一種細(xì)菌耐藥性熒光檢測方法及其診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測個(gè)體中細(xì)菌耐藥性的熒光檢測方法及其診斷試劑盒/診斷試劑，其中，它采用僅能被廣譜β內(nèi)酰胺酶降解的熒光底物通過雙熒光信號所測得不同波長下的吸光度差異檢測所述個(gè)體或其生物樣品的細(xì)菌耐藥性。本發(fā)明提供的檢測方法及其所得到檢測試劑盒可以檢測出市售產(chǎn)品所不能檢測的頭孢3、4代耐藥菌，且可達(dá)到105～108個(gè)耐藥菌的檢測值，填補(bǔ)了市場空白，為臨床中抗生素的使用提供了更有效的監(jiān)測方法和使用向?qū)В哂袠O大的實(shí)用價(jià)值。
【專利說明】一種細(xì)菌耐藥性熒光檢測方法及其診斷試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是涉及一種熒光檢測細(xì)菌耐藥性及其診斷試劑盒，更具體地說是涉及一種熒光檢測β內(nèi)酰胺類抗生素治療的細(xì)菌耐藥性及其診斷試劑盒，屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]自從人類在上世紀(jì)20年代首次發(fā)現(xiàn)以青霉素為代表的β_內(nèi)酰胺類抗生素以來，它們已經(jīng)成為治療細(xì)菌感染的一線藥物，挽救了無數(shù)人的生命。同其它類別的抗生素相比，β -內(nèi)酰胺類抗生素具有療效高，毒性低的特性。但是，細(xì)菌也在不斷的進(jìn)化各種抗藥機(jī)制。目前，抗藥性細(xì)菌感染已經(jīng)成為全球性的問題。特別是在中國，印度，已經(jīng)其他一些國家，由于存在著濫用抗生素的現(xiàn)象，出現(xiàn)超級抗藥性細(xì)菌，從而導(dǎo)致無藥可治的可能性是不容忽視的。
[0003]細(xì)菌對抗β -內(nèi)酰胺類抗生素的最主要機(jī)制是通過β -內(nèi)酰胺酶實(shí)現(xiàn)的。它們可以有效的分解內(nèi)酰胺類抗生素。為抵消這些酶的作用，在臨床上可以采取了兩種方法。第一，共同使用β_內(nèi)酰胺類藥物和β_內(nèi)酰胺酶抑制劑。一些處方藥利用這一策略，包括(氨芐青霉素+舒巴克坦)和(阿莫西林+克拉維酸鉀)。第二是開發(fā)不被普通β-內(nèi)酰胺酶降解的藥物，比如許多第三和第四代的廣譜頭孢菌素。然而，抗生素的發(fā)展和抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)是一個(gè)矛和盾的關(guān)系。目前，許多在臨床上檢測到的細(xì)菌已經(jīng)具有了分解第三和第四代的頭孢菌素的能力。這主要是由廣譜內(nèi)酰胺酶所造成的。
[0004]由于細(xì)菌耐藥性的發(fā)展與誤用/濫用抗生素是緊密相關(guān)的，為延長廣譜抗生素的有效使用期，在臨床上治療細(xì)菌感染應(yīng)該盡可能的做到對癥下藥，避免使用無必要的廣譜抗生素。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，快速，靈敏，和準(zhǔn)確診斷細(xì)菌菌株對各種內(nèi)酰胺類藥物的藥敏程度是必須的步驟。
[0005]在西方發(fā)達(dá)國家，抗生素的使用受到嚴(yán)格控制。但在中國，印度，以及發(fā)展中國家，抗生素被大大濫用和誤用，其后果是抗藥性細(xì)菌的不斷出現(xiàn)。2009年在印度出現(xiàn)的新德里金屬內(nèi)酰胺酶，NDM-1，是一個(gè)典型的例子。這個(gè)蛋白質(zhì)酶可以水解目前所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素。換句話說，含有NDM-1的細(xì)菌可以抵御任何β-內(nèi)酰胺類抗生素。同時(shí)，由于全球的交通便利，在一地得到的抗藥性細(xì)菌可以很容易的傳播到世界各地，從而造成大規(guī)模的微生物感染。
[0006]為盡可能的延緩抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)和延長現(xiàn)有抗生素的使用壽命，防止抗生素的濫用和誤用是一個(gè)有力的手段。這要求在臨床治療細(xì)菌感染過程中，能夠盡快確定細(xì)菌對不同抗生素的抗藥和敏感程度，以防止過分使用，或者無效使用抗生素。另外，在治療敗血癥病人時(shí)，由于及早使用正確的抗生素和病人的生存率直接掛鉤，這也需要盡快確定細(xì)菌對不同抗生素的抗藥和敏感程度。
[0007]β -內(nèi)酰胺類抗生素被廣泛應(yīng)用在臨床和畜牧業(yè)中用來治療細(xì)菌感染。特別是第三四代頭孢菌素是一線抗生素藥物。但是，廣譜內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)使得三四代頭孢菌素不再是治療細(xì)菌感染的萬能妙藥。在臨床上迫切需要一種快速的能夠確定細(xì)菌是否對三四代頭孢菌素具有抗藥性的分析方法。利用β-內(nèi)酰胺酶的熒光底物來檢測β-內(nèi)酰胺酶的存在是一個(gè)普遍的分析方法。事實(shí)上，目前許多現(xiàn)有的熒光β-內(nèi)酰胺酶的底物可以做到高靈敏度和實(shí)時(shí)的對β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測。然而，所以這些分子都不具有選擇性，即不可能區(qū)分普通和廣譜β-內(nèi)酰胺酶。
[0008]由于含有普通內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對第三四代廣譜頭孢菌素敏感，而含有廣譜β_內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對第三四代廣譜頭孢菌素具有抗藥性。我們希望能夠有一種快捷的方法來區(qū)分這兩類細(xì)菌，從而可以盡快確定臨床細(xì)菌感染是否可以用第三四代廣譜頭孢菌素來治療。
[0009]目前，國內(nèi)外用來檢測細(xì)菌抗藥性的方法可以分成3大類。
[0010]第一類是基于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，又可以分為液體培養(yǎng)基和固態(tài)培養(yǎng)基的方法。液體培養(yǎng)基方法可以準(zhǔn)確測定一種抗生素的最低抑菌濃度。但是，當(dāng)待測抗生素品種較多時(shí)，此方法工作量大，所以已經(jīng)逐漸被固態(tài)培養(yǎng)基方法所取代。固態(tài)培養(yǎng)基方法又可以分為若干類，主要有紙片擴(kuò)散法，E-test，等等。比如，在紙片擴(kuò)散中，不同的抗生素藥片被放置在固態(tài)培養(yǎng)基表面。當(dāng)細(xì)菌在培養(yǎng)基表面生長時(shí)，如果對某種抗生素敏感，這在此藥片周圍形成一個(gè)清晰的環(huán)狀無菌帶。其大小受細(xì)菌對抗生素的敏感程度所決定。如果細(xì)菌對此抗生素有抗藥性，這不會形成此無菌帶。這類基于微生物培養(yǎng)技術(shù)的方法目前是細(xì)菌抗藥性檢測的主流方法。但是，由于細(xì)菌生長需要時(shí)間，此類方法至少需要48-72小時(shí)。對于生長緩慢的細(xì)菌，比如結(jié)核分支桿菌，需要的時(shí)間更長，因此對于需要盡快知道細(xì)菌抗藥性的情況，例如敗血癥病人的治療，這類方法無法及時(shí)提供選擇抗生素的必要信息。
[0011]第二類方法是基于聚合酶鏈反應(yīng)的基因方法。病人樣品可以用針對β -內(nèi)酰胺酶基因的特定探針進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后來檢測得到抗藥性的基因變異。此類方法快速，靈敏。但是，由于此類方法不是功能性測定，所以只能用來檢測已知的耐藥機(jī)制，而不能確定以往未知的全新抗藥機(jī)理。
[0012]第三類方法是直接測定β -內(nèi)酰胺酶的降解β -內(nèi)酰胺類抗生素的功能。目前有多種內(nèi)酰胺酶的熒光底物可以選擇。這類底物本身沒有熒光，但是，當(dāng)它們被內(nèi)酰胺酶分解后，會有熒光產(chǎn)品出現(xiàn)。通過觀測熒光強(qiáng)度變化，可以確定內(nèi)酰胺酶的存在。但是，現(xiàn)有內(nèi)酰胺酶底物無法區(qū)分普通和廣譜內(nèi)酰胺酶。所以并不能夠起到指導(dǎo)抗生素選擇的作用。
[0013]概括而言，雖然目前的相關(guān)技術(shù)在它們的適用領(lǐng)域中有無可取代的位置，但在特定的應(yīng)用中，特別是在處理治療敗血癥病人的過程中，它們也有著種種局限。所以，一種可以快速區(qū)分普通和廣譜β_內(nèi)酰胺酶的檢驗(yàn)方法是迫切需要的。在國內(nèi)外尚無同類產(chǎn)品。類似產(chǎn)品有日本Kanto Chemical公司生產(chǎn)的Cica-β-test試劑。Cica-β-test試劑也可以用來檢測細(xì)菌是否對三四代頭孢菌素具有抗藥性。但是，由于Cica-β-test試劑檢測依賴于顏色變化(陽性樣品的顏色從黃色變到紅色)，靈敏度至少要比本產(chǎn)品的熒光檢測法低一個(gè)數(shù)量級，同時(shí)也不能直接用于血液檢測。另外一個(gè)類似產(chǎn)品是美國LifeTechnologies公司生產(chǎn)的GeneBLAze試劑。GeneBLAze試劑也是基于突光檢測，但是，此試劑只能用來無差別的檢測所有的β_內(nèi)酰胺酶的存在，而不能特異性的檢測能夠降解三四代頭孢菌的廣譜內(nèi)酰胺酶。此外，GeneBLAze試劑只是一個(gè)研究用產(chǎn)品，用來進(jìn)行一些真核細(xì)胞的光學(xué)顯像實(shí)驗(yàn)，而不是在臨床上用于檢測細(xì)菌抗藥性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是提供了新的廣譜β -內(nèi)酰胺酶檢測試劑盒及其制備方法，即一種新的細(xì)菌耐藥性檢測試劑盒及其制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
[0015]也就是說，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過大量生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)等實(shí)踐研究以及文獻(xiàn)檢索和理論研究，目的之一意在提供一類細(xì)菌耐藥性檢測試劑盒，即提供一類用于檢測細(xì)菌耐藥性的檢測試劑盒，特別是可以進(jìn)行定性與定量的檢測細(xì)菌耐藥性檢測試劑盒。
[0016]本發(fā)明的目的之二是提供一種細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒，其包含特異性識別廣譜β -內(nèi)酰胺酶的熒光底物，
[0017]本發(fā)明的目的之三是一種含有所述的熒光底物的檢測試劑盒或試劑的制備方法。
[0018]本發(fā)明的目的之四是提供一種定量和定性檢測細(xì)菌耐藥性的方法，其中包括使用本發(fā)明所述的試劑盒或試劑。
[0019]本發(fā)明的目的之五是提供所述的試劑盒或試劑在定量或定性檢測細(xì)菌耐藥性中的用途。
[0020](一 )技術(shù)構(gòu)思
[0021]早期的青霉素以及一二代的頭孢菌素能夠被普通β -內(nèi)酰胺酶所分解，所以含有普通內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對它們具有抗藥性。但是，在只有普通內(nèi)酰胺酶存在的情況下，第三和第四代頭孢菌素是穩(wěn)定的。這主要是因?yàn)榈谌偷谒拇^孢菌素的內(nèi)酰胺環(huán)上有一個(gè)特殊的取代基，對普通β -內(nèi)酰胺酶有巨大的位阻作用，所以普通β -內(nèi)酰胺酶不能有效的分解三四代頭孢菌素。換句話說，只含有普通內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對三四代頭孢菌素敏感。然而，廣譜內(nèi)酰胺酶，包括金屬內(nèi)酰胺酶以及由普通內(nèi)酰胺酶突變而來的超廣譜β內(nèi)酰胺酶，不受此取代基的影響，因而可以有效的降解三四代頭孢菌素。
[0022]以往的β -內(nèi)酰胺酶的熒光底物不具有在三四代頭孢菌素上的特殊取代基，所以它們可以同時(shí)被普通和廣譜β -內(nèi)酰胺酶所分解。因此它們可以檢測所有的β -內(nèi)酰胺酶，但是無法區(qū)分這兩類的內(nèi)酰胺酶。
[0023]成功設(shè)計(jì)并合成一種全新的β -內(nèi)酰胺酶的熒光底物。此底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)包含了在三四代頭孢菌素上的特殊取代基。所以，它對普通β_內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，但是可以被廣譜β -內(nèi)酰胺酶所降解，從而產(chǎn)生可以觀察到的熒光信號變化。因此，在臨床上使用時(shí)，可以特定檢測到含有廣譜內(nèi)酰胺酶的抗藥性細(xì)菌。
[0024]根據(jù)此想法和思路，發(fā)明人通過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究與分析和理論探索，已成功得到預(yù)期的研究結(jié)果和應(yīng)用產(chǎn)品細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒。
[0025]( 二)細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒
[0026]本發(fā)明提供了一種檢測個(gè)體中細(xì)菌耐藥性的熒光檢測方法及其診斷試劑盒/診斷試劑，其中，它采用僅能被廣譜β內(nèi)酰胺酶降解的熒光底物通過雙熒光信號所測得不同波長下的吸光度差異檢測所述個(gè)體或其生物樣品的細(xì)菌耐藥性。
[0027]優(yōu)選地，所述的熒光底物包含以下化合物(I)或其對映體、消旋體或非對映異構(gòu)
【權(quán)利要求】
1.一種檢測個(gè)體中細(xì)菌耐藥性的熒光檢測方法，其特征在于:它采用僅能被廣譜β內(nèi)酰胺酶降解的熒光底物通過雙熒光信號所測得不同波長下的吸光度差異檢測所述個(gè)體或其生物樣品的細(xì)菌耐藥性。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測個(gè)體中細(xì)菌耐藥性的熒光檢測方法，其特征在于:所述的熒光底物包含以下化合物(I)或其對映體、消旋體或非對映異構(gòu)體:

3.如權(quán)利要求1所述的檢測個(gè)體中細(xì)菌耐藥性的熒光檢測方法，其特征在于:所述的細(xì)菌耐藥性檢測方法所使用的對照品為等體積的非變性細(xì)胞緩沖溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測個(gè)體中細(xì)菌耐藥性的熒光檢測方法，其特征在于:所述的細(xì)菌耐藥性檢測方法的入射光波長為440nm，雙熒光信號分別為520nm和590nm。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測個(gè)體中細(xì)菌耐藥性的熒光檢測方法，其特征在于:所述的細(xì)菌耐藥性檢測方法是通過檢測所述個(gè)體或其生物樣品的在雙熒光信號下的熒光強(qiáng)度比與對照品的熒光強(qiáng)度比的差值。
6.一種細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒，所述診斷試劑盒內(nèi)設(shè)有:雙蒸餾水、非變性細(xì)胞裂解緩沖液和熒光底物，其特征在于，所述的熒光底物包含如下具體結(jié)構(gòu)的化合物I或其對映體、消旋體或非對映異構(gòu)體:
7.如權(quán)利要求6所述的細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述的非變性細(xì)胞緩沖液包括:ρΗ值為7.5的磷酸鈉緩沖液、氯化鈉、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。
8.如權(quán)利要求6所述的細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述的非變性細(xì)胞緩沖液包括:20毫摩爾/升pH值7.5的磷酸鈉緩沖液、150毫摩爾/升的氯化鈉、1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，其中三者體積比為1:1:1。
【文檔編號】G01N21/64GK103512871SQ201210219597
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月28日
【發(fā)明者】王郁生 申請人:上海百可生物科技有限公司