專利名稱：基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨熒光生物傳感器及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨熒光生物傳感器及其應(yīng)用，屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
為解決FIA受來自樣品，特別是生物樣品較強(qiáng)且變化大的熒光背景，以及散射等因素的干擾問題，極大地促進(jìn)了長壽命、長波長熒光標(biāo)記層析試紙條(如鑭系金屬螯合物、卟啉類化合物)的合成和時(shí)間分辨熒光技術(shù)的發(fā)展，目前非同位素標(biāo)記分析的靈敏度已達(dá)到或超過放射免疫分析方法。磷光分析法是突光分析法的姊妹技術(shù)，相對于突光，它又有其很多獨(dú)特的優(yōu)越性(I)有大的StOkes位移，磷光的波長比熒光的波長長，和激發(fā)光譜離得較遠(yuǎn)，不會和激發(fā)光譜重疊，不僅可減少或消除試樣(特別是生物試樣)本底熒光和入射激發(fā)光的干擾，自吸收現(xiàn)象也有減輕；(2)由于—Stl自旋禁阻，磷光的壽命比熒光長，磷光 的壽命約為10_3 10s，易于實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨測定；(3)選擇性更好。但到目前，磷光免疫分析并未得到應(yīng)有的發(fā)展。究其原因，主要受到磷光發(fā)光材料的限制，尤其是水溶性高、生物相容性好的磷光發(fā)光材料的缺乏，故未開發(fā)ー種既適合于免疫分析，又能顯示磷光檢測優(yōu)勢的磷光技術(shù)。金屬卟啉是自然界中廣泛存在的一類大環(huán)化合物，如血紅素、葉綠素、VB12等，它們在生命體的新陳代謝以及很多基本生物過程中都起著不可忽視的作用。卟啉分子由四個(gè)吡咯環(huán)通過次甲基連結(jié)，形成一四配位卟啉核。卟啉環(huán)非常穩(wěn)定，可與直徑為3. 7埃的金屬發(fā)生配位；它與過渡態(tài)金屬形成的絡(luò)合物尤其穩(wěn)定，比如，Zn-四苯基卩卜啉(ZnTPP),其穩(wěn)定常數(shù)為1029。大部分金屬都與卟啉形成I : I的絡(luò)合物，只有Na、K、Li絡(luò)合物的配合比為2 1，兩個(gè)金屬原子分別位于卟啉環(huán)平面的上方和下方。如圖I所示，描述了卟啉能量躍遷產(chǎn)生磷光的原理。卩卜啉的電子吸收光譜主要有Soret帶(又稱B帶)和Q帶。Soret帶位于400 450nm之間，摩爾吸光系數(shù)高(2 5X IO5Iiior1. L. cnT1)。而金屬卩卜啉的Soret帶吸收較弱，當(dāng)環(huán)側(cè)有親電子基團(tuán)時(shí)，Soret帶將向長波方向移動。卟啉的Q帶一般在450 650nm之間，有四個(gè)相關(guān)峰；當(dāng)吡咯環(huán)氮上的氫被金屬離子取代形成金屬卟啉后，四個(gè)相關(guān)峰減弱或消失。卟啉和金屬卟啉由于具有18電子大π離域結(jié)構(gòu)，所以，以其B帶或Q帶作為激發(fā)波長，均在600 700nm間(或更長的波長范圍)有不同程度的熒光發(fā)射；一般情況下，金屬卟啉的熒光強(qiáng)度要弱于卟啉。室溫下，P卜啉本身不發(fā)磷光，當(dāng)與某些金屬形成絡(luò)合物并與有序介質(zhì)(如表面活性剤、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子)共存時(shí)才在近紅外區(qū)發(fā)射磷光；但只有極少數(shù)的金屬卟啉發(fā)磷光，最常見的為鈀卟啉和鉬卟啉。鈀/鉬卟啉具有極強(qiáng)的磷光，其特點(diǎn)是長壽命(ms)，長波長￠00 IOOOnm)。最常見的有水溶性meso-四(4-磺酸苯基)卟啉(H2TSPP4-)和meso-四(4-N-三甲氨基苯基)卟啉(H2TMAP4+)的鈀/鉬絡(luò)合物，以及非水溶性的八こ基卟啉(OEP)和四苯基-四苯并卟啉(Ph4TBP)的鈀/鉬絡(luò)合物等。600 IOOOnm的近紅外區(qū)是研究生物物質(zhì)發(fā)光探針和光化學(xué)傳感器的一個(gè)極為有用的區(qū)域。所以，具有特殊磷光特性的鈀/鉬卟啉便成為生物分析方面非常有效的探針分子，結(jié)合一些簡單的檢測儀器便可提供很高的靈敏度和選擇性。如附圖4所示，在外界激發(fā)下，鉬卟啉在650nm發(fā)出強(qiáng)磷光，持續(xù)時(shí)間100微秒(吸收波范圍390-410nm)，鈀卟啉在670nm發(fā)出強(qiáng)磷光持續(xù)時(shí)間500微秒(吸收波范圍400-420nm)。這些卟啉粒子也有很大的Stokes位移(均為280nm)。與其它發(fā)光材料相比較，鉬/鈀卟啉的優(yōu)勢在于極微的光漂白，使用便宜的強(qiáng)光源，如發(fā)光二極管就能有效激發(fā)。此外，生物樣本和硝酸纖維素膜的背景熒光在390-420nm激發(fā)比在以銪離子為代表的時(shí)間分辨熒光的激發(fā)光波長365nm時(shí)都低。盡管390_420nm光透過硝酸纖維素膜也不盡理想，但優(yōu)于365nm光，更適合于透射式測量。鉬卟啉還可共價(jià)標(biāo)記抗體，為檢測各種樣本提供了一個(gè)靈敏的快速檢測技木。目前，免疫層析技術(shù)中所使用的標(biāo)記物通常是酶、膠體金以及各種彩色微球標(biāo)記物，這些標(biāo)記物應(yīng)用于免疫層析技術(shù)中有相同的特點(diǎn)物理吸附方式標(biāo)記和通過顏色判斷檢測結(jié)果。其中物理吸附方式標(biāo)記(即疏水性和靜電吸附原理)的特點(diǎn)使得其容易形成非特異性干擾，需要在生產(chǎn)エ藝配方中添加非特異性干擾消除層析試紙條，如吐溫20等表面 活性劑等，但使用這類層析試紙條的同時(shí)，也容易造成基于這類標(biāo)記物的假陽性或假陰性的結(jié)果。另外通過顏色判讀結(jié)果在使用時(shí)必然受觀察者主觀影響大，尤其是弱陽性結(jié)果，且只能做出定性判斷，而無法實(shí)現(xiàn)精確的定量判定。這些缺點(diǎn)大大限制了免疫層析技術(shù)在臨床檢測中的應(yīng)用。公開號為CN102087293A
公開日為2011年6月8日，名稱為“ー種全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條及其制備方法”和公開號為CN10208721
公開日為2011年6月8日、名稱為“熒光定量檢測儀”的專利申請均公開了基于熒光乳膠標(biāo)記的層析法檢測方法，其熒光激發(fā)波長為470nm，發(fā)射波長為530nm。但這類傳統(tǒng)有機(jī)熒光材料沒有解決其固有的光漂白問題；同時(shí)，生物樣品自身熒光的干擾及有機(jī)熒光分子的光不穩(wěn)定性等也降低了待測物的熒光信號，必將導(dǎo)致檢測靈敏度偏低，檢測線性范圍窄，難以滿足臨床檢測的需求。公開號為CN102192983A
公開日為2011年9月21日、名稱為“時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用”的專利申請則公開了其采用填充了鑭系稀土元素及其螯合物的時(shí)間分辨熒光微球作為標(biāo)記探針。但對現(xiàn)有稀土熒光生物標(biāo)記探針來說，ー個(gè)主要的缺點(diǎn)是幾乎所有的鑭系稀土熒光探針都需采用紫外光激發(fā)。到目前為止，已知的幾種可見光激發(fā)鑭系稀土元素配合物由于存在著水溶性差、極性配位溶劑中不穩(wěn)定、熒光量子產(chǎn)率低或缺乏活性標(biāo)記基團(tuán)等問題而無法直接用于生物標(biāo)記。這在很大程度上限制了這類探針在活體生物樣品測定中的應(yīng)用。中國專利號為ZL200410034104. O、名稱為“基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙條”和中國專利號為ZL200410034105. 5、名稱為“上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器”的專利均公開了ー種免疫層析試紙條及檢測方法。其常用的上轉(zhuǎn)換熒光材料主要以氟化物和氧化物為基質(zhì)，摻雜Yb和Er等稀土元素。上轉(zhuǎn)換納米熒光材料的激發(fā)光為紅外光，在此激發(fā)波長下生物樣品具有極低的背景熒光，而檢測波長在可見區(qū)，不存在復(fù)雜基質(zhì)樣品背景熒光干擾測定的問題。上轉(zhuǎn)換納米熒光材料的光學(xué)穩(wěn)定性好，沒有光漂白和褪色現(xiàn)象。目前阻礙上轉(zhuǎn)換納米熒光材料在生化分析中應(yīng)用的主要問題是其較低的量子產(chǎn)率和大的粒徑，一般很難得到粒徑小于50nm的強(qiáng)突光性上轉(zhuǎn)換突光材料。
公開號為CN1811449
公開日為2006年8月2日、名稱為“量子點(diǎn)標(biāo)記快速免疫層析試紙條的檢測方法”和公開號為CN101893623A
公開日為2010年11月24日、名稱為“超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測方法”的專利申請均公開了基于量子點(diǎn)技術(shù)的免疫層析試紙。量子點(diǎn)納米顆粒能夠在光激發(fā)下發(fā)出熒光，作為ー種新型的無機(jī)熒光納米材料已被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，在生物醫(yī)學(xué)研究中顯示了很好的應(yīng)用價(jià)值，使其成為生物傳感和成像測定中重要的熒光探針。但作為熒光標(biāo)記物使用時(shí)量子點(diǎn)仍然存在著ー些問題，如溶液中存在的聚集問題、生物標(biāo)記后的穩(wěn)定性問題、閃爍性熒光發(fā)光問題、復(fù)雜生物樣品的背景熒光干擾問題、潛在的細(xì)胞毒性和對細(xì)胞生理過程的干擾問題等?；诹坠獍l(fā)光技術(shù)的免疫檢測技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是ー種新型的時(shí)間分辨突光技術(shù)，其不僅提高了檢測靈敏度和穩(wěn)定性，并且以其發(fā)光標(biāo)記物的特點(diǎn)可與儀器結(jié)合對目標(biāo)待測物進(jìn)行定量和定性檢測。因此，開發(fā)ー種基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨突光生物傳感器對基于磷光發(fā)光技術(shù)的檢測層析試紙條進(jìn)行結(jié)果判讀，從而最終實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)待測物的快速的定性和定量檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有原子熒光儀器都為非色散型光譜儀，由于非色散光學(xué)系統(tǒng)存在光譜干擾問題，使得有些元素?zé)o法得到準(zhǔn)確的測量結(jié)果的問題，進(jìn)而提供ー種基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨熒光生物傳感器及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨熒光生物傳感器，包括激發(fā)光路模塊、光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊、控制系統(tǒng)模塊、放大整形電路、譯碼接ロ電路和數(shù)據(jù)緩存模塊，所述激發(fā)光路模塊包括主檢測激發(fā)光模塊和輔助光學(xué)掃描模塊；所述光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊包括主檢測光電轉(zhuǎn)換模塊和輔助掃描光電轉(zhuǎn)換模塊；所述主檢測激發(fā)光模塊包括第一激發(fā)光源、第一透鏡、第一濾光片、第二透鏡、分光鏡、第二濾光片、第三透鏡和光柵；所述輔助光學(xué)掃描模塊包括第二激發(fā)光源、第三濾光片、第四透鏡和第五透鏡；所述的控制系統(tǒng)模塊包括主電路、第一電機(jī)、第二電機(jī)、第三電機(jī)、機(jī)械傳動裝置、顯不屏和打印裝置；由第一激發(fā)光源發(fā)出的光經(jīng)第一透鏡、第一濾光片、分光鏡和第二透鏡發(fā)射到層析試紙條的檢測區(qū)中，檢測區(qū)發(fā)出的磷光信號經(jīng)第二濾光片、第三透鏡和光柵射到主檢測光電轉(zhuǎn)換模塊，經(jīng)光電轉(zhuǎn)換輸入到主電路并在顯示屏上顯示或打印裝置進(jìn)行打??；主電路控制第二激發(fā)光源發(fā)射激發(fā)光束，經(jīng)第三濾光片、第四透鏡發(fā)射到層析試紙條的條碼區(qū)，條碼區(qū)反射出激光信號再經(jīng)第五透鏡、輔助掃描光電轉(zhuǎn)換模塊、放大整形電路、譯碼接ロ電路和數(shù)據(jù)緩存模塊輸入到主電路并在顯示屏上顯示或打印裝置進(jìn)行打??；主電路控制激發(fā)光路模塊、光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊、第一電機(jī)、第二電機(jī)、第三電機(jī)和機(jī)械傳動裝置的運(yùn)動?！N基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨突光生物傳感器的應(yīng)用，檢測對象為全血、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、糞便以及前列腺液標(biāo)本中病原體、抗原、抗體、藥物、激素、毒品、抗生素、腫瘤標(biāo)志物目標(biāo)待測物，以及蔬菜、瓜果、肉類等食品及水源中農(nóng)藥、抗生素、添加劑的定性及定量檢測。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用磷光發(fā)光材料即鉬/鈀卟啉作為生物標(biāo)記物，結(jié)果在緑色光照射下以紅外光光信號的形式表現(xiàn)出來，并可進(jìn)行儀器判讀，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)被檢測物的定量檢測。本發(fā)明依據(jù)其待測物發(fā)生免疫反應(yīng)方式的不同，將層析試紙條分為夾心法模式、競爭法模式、間接法模式和捕獲法模式，依據(jù)檢測對象的性質(zhì)不同，可采用不同檢測模式對樣品中的不同待測物進(jìn)行快速、靈敏地定性和定量檢測分析。


圖I為磷光產(chǎn)生原理示意圖；圖2為雙抗體夾心法模式檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖；圖3為競爭法模式檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖；圖4為磷光材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)式示意圖；圖5為基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨突光生物傳感器的不意圖； 圖6為磷光材料的激發(fā)和發(fā)射光譜曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)ー步的詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述實(shí)施例。如圖5所不,本實(shí)施例所涉及的一種基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨突光生物傳感器，包括激發(fā)光路模塊、光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊、控制系統(tǒng)模塊、放大整形電路28、譯碼接ロ電路29和數(shù)據(jù)緩存模塊30，所述激發(fā)光路模塊包括主檢測激發(fā)光模塊I和輔助光學(xué)掃描模塊2 ;所述光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊包括主檢測光電轉(zhuǎn)換模塊3和輔助掃描光電轉(zhuǎn)換模塊4 ;所述主檢測激發(fā)光模塊I包括第一激發(fā)光源14、第一透鏡15、第一濾光片16、第二透鏡17、分光鏡18、第二濾光片19、第三透鏡20和光柵21 ;所述輔助光學(xué)掃描模塊2包括第ニ激發(fā)光源22、第三濾光片23、第四透鏡24和第五透鏡25 ;所述的控制系統(tǒng)模塊包括主電路7、第一電機(jī)8、第二電機(jī)9、第三電機(jī)10、機(jī)械傳動裝置11、顯示屏12和打印裝置13 ;由第一激發(fā)光源14發(fā)出的光經(jīng)第一透鏡15、第一濾光片16、分光鏡18和第二透鏡17發(fā)射到層析試紙條26的檢測區(qū)5中，檢測區(qū)5發(fā)出的磷光信號經(jīng)第二濾光片19、第三透鏡20和光柵21射到主檢測光電轉(zhuǎn)換模塊3，經(jīng)光電轉(zhuǎn)換輸入到主電路7并在顯示屏12上顯示或打印裝置13進(jìn)行打??；主電路7控制第二激發(fā)光源22發(fā)射激發(fā)光束，經(jīng)第三濾光片23、第四透鏡24發(fā)射到層析試紙條26的條碼區(qū)6，條碼區(qū)6反射出激光信號再經(jīng)第五透鏡25、輔助掃描光電轉(zhuǎn)換模塊4、放大整形電路28、譯碼接ロ電路29和數(shù)據(jù)緩存模塊30輸入到主電路7并在顯示屏12上顯示或打印裝置13進(jìn)行打??；主電路7控制激發(fā)光路模塊、光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊、第一電機(jī)8、第二電機(jī)9、第三電機(jī)10和機(jī)械傳動裝置11的運(yùn)動,層析試紙條26設(shè)置在機(jī)械傳動裝置11上。所述磷光發(fā)光為金屬B卜啉系列突光染料發(fā)光，所述金屬口卜啉的激發(fā)光光譜范圍為390-420nm，發(fā)射光波長范圍為600_700nm。所述金屬卟啉為鉬/鈀卟啉化合物。鉬卟啉的激發(fā)光波長為380nm，發(fā)射波長為648nm ;鈕卩卜啉的激發(fā)波長為393nm,發(fā)射波長為667nm。所述顯示屏12為觸摸液晶屏。所述打印裝置13為嵌入式熱敏打印裝置。—種基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨突光生物傳感器的應(yīng)用，檢測對象為全血、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、糞便以及前列腺液標(biāo)本中病原體、抗原、抗體、藥物、激素、毒品、抗生素、腫瘤標(biāo)志物等目標(biāo)待測物，以及蔬菜、瓜果、肉類等食品及水源中農(nóng)藥、抗生素、添加劑等定性及定量檢測。本發(fā)明通過建立待測物標(biāo)準(zhǔn)品與磷光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，存儲在IC卡芯片內(nèi)。每次測定時(shí)，將IC卡插入本發(fā)明的傳感器，通過檢測試紙條檢測線和質(zhì)控線的磷光信號強(qiáng)度值，分析軟件即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測物濃度值并顯示。因原材料及生產(chǎn)エ藝的不可控性的存在，標(biāo)準(zhǔn)曲線也會存在變化，因此每批次試紙條都需要配所必需的IC卡。本發(fā)明對于定量檢測項(xiàng)目，通過建立待測物標(biāo)準(zhǔn)品與磷光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，來實(shí)現(xiàn)定量檢測。對于定性檢測項(xiàng)目，則通過建立待測物臨界值(Cut-off)的方式，來實(shí)現(xiàn)結(jié)果的判定，檢測結(jié)果SCut-off值則為陽性，反之則為陰性結(jié)果。本發(fā)明的傳感器，小巧輕便，便于攜帶，操作界面友好。完成ー個(gè)檢測僅需3分鐘，每個(gè)檢測之間僅隔20秒，一小時(shí)可完成180個(gè)測試。 本發(fā)明提供的傳感器的工作過程，主要包括以下步驟I、將IC卡插入傳感器IC卡插ロ。2、已完成免疫反應(yīng)的檢測層析試紙條插進(jìn)檢測卡槽。3、檢測裝置中的光學(xué)系統(tǒng)啟動，光源將光通過外光路匯聚，先后經(jīng)透鏡、濾光片、分光鏡、透鏡投射至試紙條檢測區(qū)，濾光片濾除除所需特定波長的激發(fā)光以外的雜散光。4、從主檢測激發(fā)光路射出的単一激發(fā)光照射在層析試紙條的檢測區(qū)，檢測區(qū)上的磷光材料在激發(fā)光的作用下，發(fā)射出磷光信號。5、檢測區(qū)發(fā)射出的磷光信號被傳感器的磷光光信號接收轉(zhuǎn)換模塊捕獲，由其來完成光電信號的轉(zhuǎn)換。接收入射光，發(fā)射出光電子并使其倍増，實(shí)現(xiàn)光電子信號的放大，再由固態(tài)檢測器將光電子信號轉(zhuǎn)換成電信號，由電信號讀寫電路將電信號輸出，經(jīng)軟件分析控制系統(tǒng)處理后，通過數(shù)字顯示屏將結(jié)果顯示出來。本發(fā)明的檢測對象為全血、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、糞便以及前列腺液標(biāo)本中病原體、抗原、抗體、藥物、激素、毒品、抗生素、腫瘤標(biāo)志物等目標(biāo)待測物，以及蔬菜、瓜果、肉類等食品及水源中農(nóng)藥、抗生素、添加劑等定性及定量檢測。本發(fā)明中，對于定量檢測項(xiàng)目，通過建立待測物標(biāo)準(zhǔn)品與磷光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，來實(shí)現(xiàn)定量檢測。對于定性檢測項(xiàng)目，則通過建立待測物臨界值(Cut-off)的方式，來實(shí)現(xiàn)結(jié)果的判定，檢測結(jié)果SCut-off值則為陽性，反之則為陰性結(jié)果。本發(fā)明依據(jù)其待測物發(fā)生免疫反應(yīng)方式的不同，將層析試紙條分為夾心法模式、競爭法模式、間接法模式和捕獲法模式，依據(jù)檢測對象的性質(zhì)不同，可采用不同檢測模式對樣品中的不同待測物進(jìn)行快速、靈敏地定性和定量檢測分析。夾心法模式試紙條主要用于檢測樣品中的大分子蛋白，如病原體微生物感染產(chǎn)生的抗原抗體等。對抗原進(jìn)行檢測的方法為雙抗體夾心法，對抗體進(jìn)行檢測的方法為雙抗原夾心法。在雙抗體夾心法試紙條制備過程中，首先將磷光材料標(biāo)記目標(biāo)待測物特異性抗體A(即僅能與目標(biāo)待測物A抗原表位反應(yīng))，并固定在結(jié)合物墊內(nèi)；將待測物特異性抗體B (即僅能與目標(biāo)待測物B抗原表位反應(yīng))固定在分析膜檢測線；將能與特異性抗體A反應(yīng)的ニ抗固定在分析膜的質(zhì)控線。在檢測過程中，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線同時(shí)都產(chǎn)生磷光信號，是為陽性反應(yīng)結(jié)果，說明檢測樣品中含有目標(biāo)待測物；當(dāng)檢測線沒有產(chǎn)生磷光信號而質(zhì)控線產(chǎn)生磷光信號，是為陰性反應(yīng)結(jié)果，說明檢測樣品中不含有目標(biāo)待測物。在夾心法模式中，檢測線磷光信號強(qiáng)度的高低與樣品中目標(biāo)待測物濃度成正比關(guān)系，即目標(biāo)待測物濃度越高，磷光信號強(qiáng)度越高。將上述抗體A與抗體B更換成抗原A和抗原B，即建立雙抗原夾心法試紙條，可對病原體微生物感染產(chǎn)生的抗體進(jìn)行檢測。檢測過程、結(jié)果判斷與雙抗體夾心法檢測抗原相同。競爭法模式試紙條主要用于檢測樣品中的小分子抗原、半抗原。如こ肝病毒e抗體和核心抗體、小分子激素、藥物、毒品以及食品中殘留的農(nóng)藥及抗生素等成分。在競爭法試紙條制備過程中，首先將磷光材料標(biāo)記目標(biāo)待測物特異性抗體A(即僅能與目標(biāo)待測物A抗原表位反應(yīng))，并固定在結(jié)合物墊內(nèi)；然后將目標(biāo)待測物抗原(含有抗體A特異性反應(yīng)抗原表位A)固定在分析膜檢測線；將能與特異性抗體A反應(yīng)的ニ抗固定在分析膜的質(zhì)控線。當(dāng)樣品中目標(biāo)待測物濃度高時(shí)，檢測線不產(chǎn)生磷光信號而質(zhì)控線產(chǎn)生磷光信號，是為陽性 反應(yīng)結(jié)果，說明檢測樣品中含有超過一定濃度的目標(biāo)待測物；當(dāng)檢測線和質(zhì)控線都產(chǎn)生磷光信號，是為陰性反應(yīng)結(jié)果，說明檢測樣品中目標(biāo)待測物低于一定濃度甚至濃度為零。在競爭法模式中，檢測線磷光信號強(qiáng)度的高低與樣品中目標(biāo)待測物濃度成反比關(guān)系，即目標(biāo)待測物濃度越高，磷光信號強(qiáng)度越低。間接法模式試紙條主要用于檢測病原體微生物感染后產(chǎn)生的IgG抗體。在間接法試紙條制備過程中，首先將磷光材料標(biāo)記抗抗體(主要是抗人免疫球蛋白IgG抗體)，并固定在結(jié)合物墊內(nèi)；然后將某種抗原固定于分析膜檢測線JfIgG固定于分析膜質(zhì)控線。在檢測過程中，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線同時(shí)都產(chǎn)生磷光信號，是為陽性反應(yīng)結(jié)果，說明檢測樣品中含有目標(biāo)待測物；當(dāng)檢測線沒有產(chǎn)生磷光信號而質(zhì)控線產(chǎn)生磷光信號，是為陰性反應(yīng)結(jié)果，說明檢測樣品中不含有目標(biāo)待測物。在間接法模式中，檢測線磷光信號強(qiáng)度的高低與樣品中目標(biāo)待測物濃度成正比關(guān)系，即目標(biāo)待測物濃度越高，磷光信號強(qiáng)度越高。間接法的優(yōu)點(diǎn)在于只要變換檢測線抗原就可利用同一磷光標(biāo)記抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。以葡萄球菌蛋白A替代抗人免疫球蛋白IgG抗體，可實(shí)現(xiàn)對多種動物的IgG抗體的檢測。間接法模式一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用間接法直接測定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到分析膜檢測線上，從而影響檢測靈敏度。同時(shí)，類風(fēng)濕因子會干擾IgM的檢測，導(dǎo)致特異性變差。捕獲法模式試紙條主要用于檢測病原體微生物感染后產(chǎn)生的IgM抗體。在捕獲法試紙條制備過程中，首先將磷光材料標(biāo)記某種抗原，并固定在結(jié)合物墊內(nèi)；然后將抗抗體(主要是抗人免疫球蛋白IgM抗體)固定于分析膜檢測線；將能與抗原反應(yīng)的特異性抗體固定于分析膜質(zhì)控線。在檢測過程中，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線同時(shí)都產(chǎn)生磷光信號，是為陽性反應(yīng)結(jié)果，說明檢測樣品中含有目標(biāo)待測物；當(dāng)檢測線沒有產(chǎn)生磷光信號而質(zhì)控線產(chǎn)生磷光信號，是為陰性反應(yīng)結(jié)果，說明檢測樣品中不含有目標(biāo)待測物。在捕獲法模式中，檢測線磷光信號強(qiáng)度的高低與樣品中目標(biāo)待測物濃度成正比關(guān)系，即目標(biāo)待測物濃度越高，磷光信號強(qiáng)度越高。本發(fā)明提供的磷光標(biāo)記的生物活性分子，包括抗原、抗體、抗抗體、葡萄球菌蛋白A、受體配體、藥物、細(xì)胞等。
本發(fā)明使用的磷光發(fā)光材料為鉬/鈀卟啉化合物，結(jié)構(gòu)式見附圖4，R1-R8修飾基團(tuán)中任何一個(gè)或幾個(gè)基團(tuán)，可以是氨基(-NH2)、羧基(-C00H)、巰基(-SH)、異硫氰基(-NCS)等，用來標(biāo)記抗原、抗體等生物活性分子，以異硫氰基(-NCS)為首選。。實(shí)施例I :定量檢測雙抗體夾心法模式檢測こ型肝炎病毒表面抗原HBsAgI、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制首先，將提純的HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品用I : 10稀釋的正常人血清(采用pH7. 20. 02M PB緩沖液稀釋)作為稀釋液配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份樣品。其次,姆個(gè)樣品分別用10個(gè)HBsAg試紙條檢測10次，10次檢測儀器判讀的樣品檢測T值和對照C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出每個(gè)濃度對應(yīng)的τ/c結(jié)果，列于下表。(表I) 濃度(ng/ml) |" O10|" 2550「100200
T 平均值 "0.227210.974447.395879.4031784. 198 3770.301
C 平均值 "13. 83312. 98313. 76613. 26412. 87313. 037
Τ/C" 0.0216.2532.566.30138.61289.2以Τ/C值作為X坐標(biāo)，以HBsAg濃度作為Y坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y = O. 6923Χ+1. 5243，擬合系數(shù)的平方為R2 = O. 9991。如圖2所
/Jn ο2、實(shí)際檢測結(jié)果對實(shí)施例I的試紙條進(jìn)行性能方面的測定，最低檢測限為O. Olng/mL·同時(shí)對臨床樣品進(jìn)行檢測。將58例收集自醫(yī)院的HBsAg臨床樣品(其中陽性37份，陰性21份)同時(shí)用膠體金免疫層析試紙與本系統(tǒng)進(jìn)行雙盲法檢測膠體金免疫層析試紙法——31份陽性，27份陰性(即6份陽性漏檢)；鉬卟啉試紙與儀器法——37份陽性，21份陰性，與實(shí)際結(jié)果完全吻合。同時(shí)，與膠體金免疫層析試紙的定性檢測相比，鉬卟啉試紙與儀器法給出了每份樣品的最終準(zhǔn)確濃度。將此58例收集自醫(yī)院的HBsAg臨床樣品，同時(shí)與美國羅氏(Roche)公司HBsAg電化學(xué)發(fā)光法層析試紙條檢測進(jìn)行相關(guān)性分析，以電化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果作為X坐標(biāo)，鉬卟啉試紙與儀器法結(jié)果作為Y坐標(biāo)繪制相關(guān)性分析曲線，表達(dá)式為Y = O. 9993X-2. 6157，相關(guān)性系數(shù)為r = O. 9988。按照統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，r > 95%, P < O. 01，具有正相關(guān)關(guān)系。在批內(nèi)精密度方面，利用實(shí)施例I的試紙條，對含量分別為高值、中值和低值的樣品，連續(xù)進(jìn)行至少10次檢測，計(jì)算變異系數(shù)(CV)。對于HBsAg含量高值(100ng/ml)、中值(40ng/ml)、低值(5ng/ml)樣品各一份分別測定10次，根據(jù)其測定的數(shù)據(jù)，采用SPSS統(tǒng)計(jì)方法分析，以測定結(jié)果均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，高值98. 3±3. 6ng/ml, CV2. 9 % ;中值39. 6±1· 8ng/ml，CV5. 6% ;低值 4. 7±0. 6ng/ml, CV7. 9% ;檢測結(jié)果 CV 值均小于 15%。在批間精密度方面，利用實(shí)施例I的試紙條，對ー份HBsAg臨床陽性樣品用PH7. 20. 02M PB緩沖液稀釋10倍，連續(xù)進(jìn)行至少10次檢測，結(jié)果列于下表。計(jì)算該份樣品重復(fù)檢測的變異系數(shù)(CV)為4. 73%。(表2)
權(quán)利要求
1.一種基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨熒光生物傳感器，其特征在于，包括激發(fā)光路模塊、光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊、控制系統(tǒng)模塊、放大整形電路、譯碼接ロ電路和數(shù)據(jù)緩存模塊，所述激發(fā)光路模塊包括主檢測激發(fā)光模塊和輔助光學(xué)掃描模塊；所述光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊包括主檢測光電轉(zhuǎn)換模塊和輔助掃描光電轉(zhuǎn)換模塊；所述主檢測激發(fā)光模塊包括第ー激發(fā)光源、第一透鏡、第一濾光片、第二透鏡、分光鏡、第二濾光片、第三透鏡和光柵；所述輔助光學(xué)掃描模塊包括第二激發(fā)光源、第三濾光片、第四透鏡和第五透鏡；所述的控制系統(tǒng)模塊包括主電路、第一電機(jī)、第二電機(jī)、第三電機(jī)、機(jī)械傳動裝置、顯示屏和打印裝置；由第ー激發(fā)光源發(fā)出的光經(jīng)第一透鏡、第一濾光片、分光鏡和第二透鏡發(fā)射到層析試紙條的檢測區(qū)中，檢測區(qū)發(fā)出的磷光信號經(jīng)第二濾光片、第三透鏡和光柵射到主檢測光電轉(zhuǎn)換模塊，經(jīng)光電轉(zhuǎn)換輸入到主電路并在顯示屏上顯示或打印裝置進(jìn)行打?。恢麟娐房刂频诙ぐl(fā)光源發(fā)射激發(fā)光束，經(jīng)第三濾光片、第四透鏡發(fā)射到層析試紙條的條碼區(qū)，條碼區(qū)反射出激光信號再經(jīng)第五透鏡、輔助掃描光電轉(zhuǎn)換模塊、放大整形電路、譯碼接ロ電路和數(shù)據(jù)緩存模塊輸入到主電路并在顯示屏上顯示或打印裝置進(jìn)行打印；主電路控制激發(fā)光路模塊、光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊、第一電機(jī)、第二電機(jī)、第三電機(jī)和機(jī)械傳動裝置的運(yùn)動。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨熒光生物傳感器，其特征在于，所述磷光發(fā)光為金屬卟啉系列熒光染料發(fā)光，所述金屬卟啉的激發(fā)光光譜范圍為390-420nm，發(fā)射光波長范圍為600_700nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨熒光生物傳感器，其特征在于，所述金屬卟啉為鉬/鈀卟啉化合物。鉬卟啉的激發(fā)光波長為380nm，發(fā)射波長為648nm ；鈕ロ卜啉的激發(fā)波長為393nm,發(fā)射波長為667nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨突光生物傳感器，其特征在于，所述顯示屏為觸摸液晶屏。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨突光生物傳感器，其特征在于，所述打印裝置為嵌入式熱敏打印裝置。
6.—種權(quán)利要求I所述的基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨突光生物傳感器的應(yīng)用，其特征在于,檢測對象為全血、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、糞便以及前列腺液標(biāo)本中病原體、抗原、抗體、藥物、激素、毒品、抗生素、腫瘤標(biāo)志物目標(biāo)待測物，以及蔬菜、瓜果、肉類等食品及水源中農(nóng)藥、抗生素、添加劑的定性及定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于磷光發(fā)光技術(shù)的時(shí)間分辨熒光生物傳感器及其應(yīng)用，包括激發(fā)光路模塊、光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊、控制系統(tǒng)模塊、放大整形電路、譯碼接口電路和數(shù)據(jù)緩存模塊，所述激發(fā)光路模塊包括主檢測激發(fā)光模塊和輔助光學(xué)掃描模塊；所述光電信號接收轉(zhuǎn)換模塊包括主檢測光電轉(zhuǎn)換模塊和輔助掃描光電轉(zhuǎn)換模塊。本發(fā)明采用磷光發(fā)光材料即鉑/鈀卟啉作為生物標(biāo)記物，結(jié)果在綠色光照射下以紅外光光信號的形式表現(xiàn)出來，并可進(jìn)行儀器判讀，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)被檢測物的定量檢測。本發(fā)明依據(jù)其待測物發(fā)生免疫反應(yīng)方式的不同，將層析試紙條分為夾心法模式、競爭法模式、間接法模式和捕獲法模式對樣品中的不同待測物進(jìn)行快速、靈敏地定性和定量檢測分析。
文檔編號G01N21/64GK102866135SQ20121021587
公開日2013年1月9日 申請日期2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月27日
發(fā)明者謝愛武 申請人:深圳市艾瑞生物科技有限公司