專利名稱：一種微生物的快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物的檢測，特別涉及一種微生物的快速檢測方法。
背景技術：
微生物檢測是環(huán)境或食品安全評估的重要內容，其中，細菌總數、大腸菌和致病微生物等作為國際公認的衛(wèi)生檢測指標，是判定環(huán)境或食品是否安全的重要科學依據。通過微生物檢測可以正確評價環(huán)境或食品的微生物污染程度，為各項衛(wèi)生管理工作提供科學依據，為相關疾病的針對性防治提供重要的科學指導，以確保人們的身體健康；同時，微生物檢測對提高環(huán)境或食品質量、避免經濟損失、保證出口等方面具有重要的意義。傳統的微生物檢測方法為培養(yǎng)法，采用液體培養(yǎng)或膜過濾后固體培養(yǎng)的細菌擴增模式，在細菌濃度達到較高水平時進行形態(tài)觀察或顯微鏡檢；此類方法需要較長的培養(yǎng)時間，且步驟繁瑣、工作量大，導致耗時較長，往往需要M-72小時甚至更久才能得到檢測結果。目前，酶底物法已成為微生物檢測的重要手段，此方法是利用微生物代謝產生的特異指示酶和相應發(fā)光底物水解反應后產生的光信號變化實現定性分析，再結合MPN計數法實現定量分析，可于18-24小時內獲得檢測結果，然而該方法的檢測速度仍顯滯后，檢測結果也還不夠準確。為解決傳統的酶底物法用時較長的問題，二十世紀初期，研究人員在自動化連續(xù)檢測技術的基礎上，利用酶底物反應信號與微生物濃度的關聯性，結合閾值分析模式，展開了快速定性定量分析的研究。如圖1所示，該方法主要是根據微生物生長曲線(即微生物生長產生的信號與檢測時間的關系曲線)的特點，選擇微生物指數增長期顯著抬升段的酶底物反應的光信號絕對值或信號變化值作為檢測終點閾值的判斷依據，得到微生物的檢測時間，建立微生物濃度與檢測時間的標準模型，如圖2所示；然后結合待測微生物的檢測時間和標準模型可得待測微生物的濃度。該方法的檢測時間由微生物的濃度決定，微生物的濃度越大，檢測時間越短；與傳統的微生物檢測方法相比，可將檢測時間縮短至4-18小時。但是，此方法存在的問題是1、利用微生物生長指數期顯著抬升段作為終點判定特征，IOOmL樣品至少需要4 小時方可得到檢測結果。2、由于樣品中通常存在游離酶或其它化合物引起的背景干擾，使得檢測得到的微生物生長曲線有漂移，而以信號絕對值或變化值判定閾值的方式無法克服漂移干擾，嚴重影響檢測結果的準確性。

發(fā)明內容
為了解決現有技術中的上述不足，本發(fā)明提供了一種快速、準確、適用范圍廣的微生物檢測方法。為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種微生物的快速檢測方法，包括以下步驟
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a、建模步驟將標準微生物加入培養(yǎng)液中，標準微生物在培養(yǎng)液中生長，檢測標準微生物在生長過程中產生的信號，在標準微生物生長延遲期末，當檢測信號下降時，記錄標準微生物的檢測時間；依據標準微生物的濃度和檢測時間，得到微生物的濃度與檢測時間的標準模型；b、檢測步驟將待測微生物加入培養(yǎng)液中，待測微生物在培養(yǎng)液中生長，檢測待測微生物在生長過程中產生的信號，在待測微生物生長延遲期末，當檢測信號下降時，記錄待測微生物的檢測時間；依據所述待測微生物的檢測時間和所述標準模型，得到待測微生物的濃度。進一步，所述標準微生物與所述待測微生物為相同類型的微生物。進一步，所述培養(yǎng)液含有反應物質，所述反應物質與所述微生物的特征指示因子發(fā)生反應，產生信號。優(yōu)選地，所述信號為吸光度、熒光強度、電流量或電導率。進一步，所述標準模型為T = algC+b，其中，C為微生物的濃度，T為微生物的檢測時間，a和b為常數。進一步，在所述步驟a和所述步驟b中，當所述信號下降到閾值時，記錄所述微生物的檢測時間。優(yōu)選地，所述閾值根據經驗值設定。優(yōu)選地，所述閾值根據微生物生長延遲期末信號下降期的信號值或信號變化值設定。優(yōu)選地，當所述微生物的生長曲線的基線水平且所述微生物存在相同的檢測基值時，所述閾值的大小等于所述信號下降期的信號值。優(yōu)選地，當所述微生物的生長曲線的基線水平且所述微生物存在相同或不同的檢測基值時，所述閾值的大小等于所述信號下降期的信號變化值。優(yōu)選地，所述閾值根據微生物生長延遲期末信號下降期內生長曲線的切線的斜率值或斜率變化值設定。優(yōu)選地，當所述微生物的生長曲線的基線水平時，所述閾值的大小等于所述斜率值。優(yōu)選地，所述閾值的范圍為[-100，-0. 01]。優(yōu)選地，當所述微生物的生長曲線的基線水平或漂移時，所述閾值的大小等于所述斜率變化值。優(yōu)選地，所述閾值的范圍為[_5，-1]。進一步，微生物生長延遲期末信號下降期的數據采集頻率> 0. 04次/分鐘。本發(fā)明與現有技術相比具有以下有益效果1、本發(fā)明選擇微生物生長延遲期末的信號下降期為檢測終點的判斷依據，檢測時間縮短2小時以上。2、本發(fā)明以微生物生長曲線的切線的斜率值或斜率變化值作為檢測終點的閾值判定依據，能夠有效克服游離酶、氨基酸等產生的背景干擾，提高定性定量分析的準確性，提高方法的適用性。


圖1為背景技術中微生物的生長曲線；圖2為背景技術中微生物的標準模型；圖3為實施例1中各標樣的生長曲線；圖4為實施例2中各標樣的生長曲線；圖5為實施例3中各標樣的生長曲線；圖6為實施例3中葡萄球菌的標準模型；；圖7為實施例4中糞大腸菌群的標準模型；圖8為實施例4中待測糞大腸菌群的生長曲線。
具體實施例方式實施例1一種微生物的快速檢測方法，用于檢測水樣中的大腸桿菌，包括以下步驟A、設定閾值和建模步驟將4個大腸桿菌標樣(標樣a、標樣b、標樣c和標樣d，其濃度C分別為95. 30cfu, 1. 34 X 103cfu、l. 22 X IO4Cfu和2. 00X 106cfu)分別加入到培養(yǎng)液中，各標樣中的大腸桿菌分別在培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中含有反應底物4-甲基傘形酮-β -D葡萄糖苷酸(MUG)，MUG 分別與各大腸桿菌生長產生的代謝指示物β -D-葡糖醛酸糖苷酶發(fā)生特異性反應，產生熒光信號(激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為450nm)，分別進行檢測，得到各標樣的生長曲線，如圖3所示。在各標樣的生長延遲期末，熒光信號下降(此下降期內的數據采集頻率為0. 1次 /分鐘)，記錄各標樣信號下降期的熒光信號值范圍，分別為5 15imit、0 15imit、5 15unit和5 15imit，共有的熒光信號值范圍為5 15imit，可將閾值設置成該共有范圍內的任一值，此處將閾值設置成6imit ；同樣地，利用其它標準微生物或者待測微生物的生長延遲期末信號下降期的信號值設定閾值時，也使用相同的方法。在各標樣的生長延遲期末，當其熒光信號值分別下降到閾值6imit時，標樣a、標樣b、標樣c和標樣d的檢測時間T分別為42428s、34971s、30857s和18000s ；依據各大腸桿菌標樣的濃度和檢測時間，得到大腸桿菌的檢測時間T與濃度C的標準模型，相應的函數表達式為T = -5573. 31gC+53151，相關系數為0. 9972。B、檢測步驟將含有待測大腸桿菌的水樣加入到培養(yǎng)液中，待測大腸桿菌在培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中含有反應底物MUG，MUG與待測大腸桿菌生長產生的代謝指示物β -D-葡糖醛酸糖苷酶發(fā)生特異性反應，產生熒光信號(激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為450nm)，檢測該熒光信號；在待測大腸桿菌的生長延遲期末，當熒光信號值下降到閾值6imit時，記錄待測大腸桿菌的檢測時間，為2097 ，代入步驟A中的標準模型的函數表達式T = -5573. 31gC+53151， 得到待測大腸桿菌的濃度為5. 93X 105cfu。
本實施例中，根據信號值設定檢測終點閾值的方法適用于生長曲線的基線水平且具有相同檢測基值時微生物的檢測，因為在生長曲線的基線穩(wěn)定且具有相同的檢測基值時，相同或不同濃度的同類微生物的生長延遲期的信號值基本一致；當存在背景值時，相同或不同濃度的同類微生物在不同背景下信號值會發(fā)生變化。實施例2一種微生物的快速檢測方法，用于檢測水樣中的總大腸菌群，包括以下步驟A、設定閾值和建模步驟將4個總大腸菌群標樣(標樣a、標樣b、標樣c和標樣d，其濃度C分別為 95. 30cfu、l. 34X 103cfu、l. 22XlO4Cfu 和 2. 00X 106cfu)分別加入到培養(yǎng)液中，各標樣中的總大腸菌群分別在培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中含有4-甲基傘形酮-β -D半乳糖苷酸 (MUGal)，MUGal分別與各總大腸菌群生長產生的代謝指示物β -D-半乳糖苷酶發(fā)生特異性反應，產生熒光信號(激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為450nm)，分別進行檢測，得到各標樣的生長曲線，如圖4所示。在各標樣的生長延遲期末，熒光信號下降(此下降期內的數據采集頻率為0.04 次/分鐘)，記錄各標樣信號下降期的信號值相對于基值的變化值范圍，分別為- ο Ounit,-15 0unit、-10 Ounit和-10 Ounit，共有的信號變化值范圍為-10 Ounit， 可將閾值設置成此共有范圍內的任一值，此處將閾值設置成_5imit ；同樣地，利用其它標準微生物或者待測微生物的生長延遲期末信號下降期的信號變化值設定閾值時，也使用相同的方法。在各標樣的生長延遲期末，當各標樣信號下降期的信號相對于基值的變化值分別達到閾值_5unit時，標樣a、標樣b、標樣c和標樣d的檢測時間分別T為401Hs、33^8s、 27257s和149Hs ；依據各總大腸菌群標樣的濃度和檢測時間，得到總大腸菌群的檢測時間 T與濃度C的標準模型，相應的函數表達式為T = -5843. 31gC+51562，相關系數為0. 9993。B、檢測步驟將含有待測總大腸菌群的水樣加入到培養(yǎng)液中，待測總大腸菌群在培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中含有反應底物MUGal，MUGal與待測總大腸菌群生長產生的代謝指示物 β -D-半乳糖苷酶發(fā)生特異性反應，產生熒光信號(激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為450nm)， 檢測該熒光信號；在待測總大腸菌群的生長延遲期末，當其信號下降期的信號相對于基值的變化值達到閾值_5imit時，記錄待測總大腸菌群的檢測時間，為30400s，代入步驟A中的標準模型的函數表達式T = -5843. 31gC+51562，得到待測總大腸菌群的濃度為 4. 19X103cfu。本實施例中，根據信號變化值設定檢測終點閾值的方法適用于生長曲線的基線水平且具有相同或不同檢測基值時微生物的檢測，因為在這種情況下，相同或不同濃度的同類微生物的生長延遲期末信號下降期的信號值相對于基值的變化值基本一致；當由背景差異引起基線漂移時，微生物的生長延遲期末信號下降期的信號變化值有一定的隨機性，相同或不同濃度的同類微生物的所述變化值不一定相同。在實施例1和實施2中，選擇微生物生長延遲期末的信號下降期作為檢測終點的判斷依據，與傳統的選擇微生物指數生長期的顯著上升段為檢測終點的判斷依據相比，檢測時間縮短池以上，能夠保證更快地得到檢測結果，更好地實現微生物的實時分析。
實施例3一種微生物的快速檢測方法，用于檢測食物樣品中的葡萄球菌，包括以下步驟A、設定閾值和建模步驟將7個葡萄球菌標樣(標樣1、標樣2、標樣3、標樣4、標樣5、標樣6和標樣7，其濃度 C 分別為 24. 36cfu、198. 48cfu、2001cfu、14506cfu、15742cfu、16668cfu 和 1986045cfu) 分別加入到培養(yǎng)液中，各標樣中的葡萄球菌分別在培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中含有反應底物 Boc-Ie和u-Gly-Arp-p，分別與各標樣中的葡萄球菌生長產生的代謝指示物凝固酶發(fā)生特異性反應，產生有色的對硝基苯胺(nitr0a-niline，PNA)，分別檢測各標樣在405nm波長處的吸光度信號，得到各標樣的生長曲線，如圖5所示。根據各標樣生長延遲期末信號下降期內生長曲線的切線的斜率值設置閾值，所述閾值的大小等于所述斜率值，此處將閾值設定為-0. 01、-30、-70或-100。在各標樣的生長延遲期末，當各標樣生長曲線上的點的切線斜率值分別下降到閾值-0.01時，分別記錄各標樣的檢測時間，并依據各葡萄球菌標樣的濃度和檢測時間，得到葡萄球菌的檢測時間τ與濃度C的標準模型，如圖6所示，相應的函數表達式見表1 ；同樣地，將閾值設置為-30、-70或-100時，采用上述相同方法得到的標準模型見圖6，相應的函數表達式和相關系數見表1，圖6中的標準模型自上而下所對應的閾值依次為-100、-70、-30 和-0. 01。
權利要求
1.一種微生物的快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟a、建模步驟將標準微生物加入培養(yǎng)液中，標準微生物在培養(yǎng)液中生長，檢測標準微生物在生長過程中產生的信號，在標準微生物生長延遲期末，當檢測信號下降時，記錄標準微生物的檢測時間；依據標準微生物的濃度和檢測時間，得到微生物的濃度與檢測時間的標準模型；b、檢測步驟將待測微生物加入培養(yǎng)液中，待測微生物在培養(yǎng)液中生長，檢測待測微生物在生長過程中產生的信號，在待測微生物生長延遲期末，當檢測信號下降時，記錄待測微生物的檢測時間；依據所述待測微生物的檢測時間和所述標準模型，得到待測微生物的濃度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述標準微生物與所述待測微生物為相同類型的微生物。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)液含有反應物質，所述反應物質與所述微生物的特征指示因子發(fā)生反應，產生信號。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述信號為吸光度、熒光強度、電流量或電導率。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述標準模型為T= algC+b，其中，C為微生物的濃度，T為微生物的檢測時間，a和b為常數。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在所述步驟a和所述步驟b中，當所述信號下降到閾值時，記錄所述微生物的檢測時間。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述閾值根據經驗值設定。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述閾值根據微生物生長延遲期末信號下降期的信號值或信號變化值設定。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于當所述微生物的生長曲線的基線水平且所述微生物存在相同的檢測基值時，所述閾值的大小等于所述信號下降期的信號值。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于當所述微生物的生長曲線的基線水平且所述微生物存在相同或不同的檢測基值時，所述閾值的大小等于所述信號下降期的信號變化值。
11.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述閾值根據微生物生長延遲期末信號下降期內生長曲線的切線的斜率值或斜率變化值設定。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于當所述微生物的生長曲線的基線水平時，所述閾值的大小等于所述斜率值。
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，所述閾值的范圍為[-100，-0.01]。
14.根據權利要求11所述的方法，其特征在于當所述微生物的生長曲線的基線水平或漂移時，所述閾值的大小等于所述斜率變化值。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于，所述閾值的范圍為[-5，-1]。
16.根據權利要求1 15任一所述的方法，其特征在于微生物生長延遲期末信號下降期的數據采集頻率> 0. 04次/分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物的快速檢測方法，包括以下步驟a、建模步驟將標準微生物加入培養(yǎng)液中，標準微生物在培養(yǎng)液中生長，檢測標準微生物生長過程中產生的信號，在標準微生物生長延遲期末，當檢測信號下降時，記錄標準微生物的檢測時間；依據標準微生物的濃度和檢測時間，得到微生物的濃度與檢測時間的標準模型；b、檢測步驟將待測微生物加入培養(yǎng)液中，待測微生物在培養(yǎng)液中生長，檢測待測微生物生長過程中產生的信號，在待測微生物生長延遲期末，當檢測信號下降時，記錄待測微生物的檢測時間；依據所述待測微生物的檢測時間和所述標準模型，得到待測微生物的濃度。本發(fā)明具有快速、準確、適用范圍廣等優(yōu)點，能夠有效排除背景干擾。
文檔編號G01N21/64GK102539401SQ201110461608
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權日2011年12月31日
發(fā)明者忻鼎丞, 蘇東霞, 趙鵬 申請人:杭州聚光環(huán)保科技有限公司, 聚光科技(杭州)股份有限公司