEM16A鈣激活氯離子通道的HEK293細(xì)胞； (c)將候選藥物與步驟(b)所述導(dǎo)入后的細(xì)胞孵育，再加入含有碘離子的溶液觀察，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度無變化，此時再加入殼寡糖熒光強(qiáng)度仍無變化，則確定候選藥物可能為TMEM16A通道的抑制劑，并采用步驟(d)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證； (d)用電生理學(xué)方法測定候選藥物對步驟(a)中電流的影響，其中若加入候選藥物后電流比對照減小，則確定候選藥物為TMEM16A鈣激活氯離子通道的抑制劑，若電流比對照沒有減小，則確定該候選藥物不是TMEM16A鈣激活氯離子通道的抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，所述的步驟(b)中，YFP三突變體YFP-F46L/H148Q/I152L由桿狀病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟(d)中所述的熒光強(qiáng)度由激光顯微鏡檢測，其中激發(fā)光波長為470-540nm，檢測波長為540_590nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的篩選方法，其特征在于，所述候選藥物為單寧酸或其他抑制劑分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑的篩選方法,采用本發(fā)明所述的篩選方法能夠篩選出TMEM16A鈣激活氯離子通道抑制劑，可開發(fā)為治療高血壓、CF病、哮喘、胃腸動力學(xué)障礙疾病和某些類型的腫瘤等疾病的藥物。
文檔編號G01N21/64GK102854176SQ20121024536
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者展永, 陳婭斐, 郭鵬, 安海龍, 耿金鵬, 王暉, 袁宏博, 趙小明, 杜昱光 申請人:河北工業(yè)大學(xué)