專利名稱：一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法
一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法本發(fā)明提供一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，屬于構(gòu)建免疫傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫傳感器的關(guān)鍵是敏感界面的構(gòu)建，因為其直接影響生物分子的固定化、傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性等主要性能。生物分子的固定化可以分為生物分子的固定化材料和生物分子的固定化技術(shù)，固定化材料和固定化技術(shù)既要保持生物活性單元的固有特性和生物活性，又要避免生物自由活性單元應(yīng)用上的缺陷，因此它們是生物傳感器制備過程中的關(guān)鍵性因素。生物分子的固定化材料主要包括有機導(dǎo)電聚合物、溶膠一凝膠、生物材料及表面活性劑、納米材料等，但是單獨使用目中材料往往不能滿足所構(gòu)建的免疫傳感器的高穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性等主要性能。因此，制備穩(wěn)定的、與生物分子高結(jié)合度的和可保持生物分子活性的三維納米復(fù)合膜和其他材料組合構(gòu)建的免疫傳感器敏感界面，以制備高穩(wěn)定性、高靈敏度和選擇性好的免疫傳感器成為免疫傳感器技術(shù)發(fā)展的主要方向。目前關(guān)于免疫傳感器敏感界面的制備方法有多種，進而固定化方法多種多樣，常用的免疫蛋白分子的固載方法主要有吸附法、包埋法、共價鍵合法、定向固定法和層層自組裝法。但是這些方法中都存在一定的缺陷，如基于高分子膜、無機多孔材料、聚電解質(zhì)等作為固載的吸附法，存在容易脫落，對溶液PH值、溫度、離子強度和換能器表面狀況較為敏感等缺點；直接將免疫分子與高分子溶劑，如聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酷、醋酸纖維、Nafion等合成的高聚物及海藻酸、明膠、殼聚糖等天然的溶膠狀高聚物，混合得到包覆了免疫分子復(fù)合膜的包埋法實驗條件溫和，操作較簡單，但是對被測免疫蛋白與包埋蛋白的免疫結(jié)合增加了空間位阻，同時也不利于底物與產(chǎn)物的擴散；通過自發(fā)的化學(xué)吸附作用或鍵合作用的層層自組裝方法在傳感器界面形成二維有序單層膜操作簡便，具有良好的穩(wěn)定性、有序性，但對自組裝分子結(jié)構(gòu)有限制，且容易受到雜質(zhì)吸附、分子聚合、溶劑選擇、基片表面物理性質(zhì)的影響。上述方法的缺陷都會對制備的免疫傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性、選擇性和使用壽命造成影響。發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷，可構(gòu)建出高靈敏度、高選擇性、低成本和長壽命的免疫傳感器的敏感界面的制備方法。其技術(shù)方案為一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于免疫傳感器的敏感界面組成為納米金晶體(DpAu)、由功能化多壁碳、普魯士藍、殼聚糖制作的三維納米復(fù)合膜、蛋白A和BSA。所述的一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于納米金晶體(DpAu)其濃度為1%，蛋白A濃度為2mg/mL，BSA的濃度為I %。 所述的一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于三維納米復(fù)合膜的組成功能化多壁碳(MWNTs) O. 769g/mL、酰基化殼聚糖(CTS) I mg/mL、普魯士藍溶液。其制備原理為本發(fā)明制備的免疫傳感器敏感界面可以兼顧保持免疫傳感器表面固定的單克隆抗體蛋白的生物物質(zhì)活性與固載后的穩(wěn)定性和耐用性。本發(fā)明采用的納米金(DpAu)晶體具有擴大電極比表面積和增大三維復(fù)合膜固定量的功能同時能提供和自然相似的微環(huán)境并保持固定分子的生物活性使得修飾電極表面能吸附大量抗體并很好地保持其生物活性。功能化多壁碳納米管(MWNTs)具有極高的化學(xué)穩(wěn)定性、良好的傳遞電子性能以及催化活性的表面，被用于免疫傳感器敏感界面的制作。殼聚糖(CTS)屬多糖類，它具有優(yōu)異的成膜性、吸附性、透氣性和滲透性，成膜后具有很好的吸附性、穩(wěn)定性和良好的生物相容性，其豐富的氨基、多孔性結(jié)構(gòu)使它被廣泛用于生物分子的固定和修飾電極的制備。普魯士藍(PB)具有良好的氧化還原活性、高度的化學(xué)穩(wěn)定性和易于制備等優(yōu)點，是制備免疫傳感的理想電極材料，本發(fā)明中把PB引入溶膠-凝膠膜(殼聚糖)來提高PB的穩(wěn)定性。作者將功能化多壁碳、殼聚糖與普魯士藍同時復(fù)合制成三維納米復(fù)合膜，不但增大了傳感器的電流響應(yīng)以增大檢測精度，更獲得了具有大量氨基的共沉積膜，可為蛋白A生物分子提供一個合適的親水性環(huán)境，蛋白A分子可以固定地結(jié)合抗體的Fe端，從而可以將抗體 定向地固定在電極上使與農(nóng)藥特異性結(jié)合端暴露在表面上，最后BSA對非特異性位點的封閉進一步增大檢測精度，以研發(fā)性能優(yōu)異的電化學(xué)生物傳感器。為達到以上目的，采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于⑴多壁碳納米管的功能化稱取IOmg的多壁碳納米管(MWNTs)，放入IOOmL的燒杯中，量取40mL濃HNO3和H2SO4混合液(V: V=I: 3)加入所述燒杯中混合后，超聲4 h、120°C離心回流3 h，水洗至中性，紅外爐干燥，室溫下保存待用；⑵普魯士藍溶液的制備普魯士藍溶液指包含I. O mmol/L FeCl3, 1.0 mmol/L K 3[Fe (CN) 6],
0.I mol/L KCl和0· 025 mol/L的HCl的混合水溶液；⑶殼聚糖溶液的制備稱取O. 5g殼聚糖(CTS)，溶于I. 0%的醋酸溶液，混合液連續(xù)攪拌30min，使殼聚糖完全溶解。為達到以上目的，采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于⑴快速稱取O. Ig氯金酸固體，溶于9. 9g去離子水中，制得1%的氯金酸溶液備用；⑵稱取2 mg蛋白A溶于ImL去離子水中，配制成2mg/mL的蛋白A溶液；⑶稱取Ig BSA，加入99g去離子水，攪拌至完全溶解制成1%的BSA溶液。將全部溶液放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明采用納米金晶體較高的比表面積、穩(wěn)定性和導(dǎo)電性可以增大電極表面電子的轉(zhuǎn)移和生物相容性，進而增大免疫傳感器的響應(yīng)電流；由功能化多壁碳、殼聚糖與普魯士藍復(fù)合制成三維納米復(fù)合膜，與傳統(tǒng)方法相比不但增大了傳感器的電流響應(yīng)以增大檢測精度，更獲得了具有大量氨基的共沉積膜，可為生物分子提供一個合適的親水性環(huán)境。蛋白A分子可以固定地結(jié)合克百威單克隆抗體的Fe端，從而可以將抗體定向地固定在電極上使與農(nóng)藥特異性結(jié)合端暴露在表面上，進一步增大檢測精度。所述三維復(fù)合膜的制備工藝如下(1) MWNT-CTS修飾劑的制備稱取Img預(yù)處理過的功能性MWNTs于O. 3mL無水乙醇中超聲分散，向其中加入ImLl. 0%殼聚糖溶液，再超聲分散8h，最后得到穩(wěn)定的黑色分散液(MWNT-CTS修飾劑)，其中MWNTs濃度為O. 769g/mL ；⑵三維納米復(fù)合膜的制備將配制的MWCNTs-CTS與普魯士藍按體積比I :1混合，超聲混合Ih,所得溶液為功能化多壁碳-殼聚糖溶液-普魯士藍(MWCNTs-CTS-PB)，將其放入冰箱里4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 具體實施方式
實施例快速稱取O. Ig氯金酸固體，溶于9. 9g去離子水中，制得1%的氯金酸溶液，固定在電極上，然后用PH=7. 4的PBS緩沖液沖洗表面，氮氣吹干；取10μ L上述由功能化多壁碳、殼聚糖溶液、普魯士藍溶液制備好的三維納米復(fù)合膜滴涂在固定過納米金晶體的電極表面，常溫下靜置I. 5h，然后用PH=7. 4的PBS緩沖液沖洗表面，氮氣吹干；上述制作好的電極晾干后，取10μ L 2mg/mL的蛋白A溶液滴涂在電極上，常溫下2h，然后用PH=7. 4的PBS緩沖液沖洗表面。將制備好的電極浸入農(nóng)藥抗體中在4°C下浸泡8h，取出用PH=7. 4的PBS緩沖液沖洗掉多余的液體，氮氣吹干；將上述制備好的電極最后浸入1%的BSA溶液中37°C下靜置2h，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點，取出置于室溫下晾干，免疫傳感器的敏感界面制作完成，保存在4°C條件下備用。使用此敏感界面制作的免疫傳感器靈敏度、選擇性較高，其穩(wěn)定性性和再生性良好。

此構(gòu)建方法操作工藝簡單，成本較低，能提高免疫傳感器的靈敏度、選擇性等，符合我國免疫傳感器制備方法發(fā)展和國際化的要求。
權(quán)利要求
1.一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于免疫傳感器的敏感界面組成為納米金晶體(DpAu)、由功能化多壁碳、普魯士藍、殼聚糖制作的三維納米復(fù)合膜、蛋白A和BSA。
2.如權(quán)利要求I所述的一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于納米金晶體(DpAu)其濃度為1%，蛋白A濃度為2mg/mL，BSA的濃度為I %。
3.如權(quán)利要求I所述的一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于三維納米復(fù)合膜的組成功能化多壁碳(MWNTs) O. 769g/mL、?；瘹ぞ厶?CTS) Img/mL、普魯士藍溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測農(nóng)藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建方法，其特征在于敏感界面的組成為納米金晶體(DpAu)1%、三維納米復(fù)合膜(功能化多壁碳-殼聚糖溶液-普魯士藍MWCNTs-CTS-PB)、蛋白A2mg/mL、農(nóng)藥抗體5μg/mL、BSA１%。依次將上述材料固定在免疫傳感器表面后，因為納米金晶體、功能化多壁碳、普魯士藍溶液能增大電子的轉(zhuǎn)移，進而增大免疫傳感器的相應(yīng)，提高傳感器的靈敏度；功能化多壁碳和殼聚糖有良好的成膜性并具有豐富的基團，可以增大與傳感器表面和生物的結(jié)合度進而提高傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性；蛋白A的定向固定農(nóng)藥抗體分子和BSA的封閉作用可以增大傳感器的特異性和穩(wěn)定性，從而可以制備高穩(wěn)定性、高靈敏度、選擇性好、長壽命的免疫傳感器。
文檔編號G01N33/577GK102621321SQ201210088809
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者劉君峰, 孫霞, 李青青, 杜淑媛, 王相友 申請人:山東理工大學(xué)