專利名稱：生物樣品的光譜成象的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
背景技術(shù)：
為了實驗室研究和生物醫(yī)學目的，深部組織的光學成象被用于探察生物樣本中結(jié)構(gòu)。這包括對例如老鼠、斑馬魚或人這樣的動物的內(nèi)臟和皮下組織的成象，一個目的是不用手術(shù)或其他侵入性方法來了解內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在一種深部組織成象技術(shù)中，與樣本中的特定目標有關(guān)的熒光劑通過用照明光激發(fā)它們，使它們發(fā)出熒光而被成象；熒光發(fā)射被阻擋濾光片從具有不同的波長的照明光分開，然后被利用例如冷卻CCD檢測器的非常靈敏的照相機檢測出來。在其他技術(shù)中，使用制劑修改樣本，制劑使其產(chǎn)生本質(zhì)上會發(fā)熒光的物質(zhì)，最常見的例子是綠色熒光蛋白(GFP)。 其他的技術(shù)涉及使用量子點作為發(fā)光探針。如此處所用的，例如熒光燃料、熒光蛋白象GFP、量子點、表面增強拉曼試劑，以及相關(guān)的化合物或者用于類似目的的其他材料的化合物，都是測量的靶化合物的例子。在這種實驗中產(chǎn)生的信號通常是微弱的。一般，對從深部組織發(fā)出的微弱水平的光線的強力檢測是有益的，因為它提供被研究結(jié)構(gòu)的更早的或更可靠的檢測。而且，它使得能夠檢測較低水平的靶化合物。因此，用于深部組織成象的技術(shù)和裝置是寶貴的，如果它們提供低檢測閾值的話。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明已經(jīng)認識到一個人可以成功地使用光譜識別技術(shù)來精確地成象在深部組織樣品，例如在動物或人中的皮下組織或器官中的一個或更多靶化合物。例如，一個人收集關(guān)于從樣品中不同空間位置上來的光線的光譜解析信息，然后從對純粹光譜的估量將該光譜解析信息分解為與樣品中的不同成分(例如自發(fā)熒光和一個或更多靶化合物)相對應(yīng)的貢獻。此分解可用于重建優(yōu)先示出選定成分的一個或更多圖象。該光譜解析信息通常對應(yīng)一光譜圖象立方體，其中每個象素包括從對應(yīng)的空間位置來的樣品發(fā)射光譜。發(fā)明人還發(fā)展了算法，它對從這樣的光譜圖象立方體數(shù)據(jù)中估量一個或更多樣品成分的純粹光譜特別有用，即使在該一個或更多成分僅以混合形式出現(xiàn)的情況(即從一個成分來光線與從另一成分來的光線既在空間上也在光譜上重疊)。然后這些純粹的光譜可用于將光譜圖象立方體數(shù)據(jù)分解為選定成分的圖象。這些算法不僅對深部組織樣品有用， 而且對一般的生物樣品也有用。此外，在一些實施例中，該算法需要很少或不需要用戶輸入。
在一些實施例中，該算法認識到，對僅以混合形式出現(xiàn)在圖象立方體中的第一成分的純粹光譜的精確估量，可以通過使用至少部分圖象立方體數(shù)據(jù)以及對至少出現(xiàn)在混合中的第二成分的純粹光譜的分別估量來確定。對第二成分的純粹光譜的估量可基于圖象立方體數(shù)據(jù)的其他部分或者來自現(xiàn)有的知識。在最簡單的例子中，比例數(shù)量的對第二成分的光譜估量被從混合信號光譜中減去以顯露出第一成分的純粹光譜的估量。例如，該比例可被設(shè)定為在每個光譜波道中達到較小的但非零的信號值?，F(xiàn)在我們概括地總結(jié)本發(fā)明的至少一些不同的方面和特征。一般，在一方面中，本發(fā)明特征為一種方法包括(i)提供關(guān)于響應(yīng)于對樣品的照明而從樣品(例如深部組織樣品)中的不同空間位置上來的光線的光譜解析信息，其中光線包括來自樣品中的不同成分的貢獻；及(ii)基于該光譜解析信息構(gòu)建樣品的圖象以優(yōu)先示出一個選定的成分。典型地，該光譜解析信息包括對應(yīng)至少三種，優(yōu)選為四或更多種不同光譜加權(quán)函數(shù)(例如不同光譜波段)的信息。該方法可進一步包括，從光譜估量，將對于至少一些不同空間位置的每一個的光譜解析信息分解成來自與樣品種的至少一個或更多成分的每一個相關(guān)的光譜估量的貢獻。 圖象的構(gòu)建可基于此分解。而且，一個或更多光譜估量可以是對于成分的純粹光譜的估量。 給定成分的純粹光譜對應(yīng)會觀測到的光譜解析信息，只要該成分對被測量的光線作出貢獻 (對給定的空間位置)。該方法可進一步包括下面的任何特征。該光譜解析信息可包括關(guān)于其中從樣品來的光線被光譜濾波的一組圖象的信息， 其中對每個圖象的光譜濾波對應(yīng)不同的光譜加權(quán)函數(shù)。該光譜解析信息可包括關(guān)于其中用于照明樣品的光線被光譜濾波的一組圖象的信息，其中對每個圖象的光譜濾波對應(yīng)不同的光譜加權(quán)函數(shù)。典型地，不同的空間位置對應(yīng)在該組圖象中的公共象素。不同的光譜加權(quán)函數(shù)可對應(yīng)不同的光譜波段。在該組圖象中可以有三個，或更優(yōu)選為四個或更多圖象。關(guān)于該組圖象的信息可包括在每個象素處的一系列值，其中每個值與從樣品來的光線相對于光譜加權(quán)函數(shù)的對應(yīng)的那個的強度有關(guān)。典型地，對每個空間位置的光譜解析信息包括與至少三個更優(yōu)選為四個或更多不同光譜加權(quán)函數(shù)相對應(yīng)的信息。該光譜解析信息可包括光譜圖象立方體。來自樣品的光線可包括來自樣品的熒光、來自樣品的反射、磷光、散射、或者拉曼散射，或者它可以包括傳輸通過樣品的光線。至少成分之一可涉及自發(fā)熒光。至少成分之一可包括靶化合物(即熒光蛋白或量子點)。例如選定的成分可以是包括靶化合物的成分。該方法可進一步包括照明樣品和收集光譜解析信息。例如收集光譜解析信息可包括使用液晶可調(diào)光譜濾波器、聲光可調(diào)光譜濾波器、一組光譜濾波器、光譜濾波器輪、色散棱鏡、光柵、分光計或單色儀。選定成分的圖象可包括一圖象，其中從其他成分來的信號相對于從選定成分的信號被減小。該方法可進一步包括，基于該分解構(gòu)建樣品的第二圖象以優(yōu)先示出成分中的第二個。該方法還可包括基于該分解構(gòu)建樣品的第三圖象以優(yōu)先示出成分中的第三個。該樣品可以是活著的有機體(例如哺乳動物)。樣品可以包括深部組織、組織切片、細胞、皮下組織，或者攜帶生物材料的顯微鏡載物片。基于該分解構(gòu)建圖象可包括基于與選定成分有關(guān)的光譜估量在不同空間位置處的貢獻來構(gòu)建深部組織圖象。該分解可以是線性分解。例如，該分解可包括求解矩陣方程中的至少一個元素，其中，方程中的一個矩陣是基于光譜解析信息而方程中另一個矩陣是基于光譜估量。可獨立于該光譜解析信息提供至少一個光譜估量。至少對成分中的第一個的至少第一個光譜估量可以從光譜解析信息中確定。例如，可以從該光譜解析信息中確定所有的光譜估量?？梢酝ㄟ^使用無監(jiān)督分類技術(shù)或者有監(jiān)督的分類技術(shù)從光譜解析信息中確定光譜估量。無監(jiān)督分類技術(shù)的一個例子包括對那些多重空間位置求其光譜解析信息的平均值。有監(jiān)督分類技術(shù)的一個例子從一包括一個或更多空間位置的區(qū)域的光譜解析信息確定第一光譜估量，其中該區(qū)域與第一成分有關(guān)。第一光譜估量可以從來自第一組一個或更多空間位置的光譜解析信息得到，在這些空間位置中光線包括來自那些多重成分的貢獻。在這種情況中，第一光譜估量可以從來自第一組空間位置的光譜解析信息以及對成分中的第二個的光譜估量而得到。例如，得到第一光譜估量可包括基于來自第一組的光譜解析信息和對第二成分的光譜估量來計算剩余光譜?？梢栽诘谝唤M空間位置中的一個或更多空間位置的每一個上計算剩余光譜?？蛇x擇的，剩余光譜的計算可基于第一組空間位置的光譜解析信息和對第二成分的光譜估量的平均。對第二成分的光譜估量可以從光譜解析信息得到。例如，對第二成分的光譜估量可以通過使用無監(jiān)督分類技術(shù)例如求平均值，而從光譜解析信息得到。可選擇的，對第二成分的光譜估量可以從包括一個或更多空間位置的區(qū)域得到，其中該區(qū)域與第二成分有關(guān)。得到第一光譜估量可包括對于第一組空間位置調(diào)整對應(yīng)光譜解析信息的值以基于對第二成分的光譜估量從第二成分中去掉一貢獻(例如最大貢獻)。最大貢獻可基于在調(diào)整值的每個光譜波道中的信號的誤差函數(shù)分析。例如，誤差函數(shù)分析趨向于在調(diào)整值的每個光譜波道中保持非負數(shù)的信號。例如，該值可包括一系列的對第一組中的每個空間位置的至少一些值，基于對第二成分的光譜估量從第二成分中去掉貢獻可包括從該一系列值中減去對第二成分的光譜
估量的最優(yōu)量。對于至少該一系列值的第一個的最優(yōu)量可基于使包括在第一系列值和由對第二成分的光譜估量乘上去的要被最優(yōu)化的量之間的差異的差值光譜的誤差函數(shù)最小，其中該誤差函數(shù)在光譜波道上被最小化。該差值光譜可進一步包括同樣在光譜波道上被最優(yōu)化的一個常數(shù)。典型地，該誤差函數(shù)偏愛差值光譜正值多于差值光譜負值。例如，一個有用的誤差函數(shù)包括(["+I) Δ2，其中Δ是差值光譜。誤差函數(shù)也可被第一系列值的大小和對第二成分的光譜估量歸一化。分解可包括(i)將在多重空間位置上的光譜解析信息第一分解為來自與至少樣品中的一些成分相關(guān)的初始光譜估量的貢獻；(ii)基于第一分解提高至少一些初始光譜估量的精確度；及(iii)至少一第二分解，其將在多重空間位置上的光譜解析信息分解為來自改進的光譜估量的貢獻。在另一方面，本發(fā)明特征為一裝置，包括(i)構(gòu)建為支撐樣品(例如深部組織樣品)的樣品架；(ii)照明樣品的照明源；安置為檢測來自樣品的光線的檢測器；及(iii)耦合到檢測器上的電子處理器。該電子處理器構(gòu)建為完成上面描述的任何方法步驟，包括按照需要與使用者互動。該裝置可進一步包括安置在樣品和檢測器之間的光譜濾波裝置。例如光譜濾波裝置可包括液晶可調(diào)光譜濾波器、聲光可調(diào)光譜濾波器、一組光譜濾波器、光譜濾波器輪、色散棱鏡、光柵、分光計或單色儀?？蛇x擇的，或另外，該裝置可包括安置在照明源和樣品之間的光譜濾波裝置。而且，照明源自身可提供可調(diào)激發(fā)光。例如，它可以是多譜段二極管或LED陣列。一般，在又一方面，本發(fā)明特征為一方法，包括(i)響應(yīng)于照明提供從生物樣品發(fā)出的光譜濾波輻射的一組圖象，其中樣品包括支撐靶化合物的成分，發(fā)出的輻射包括來自靶化合物的發(fā)射和來自樣品中的一個或更多另外的成分的發(fā)射，對一公共組象素每個圖象對應(yīng)不同的光譜加權(quán)函數(shù)；及(ii)處理光譜濾波輻射的圖象以構(gòu)建樣品的輸出圖象，其中來自另外的成分的信號相對于來自靶化合物的信號被減小。該處理包括基于對至少成分之一的發(fā)射光譜的估量，對該組圖象中的一個或更多象素計算剩余光譜。在再一方面中，本發(fā)明特征為一方法，包括(i)照明樣品以使樣品發(fā)出輻射，其中樣品包括支撐靶化合物的深部組織，其中發(fā)出的輻射包括來自靶化合物的發(fā)射和來自樣品中的一個或更多其他成分的發(fā)射；(ii)用多個不同的光譜加權(quán)函數(shù)中的每一個對發(fā)出的輻射進行光譜濾波；(iii)對光譜加權(quán)函數(shù)的每一個儲存光譜濾波輻射的圖象；及(iv) 處理儲存的圖象以構(gòu)建樣品的深部組織圖象，其中來自其他化合物的信號相對于來自靶化合物的信號被減小。在另一方面中，本發(fā)明特征為一方法，包括(i)響應(yīng)于照明提供從樣品發(fā)出的光譜濾波輻射的多個圖象，其中樣品包括支撐靶化合物的深部組織，其中發(fā)出的輻射包括來自靶化合物的發(fā)射和來自樣品中的一個或更多其他成分的發(fā)射，其中每個圖象對應(yīng)不同的光譜加權(quán)函數(shù)；及(ii)處理光譜濾波輻射的圖象以構(gòu)建樣品的深部組織圖象，其中來自其他成分的信號相對于來自靶化合物的信號被減小。在又一方面中，本發(fā)明特征為一裝置，包括儲存一程序的計算機可讀介質(zhì)，該程序使處理器(i)響應(yīng)于照明，接收從樣品發(fā)出的光譜濾波輻射的多個圖象，其中樣品包括支撐靶化合物的深部組織，其中發(fā)出的輻射包括來自靶化合物的發(fā)射和來自樣品中的一個或更多其他成分的發(fā)射，其中每個圖象對應(yīng)不同的光譜加權(quán)函數(shù)；及(ii)處理光譜濾波輻射的圖象以構(gòu)建樣品的深部組織圖象，其中來自其他成分的信號相對于來自靶化合物的信號被減小。在再一方面中，本發(fā)明特征為一裝置，包括(i)構(gòu)建為保持包括深部組織的樣品的樣品架，其中該深部組織支撐靶化合物；(ii)構(gòu)建為照明樣品以使它發(fā)出輻射的照明源，其中發(fā)出的輻射包括來自靶化合物的發(fā)射和來自樣品中的一個或更多其他成分的發(fā)射；(iii)構(gòu)建為將發(fā)出的輻射對檢測器成象的成象系統(tǒng)；(iv)可調(diào)光譜濾波器，其構(gòu)建為用多個不同的光譜加權(quán)函數(shù)的每一個對發(fā)出的輻射進行光譜濾波；(ν)檢測器，其構(gòu)建為對每個光譜加權(quán)函數(shù)儲存光譜濾波輻射的圖象；及(vi)電子處理器，其構(gòu)建為處理儲存的圖象以構(gòu)建樣品的深部組織圖象，其中來自其他化合物的信號相對于來自靶化合物的信號被減小。例如，樣品架可構(gòu)建為保持動物例如哺乳動物，象老鼠、兔子或人。而且，例如，成象系統(tǒng)可具有大于或等于1的縮小率，例如成象系統(tǒng)可構(gòu)建為對一視場成象，該視場具有在檢測器上大于2cm的對角線尺寸。這些各種方面的實施例可包括下面的任何特征。包括深部組織的樣品可以是活的有機體，例如動物或哺乳動物。例如動物可包括老鼠、兔子、斑馬魚或者人。而且，深部組織可以是該活的有機體的內(nèi)臟，該深部組織可位于不超過該活的有機體的約2mm或更深處。該深部組織可以是皮下組織。來自樣品其他成分的發(fā)射可包括來自覆蓋在深部組織上的組織的自發(fā)熒光。來自樣品的其他成分的發(fā)射可包括樣品中的不同于包括該深部組織的那層組織的一個或更多層組織的自發(fā)熒光。靶化合物可以是，例如，固定到至少該深部組織的一部分上的熒光探針、固定到至少該深部組織的一部分上的量子點、固定到至少該深部組織的一部分上的綠色熒光蛋白 (GFP)、固定到至少該深部組織的一部分上的黃色熒光蛋白(YFP)，和固定到至少該深部組織的一部分上的紅色熒光蛋白(RFP)中的任何一個。來自靶化合物的發(fā)射可以是熒光。至少一些光譜加權(quán)函數(shù)可對應(yīng)特定波長波段。例如，所有的光譜加權(quán)函數(shù)對應(yīng)特定波長波段?？蛇x擇的，至少一些光譜加權(quán)函數(shù)可對應(yīng)多重波段的正弦加權(quán)。光譜濾波可包括使用液晶可調(diào)光學濾波器、干涉光學濾波器、包含多個帶通濾波器的濾波器輪中的任一。每個儲存的圖象可包括對每個多重象素的強度值。處理儲存圖象可包括基于在儲存的圖象中的信號的加權(quán)疊加構(gòu)建深部組織圖象。處理記錄的圖象可包括基于記錄的圖象和對樣品中的其他成分的至少一發(fā)射光譜來構(gòu)建深部組織圖象。例如，構(gòu)建深部組織圖象可包括基于對其他成分的該至少一發(fā)射光譜來計算對于在該組儲存圖象中的每個象素的剩余光譜。類似地，處理記錄圖象可包括基于記錄圖象和對靶化合物的發(fā)射光譜來構(gòu)建深部組織圖象。例如構(gòu)建深部組織圖象可包括基于對靶化合物的發(fā)射光譜來計算對在該組儲存圖象中的每個象素的剩余光譜。還有，處理記錄圖象可包括基于記錄的圖象、對樣品中的其他成分的至少一發(fā)射光譜，和對靶化合物的發(fā)射光譜來構(gòu)建深部組織圖象。例如，構(gòu)建深部組織圖象可包括求解一矩陣方程中的至少一元素，在該矩陣方程中一個矩陣是基于儲存的圖象而另一個矩陣是基于發(fā)射光譜。該深部組織可支撐多重靶化合物，而處理儲存的圖象可包括對每個靶化合物構(gòu)建深部組織圖象。例如，處理記錄的圖象可包括基于記錄的圖象和對靶化合物的發(fā)射光譜來構(gòu)建深部組織圖象。此外，處理記錄的圖象可包括基于記錄的圖象、對靶化合物的發(fā)射光譜，和對樣品中的其他成分的至少一發(fā)射光譜來構(gòu)建深部組織圖象。多個不同光譜加權(quán)函數(shù)可包括四個或更多光譜加權(quán)函數(shù)。
除非另外限定，此處所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中的技術(shù)人員通常所理解的相同意思。此處的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都全部合并與此作為參考。在相沖突的情形中，以本說明書，包括定義為準。從下面的詳細描述中，本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點將會變得顯而易見。


參考附圖，現(xiàn)在僅作為示例來進一步描述本發(fā)明。圖1示出光譜成象系統(tǒng)的示意圖。圖2示出老鼠在λ = 503nm單一光譜波段上成象的圖象，該老鼠被植入被熒光標記的腫瘤。圖3示出對圖2的樣品的自發(fā)熒光的發(fā)射光譜和靶化合物的估量的發(fā)射光譜的圖示，淺顏色的線標示對自發(fā)熒光的光譜而深顏色的線標示對靶化合物的估量光譜。圖4A和4B為分別示出被用作光譜端項的光譜不混合操作的結(jié)果測得的老鼠自發(fā)熒光信號光譜和在腫瘤的區(qū)域上檢測的混合的信號光譜的圖象。圖5示出形成圖象立方體的一組圖象。圖6示出來自圖2的老鼠的靶化合物發(fā)射的圖象，使用光譜技術(shù)和被估計出來以及被直接測得的端項光譜，來除去自發(fā)熒光信號。圖7示出來自圖2的老鼠的自發(fā)熒光發(fā)射的圖象，使用光譜技術(shù)和被估計出來以及被直接測得的端項光譜，來分離靶化合物發(fā)射。圖8示出基于光譜立方體的獲得和隨后通過線性不混合的分析的，一實施例的流程圖。圖9示出在圖8的實施例中的每個光譜波段的光譜特性的圖示。圖10示出又一實施例的流程圖，其中用干涉法完成光譜濾波。圖11示出在圖10的實施例中所用的光譜加權(quán)的光譜特性的圖示。在各個圖中的相同附圖標記標示相同的元件。圖12示出另一實施例的流程圖，其中結(jié)合光譜成分分解來估量自發(fā)熒光和靶化合物的光譜。圖13A、i;3B和13C示出典型無生命科學端項檢測算法產(chǎn)生的示例性的圖象組分豐度圖象。圖14A、14B和14C示出由無監(jiān)督重復剩余技術(shù)產(chǎn)生的輸出圖象。圖15A和15B示出由監(jiān)督重復剩余技術(shù)產(chǎn)生的輸出圖象。圖16示出用于引出光譜矢量的流程圖。圖17示出光譜成象系統(tǒng)的示意圖。
具體實施例方式概論本發(fā)明特征在于方法和裝置，其用于通過光譜識別來降低在生物樣品(包括在樣品中的深部組織)中的靶化合物的檢測靈敏度水平。這涉及測量關(guān)于從樣品中的每個多重空間位置來的光線的光譜解析信息。有時，數(shù)據(jù)被稱作是“圖象立方體”，光譜解析信息對應(yīng)沿立方體的一個維度上的值以及空間位置(或象素)對應(yīng)立方體的另外兩個維度。盡管用于深部組織成象典型為低光線水平，可以獲得有益的結(jié)果。此外，公開了用于處理光譜解析圖象數(shù)據(jù)的算法，其不僅對深部組織成象有用而且對處理一般的生物樣品的光譜解析圖象數(shù)據(jù)也有用。在一些情況中，可以以高度自動化的方式來進行處理，有很少或沒有用戶控制，同時對生物樣品的一個或更多選定成分仍然產(chǎn)生精確的圖象。光譜成象技術(shù)(例如熒光成象)可以和樣品一起使用，該樣品用熒光標簽標記或者被基因修改從而一個或更多靶化合物發(fā)出熒光或者真是靶的那些發(fā)出熒光。這種來自一個或更多靶化合物的熒光叫做“靶熒光”。然而，除了例如靶化合物這樣的成分，樣品可包括其他成分，其每一個按照對應(yīng)的發(fā)射光譜發(fā)出輻射。例如在樣品中可以有其他成分或材料， 其沒被標記或者沒被基因修改，其也可以在某些水平上發(fā)出熒光。這種未知的及/或背景熒光叫做“自發(fā)熒光”。這種自發(fā)熒光干擾對靶熒光的定量測量，在一些情況中，可以比靶熒光亮很多倍。 一些所關(guān)心的特殊應(yīng)用是在生命科學上，包括活體內(nèi)熒光成象及熒光顯微鏡法；然而，這里描述的技術(shù)在例如在明視場顯微鏡法的其他應(yīng)用中也有效。自發(fā)熒光也可包括其他光譜標記例如設(shè)備光譜響應(yīng)，或者從其他成分或者在傳輸?shù)墓饩€(例如明視場)應(yīng)用中的 chromaphores的吸收。此外，有多重成分，其每一個產(chǎn)生不同的自發(fā)熒光光譜。典型地，自發(fā)熒光具有不同于靶熒光發(fā)射光譜的發(fā)射光譜，提供一個機會以應(yīng)用光譜不混合技術(shù)以在被檢測的圖象立方體中的一象素處在每個測得的信號光譜中將靶熒光與自發(fā)熒光分開。換句話說，信號光譜可以被分解為來自靶熒光和自發(fā)熒光的單獨貢獻。 這種光譜不混合通過去除測得信號可對自發(fā)熒光作出貢獻的部分，對樣品的被標記的或被基因修改的部分產(chǎn)生高對比的圖象。在一些情況中，一種以上的成分被標記或修改，目的是產(chǎn)生多重圖象，其表示與自發(fā)熒光及其他靶化合物隔開的每種靶化合物的濃度。為了精確地應(yīng)用光譜不混合工具，獲得每個靶化合物及每個可能對整個的測得的光譜作出貢獻的自發(fā)熒光成分的純粹發(fā)射光譜是有用的。所知道的這些成分光譜的光譜形狀越精確，就可以越精確地將在圖象立方體中的混合信號光譜不混合或分解以產(chǎn)生表現(xiàn)靶化合物及/或自發(fā)熒光成分的數(shù)量的單獨的圖象。對給定成分的純粹發(fā)射光譜是信號光譜，其只要該成分對測得的光線作出貢獻，例如，如果該成分被從其他成分隔開，它就會被測量。然而，靶化合物光譜很少會以它們的純粹形式出現(xiàn)在測得的圖象立方體的給定象素處的信號光譜內(nèi)。在一些情況中，可以使用各種熒光標簽的公布光譜。在這些情形中為了有精確的結(jié)果，應(yīng)在使用的系統(tǒng)以及光譜最初被測量的系統(tǒng)之外校準系統(tǒng)的響應(yīng)。另一種獲得來自每個靶化合物的光譜的方法是將每個靶化合物單獨隔絕并在要用于后面的活體內(nèi)實驗的同一系統(tǒng)上收集每一個的光譜。然而，對靶化合物的這種隔絕經(jīng)常是行不通的。 而且，當標簽在活體樣品內(nèi)時，由標簽產(chǎn)生的光譜經(jīng)常改變，使從與活體內(nèi)樣品隔絕的靶化合物收集的光譜不準確。在一些情況中，在樣品的現(xiàn)有狀態(tài)中處理它，而沒有對出現(xiàn)在從樣品獲得的圖象立方體的信號光譜中的成分光譜有先驗了解是有用的。因此能夠基于圖象立方體數(shù)據(jù)精確確定單獨的成分光譜是有用的，從而可以完成光譜不混合以及可以產(chǎn)生單獨的靶化合物的圖象。下面描述的技術(shù)，象“剩余技術(shù)”，由于下面要更具體描述的所涉及的成分光譜的典型特征，而特別適用于生物樣品。下面描述的這些技術(shù)的另一有用的方面是它們與自動化技術(shù)的兼容性。例如，在一些實現(xiàn)過程中，不是必須要有一個使用者基于專業(yè)知識來直觀確定在圖象中的特征。在其他的實現(xiàn)過程中，非熟練的使用者可以基于開始的自動化的步驟而提供反饋。成象系統(tǒng)在圖1中示出用于對生物樣品成象的光譜成象系統(tǒng)100的示意圖。系統(tǒng)100包括適于固持樣本112的樣品架110。例如樣本112可以是活的有機體，例如動物或哺乳動物。 靶化合物與樣本112中的組織(例如深部組織)的選定部分相聯(lián)(綁上去或堆積在上面)。 照明器120(例如金屬鹵化物燈或者其他燈、激光、發(fā)光二極管陣列或者其他電磁輻射源) 將激發(fā)光122指向樣本112以從組織中的靶化合物激發(fā)出發(fā)射(例如熒光)。典型地，激發(fā)光也會導致從樣本112中的其他成分發(fā)出自發(fā)熒光。因此，從樣本112發(fā)出的電磁輻射 130包括來自靶化合物以及自發(fā)熒光的發(fā)射。發(fā)出的輻射130被成象系統(tǒng)140收集并成象在照相機150上。因為系統(tǒng)100設(shè)計為能夠?qū)υ谳^大樣本(例如活的有機體)中的深部組織成象， 典型地，成象系統(tǒng)提供一或更大，或者甚至二或更大的縮小率。就是說，在照相機上的圖象是相同尺寸或小于對成象系統(tǒng)的物體視場。還有，典型地，對成象系統(tǒng)的物體視場在對角線尺寸上大于約2cm (或大于約3cm)。另外，雖然圖1示出發(fā)出的輻射130是被從樣本112相對于激發(fā)光122的相反一側(cè)來收集，在其他實施例中，發(fā)出的輻射可以從激發(fā)光照明的相同的一側(cè)或者成一定角度， 來被收集。此外，可以從樣本112的多個側(cè)面提供照明。安置在樣本112和照相機150之間的是可調(diào)光學濾波器模塊160 (例如液晶可調(diào)光學濾波器、干涉光學濾波器或者電動濾波器輪)。光學濾波器模塊160按照多個光譜加權(quán)函數(shù)(例如四個或更多光譜加權(quán)函數(shù))的每一個對發(fā)出的輻射130進行光譜濾波。光譜加權(quán)函數(shù)可對應(yīng)特定的波長波段，或者可以是更復雜的函數(shù)例如通過波段的正弦分布。光學濾波器模塊160也可以光學上包括其他濾波器包括例如，減少能進入照相機150的激發(fā)光 122的量的濾波器。照相機150對不同光譜加權(quán)函數(shù)的每一個都記錄被光譜濾波的發(fā)出輻射170的圖象，并將圖象數(shù)據(jù)送到計算機180以用于分析。如下面要更具體描述的那樣，計算機基于不同的光譜加權(quán)函數(shù)、對應(yīng)純粹的靶化合物的一個或更多發(fā)射光譜，樣本112中一個或更多其他成分的純粹自發(fā)熒光，或兩者，來處理圖象數(shù)據(jù)，以構(gòu)建一個抑制自發(fā)熒光信號以顯露出靶化合物的圖象。在一些實現(xiàn)過程中，系統(tǒng)100的一部分(例如系統(tǒng)100在照明器120和照相機150 之間的部分，照明器和照相機也包括在內(nèi))可選擇為裝入在外殼190中，例如以減小能被成象到照相機150上或者能與樣本相互影響的雜散光(例如室內(nèi)光線)的數(shù)量。光譜成象技術(shù)在下面，我們描述對生物樣品的光譜成象的背景、包括深部組織成象的特定實施例，以及用于構(gòu)建圖象的光譜不混合技術(shù)。信號強度通過靶化合物的生物樣品(特別是在深部組織樣品)中的成象結(jié)構(gòu)的一個特點是光學信號較弱。因此，許多專業(yè)人員把主要的重要性放在檢測器的特性、在光路中的所有元
11件例如透鏡和用于阻擋激發(fā)光到達檢測器的阻擋濾波器的效率上面。然而當現(xiàn)有技術(shù)的 CCD檢測器等等適于檢測低水平光線信號時，它不能充分解決在由靶化合物發(fā)出的光線和來自其他源例如自發(fā)熒光的光線之間進行識別的問題。這樣，一個人的實際上的檢測水平可以由使從樣本內(nèi)其他位置產(chǎn)生的光線混淆的水平來設(shè)定，而不是考慮在他的檢測器中的讀出噪音，或者物鏡的光收集能力。說得更準確一些，一個人的檢測限制可以看作是，一個人的檢測器噪音或者向檢測器展現(xiàn)出的混淆信號流量較大；在任何一種情況中可表達為同樣的在樣本中產(chǎn)生在檢測器上的該信號水平的光線的靶化合物的濃度。除非靶化合物發(fā)出的光線凌駕于樣本中的所有其他源，技術(shù)人員經(jīng)常要受到混淆信號而不是他的檢測裝置的限制。在生物樣品中一些水平的自發(fā)熒光是固有的，當它們被可見范圍的光照明，特別是當光線是綠色(550nm)或更短時。因此即使使用最優(yōu)的靶化合物，出現(xiàn)在樣本表面處或其附近的自發(fā)熒光也經(jīng)常限定了檢測界限。另外，來自深部組織內(nèi)的靶化合物的發(fā)射在它從發(fā)射的位置傳播到樣本的表面時，會被散射或吸收衰減。因而到達成象系統(tǒng)的信號水平減小，而在樣本的表面層產(chǎn)生的光線則不會被類似地那樣衰減。這種效果的具體情況取決于樣品樣本相對于收集光學裝置的幾何形狀，以及樣品的光學特性。同樣的，照明光線在它從照明源通過樣本的表面層沿其路線到達要成象的結(jié)構(gòu)時可能被減弱或散射。到達靶位置的激發(fā)信號被減弱，而在樣本的表面處產(chǎn)生的信號則不會類似地減弱。這一點的具體情況取決于照明和收集光學裝置的幾何形狀，以及樣品樣本的光學特性。這些因素通過增大自發(fā)熒光發(fā)射對測得的信號與來自靶化合物的發(fā)射相比的相對貢獻，會加重自發(fā)熒光的效果。問題的程度由圖2示出，其是來自老鼠的自發(fā)熒光發(fā)射的圖象。用約480nm的光線照明老鼠，發(fā)射光線被中心在530nm的25nm帶通濾波器濾波。在老鼠的肺中有用綠色熒光蛋白(GFP)表達的腫瘤。然而，由于來自廣泛的明顯產(chǎn)生在老鼠的皮膚層中的自發(fā)熒光的相等或更大的信號，不容易在圖象中識別該腫瘤。結(jié)果是，當能容易地量化圖象中的任何點處的信號水平時，由于設(shè)定了與涉及的靶化合物相比相同或更高的檢測閾值的高水平的背景自發(fā)熒光，而不能證實靶化合物及因此腫瘤的存在。自發(fā)熒光也可以從樣本到樣本而改變，并是不可預測的。因而，如果絕對通量水平用于對靶化合物進行估算，技術(shù)人員會得到錯誤的積極讀數(shù)。差異可以從例如在樣本外皮上的霉菌或疾病這樣的因素而產(chǎn)生。這些通常在樣本之間并不是一致的。因此，如果技術(shù)人員通過將在給定區(qū)域的局部信號水平與樣本的平均水平相比較來尋求檢測處靶化合物的存在，結(jié)果也是不可靠的。光譜串擾在某些情況中有可能通過對照明波長的選擇來減少自發(fā)熒光。如本領(lǐng)域已知的那樣，一般使用較長的波長來照明是有利的，因為它們通常產(chǎn)生較少的自發(fā)熒光。同樣，選擇發(fā)射光線出現(xiàn)在與樣本的自發(fā)熒光范圍不同的波長處的靶化合物是有利的。然而，通常不可能選擇一種照明波長使得沒有串擾。在圖3示出的例子中，靶化合物、GFP(由深色陰影線表示的)及自發(fā)熒光(由淺色陰影線表示的)發(fā)射光譜相重疊。在任何靶化合物具有實質(zhì)發(fā)射的波長處，自發(fā)熒光也較強，因而不能通過使用固定的光學濾波器或其他類似的東西來消除自發(fā)熒光。也沒有彩色照相機能在兩個如此相似的綠色光譜之間進行識別。然而如圖3所示，GFP和自發(fā)熒光發(fā)射的光譜仍然是不同的。因此光譜成象方法可以識別這兩者并消除或顯著減小后者信號的貢獻。光譜不混合一種用于將每個象素的信號光譜分成它的成分光譜的工具是線性分解或不混合。 例如，技術(shù)人員可以完成最小二次方最佳擬合趨近以確定需要多少每個單獨的成分光譜以最精確地重建測得的信號光譜。光譜不混合使用一組輸入光譜以在測得的圖象立方體中表現(xiàn)成分光譜。典型地， 輸入光譜為對不同成分的純粹光譜的估量。如果不能從庫中得到成分光譜或者還沒有從隔絕的材料中收集成分光譜的話，一種為不混合提供輸入光譜的方法是，假定每個單獨的成分光譜可以用在圖象立方體中的象素或象素群的光譜來表達。然而，典型地，這種方法對至少一個或更多純粹光譜產(chǎn)生較弱的估量。例如，靶熒光成分很少單獨存在，與自發(fā)熒光成分分開，在圖象立方體的隔絕區(qū)域內(nèi)。對其中出現(xiàn)靶化合物的象素區(qū)域的信號光譜通常是成分光譜的混合。因此，如果技術(shù)人員基于這樣的區(qū)域?qū)Π谐煞种坏募兇夤庾V估量，不混合會較弱-它表達與混合成分光譜相關(guān)的化合物的混
I=I O同樣，在某些情況中，為了在圖象立方體內(nèi)精確地分配測得的信號，難以先驗知道在樣品中存在多少實際的熒光成分(每一種與對應(yīng)的成分光譜有關(guān))。如果在不混合期間一些成分光譜沒有被表現(xiàn)出來，那么剩余成分的相對比率就無法精確確定。在一些情況中，手工選擇從哪里選擇輸入光譜和選擇多少輸入光譜來不混合可以起作用，如果使用者基于專業(yè)的知識及/或經(jīng)驗給出有根據(jù)的推測的話。一些使用者可以以這種方式有效地工作，如果它們具有明顯的對該樣品的先驗知識的話。在圖4A和4B中示出了這些方法的缺陷的一個好的例子。在圖2的圖象中，一個熟練的使用者可以模糊地辨識處一個肺應(yīng)該大致位于的區(qū)域(在對應(yīng)彩色圖象中的偏藍色調(diào))。對未經(jīng)訓練的視力，這種由腫瘤導致的不規(guī)則性是感覺不到的。如果一個人使用來自周圍區(qū)域的信號光譜作為輸入光譜以表現(xiàn)自發(fā)熒光，及來自看起來象腫瘤的區(qū)域的信號光譜作為輸入光譜來表現(xiàn)靶熒光，并使用這些輸入光譜完成不混合，他會得到圖4A和4B中的圖象。圖4A是光譜上最接近類似對應(yīng)于確定為自發(fā)熒光的區(qū)域的象素的視場部分的圖象。圖4B是光譜上最接近類似對應(yīng)于確定為腫瘤的區(qū)域的象素的視場部分的圖象。與腫瘤有關(guān)的區(qū)域被很好地限定出來。然而，該圖象有一些問題。例如，留在自發(fā)熒光圖象中的 “孔”(圖4A)，表明從這一區(qū)域發(fā)出的光量子被不精確地分配到標記腫瘤的圖象上。如果一個人象測量靶熒光的量作為腫瘤的尺寸的估量，這種串擾會導致明顯的錯誤(例如，測得的大小大于實際的靶熒光)。在這個例子中出現(xiàn)這個錯誤是因為，即使用于表現(xiàn)自發(fā)熒光的輸入光譜主要是自發(fā)熒光，由于靶化合物和自發(fā)熒光材料是共同定位，表現(xiàn)腫瘤的輸入光譜是靶熒光和自發(fā)熒光的混合。為了在這個例子中正確的完成不混合，不僅輸入自發(fā)熒光光譜應(yīng)該是“純粹的”，而且輸入靶熒光光譜也應(yīng)該是“純粹的”(例如沒有與相當數(shù)量的其他成分光譜，在這個情形中為自發(fā)熒光，相混合)。用純粹光譜不混合
即使在一些樣品中，一種成分光譜可能沒有以其“純粹”的形式(即基本不混合的形式，例如與小于約10%的其他成分或優(yōu)選小于約的其他成分相混合，)表現(xiàn)在任何象素的信號光譜中，在某些情況中仍然可以從圖象立方體數(shù)據(jù)獲得對純粹成分光譜的估量以用作不混合的輸入光譜。例如在某些情況中，一種成分光譜(例如對應(yīng)自發(fā)熒光)，其識別為光譜A，可以以“純粹”的形式得到(例如，從一象素的信號光譜或從其他已知的或能得到的方面)。而另一種成分光譜，其識別為光譜B，可能不能以“純粹”形式得到。在這種情況中，如果光譜B在圖象立方體中表現(xiàn)為在一個或更多能被識別的象素中僅與光譜A混合，那么可以從該“A+B”混合的光譜中減去光譜A以獲得B的純粹光譜。下面進一步描述用于從圖象立方體精確估量純粹光譜的技術(shù)。但首先，我們描述一個例子，其中將圖象立方體光譜不混合或分解成為來自對樣品的不同成分的純粹光譜的估量的貢獻被成功地使用，以對在深部組織樣品中的靶成分成象。在此示例中，樣本受到照明而照明光線被阻止進入檢測器。這一點可以一起使用例如來自Lighttools Research (Encinitas加利福尼亞)的LT-9500MSYS的照明器與透射所有大致為λ >510nm的光線的長通光學濾波器，其安置在物方路徑上，來實現(xiàn)。光譜成象檢測器包括一帶有55mm F/2. 8的Nikkor微距鏡頭(Nikon USA, Melville 紐約)的 QImaging 1300C 數(shù)碼冷卻 CCD 照相機(Roper Scientific，Trenton 新澤西)，其中一個VARISPEC可調(diào)光學濾波器(CRI he,Woburn馬薩諸塞)以安裝適配器耦合到其上。該VARISPEC濾波器為計算機控制的光學濾波器，具有25nm帶通和可調(diào)的中心波長。這些被連接到一個IBM Thinkpad計算機上，其控制圖象的獲取并完成數(shù)據(jù)的分析。 通訊是通過到照相機上的IEEE-1394接口，以及到VARISPEC濾波器上的RS-232接口。VARISPEC濾波器使用向列液晶可變延遲元件來構(gòu)建可調(diào)Lyot濾波器?？勺冄舆t器放在具有石英或其他材料的固定波板的光學系列中，以產(chǎn)生熟知的且電學可調(diào)的延遲。 在濾波器的連續(xù)節(jié)之間的線偏振器作用是阻止不想要的階這樣僅有單一的峰被透過，如果希望的話，帶外的泄漏可以被減小到0.01%。通過選擇延遲器的厚度，技術(shù)人員可以獲得從0. Inm到50nm或更高范圍的帶寬。調(diào)節(jié)動作是極快的(< 50ms)并且不會由于調(diào)節(jié)引起圖象偏移，這對于成象應(yīng)用是很有價值的。參考圖5，圖2的老鼠的成象是通過取得一系列的圖象S(x，y，λ》(對i = 1到 n，光譜譜集的數(shù)量)，其每一個被使用由VARISPEC濾波器決定的光譜加權(quán)函數(shù)Ii來記錄， 而VARISPEC濾波器的中心波長被從500nm調(diào)到650nm。在圖5中的這一系列圖象是光譜圖象立方體500的例子。在圖9中示出了不同的光譜加權(quán)函數(shù)(在此情況中，光譜通帶)。 結(jié)果是一個圖象立方體500，其具有對于給定中心波長Xi的樣品的全部的二維圖象以及在圖象的給定象素(x，y)處的全部光譜。在給定象素處記錄的精確的光譜取決于GFP和自發(fā)熒光的數(shù)量，以及兩個光譜，如下S(x,y, λ) = a(x, y)*F(A )+b(x, y)*G(A ) [1]其中(X，y)標記用于表示在圖象中一給定的象素位置，星號*表示乘，λ用于表示發(fā)射或檢測的給定波長(波長波段)，及S (x, y, λ )表示對給定象素位置和波長的凈信號，F(xiàn)(X)表示自發(fā)熒光的發(fā)射光譜，G ( λ )表示GFP的發(fā)射光譜，
a(x,y)表示在給定的(x，y)象素位置的自發(fā)熒光的豐度，及b(x, y)表示在給定的(X，y)象素位置的GFP的豐度。方程[1]表明來自給定象素位置的凈信號是兩個貢獻之和，由出現(xiàn)的自發(fā)熒光和 GFP的相對數(shù)量來加權(quán)。如果技術(shù)人員對一個單個的象素來寫上面的方程的話，可以看得更容易S(A) = aF ( λ ) +bG ( λ ) [2]F和G可以稱作是系統(tǒng)的光譜本征態(tài)，因為它們對應(yīng)根據(jù)自發(fā)熒光和GFP發(fā)射的量合并成不同的數(shù)量的自發(fā)熒光和GFP發(fā)射的純粹光譜，以產(chǎn)生觀測到的光譜或信號光譜S。 這樣，信號光譜為與來自自發(fā)熒光和GFP發(fā)射的單獨貢獻相對應(yīng)的加權(quán)疊加。現(xiàn)在如果知道(或可以推導出，如下所述)自發(fā)熒光和GFP的發(fā)射光譜，技術(shù)人員可以用線性代數(shù)對方程[2]求逆以求解a和b，假如光譜S具有至少兩項在其中；S卩，技術(shù)人員具有對至少兩個發(fā)射波長λ的數(shù)據(jù)。方程[2]可以被重寫成S = ΕΑ。那么我們可以寫出A = E-1S [3]其中A是帶有分量a和b的列向量，而E是其列為光譜本征態(tài)的矩陣，即[re]。使用方程[3]，技術(shù)人員可以獲得觀察到的信號光譜并計算在對應(yīng)的象素位置上的自發(fā)熒光和GFP源(例如產(chǎn)生自發(fā)熒光和GFP發(fā)光的成分)的豐度?？梢詫D象中的每個象素重復這一過程，以產(chǎn)生沒有來自自發(fā)熒光的貢獻的GFP的圖象。結(jié)果是，檢測水平被極大地提高。請注意到對給定的一組自發(fā)熒光和靶化合物光譜矩陣E僅需要被求逆一次，因此豐度的計算并不繁重，幾乎可以容易地由個人電腦實時完成。在分別呈現(xiàn)出對GFP和自發(fā)熒光的豐度圖象的圖6和7中，示出了此光譜不混合處理的結(jié)果。如圖6所示，一旦將GFP與自發(fā)熒光分開就能容易地檢測它。在GFP圖象中改進的程度是驚人的。同樣，能夠看到自發(fā)熒光圖象(圖7)是平滑的并在出現(xiàn)GFP的區(qū)域上未受影響，其與這樣的事實相一致，即在深部組織結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的GFP不會改變從皮膚的上覆區(qū)域來的自發(fā)熒光發(fā)光的數(shù)量。在圖8中將示例性的測量和分析過程從頭到尾以結(jié)構(gòu)圖示出。準備和照明樣本 (步驟80 以及確定要獲得的光譜波段(步驟810)。然后光譜濾波器被設(shè)定為透過光譜加權(quán)函數(shù)Ii,例如特定的波長波段(步驟815)，并獲得與該光譜加權(quán)函數(shù)相對應(yīng)的圖象(步驟820)。然后光譜濾波器被設(shè)定到下一個光譜加權(quán)函數(shù)并獲得對應(yīng)的圖象，直到獲得所有波段的(步驟825和830)。然后提供或從其他方面確定對靶化合物和自發(fā)熒光的光譜(步驟835)?；谠摴庾V，產(chǎn)生矩陣E并確定它的逆矩陣(步驟840)。對每個圖象象素，由該系列得到的圖象限定的信號光譜然后被乘以E的逆矩陣(步驟84 以產(chǎn)生靶化合物的豐度圖象，即樣品圖象(步驟850)。在這個例子中，光譜成象允許觀察位于活的有機體約2mm內(nèi)的組織中的結(jié)構(gòu)，其中上覆的皮膚至少為300微米厚并具有明顯的自發(fā)熒光。光譜成象也可以用于對其他樣本在不同深度下的結(jié)構(gòu)成象，樣本包括非哺乳動物樣本，例如斑馬魚。在后者中，樣本身體較薄，但再一次存在來自樣本的其他層的自發(fā)熒光的問題，其混淆對樣本的內(nèi)部的靶化合物的檢測。盡管有用于深度剖斷的光學技術(shù)，例如共焦顯微鏡方法，此處描述的光譜成象技術(shù)提供一種簡單而實用的選擇。在紅外范圍600_1100nm中操作的實施例也可以使用近紅外VARISPEC濾波器例如 VIS-NIR2-10-20HC 型來構(gòu)建。這些技術(shù)中不會有什么會防止技術(shù)人員觀看每個樣本的多重靶化合物(例如m靶化合物)。如果我們將光譜譜集的數(shù)目標記為n，矩陣E稱為nXm矩陣而不是在上面的例子中所用的nX2矩陣。因而，技術(shù)人員可以使用這些技術(shù)從包含兩個靶化合物的樣品中去掉自發(fā)熒光；或者從帶有一個或更多靶化合物的樣品中去掉兩種類型的自發(fā)熒光。在任何情況中，結(jié)果是靶化合物與自發(fā)熒光隔絕，以及能夠量化這些成分的一個或全部。對能夠被隔絕的成分的數(shù)量以及對總體的信噪比的限制，由散粒噪聲水平和在被辨別的樣本的發(fā)射光譜(包括自發(fā)熒光)之間光譜區(qū)分程度給出。技術(shù)人員可以用光譜角距離θ描述在兩個光譜之間的相關(guān)程度，θ定義為θ = arccos [ (S1 · S2) / (| S11 | S21) ] [4]對兩個分量的θ較小的光譜集不容易被分成它們的成分。物理上，對這一點的原因是容易理解的如果兩個光譜僅在邊緣上不同，更難以確定哪個類型出現(xiàn)了，而噪音可以輕易地改變技術(shù)人員對相對豐度的估量。象θ —樣的標注可用于幫助決定什么光譜波段適于測量，而技術(shù)人員可以盡可能地嘗試和選擇產(chǎn)生較大θ的波段?；蛘?，技術(shù)人員可以通過實驗和錯誤，作一個什么波段產(chǎn)生最大分離的經(jīng)驗性研究。為了降低對來自預期形狀的輕微光譜偏移的靈敏度，其由于在樣本等之間的差異該偏移是可能發(fā)生的，包括比看起來單獨從數(shù)學分析所需要的更多的波段會是有幫助的。一般，對樣品中的每個空間位置(即象素)測得的信號光譜和用于不混合的純粹光譜的估量，典型地，應(yīng)包括足夠的數(shù)值以提供對所關(guān)心的成分的精確信息。例如，對一兩個成分的樣品分析，優(yōu)選有至少三個值(或者更優(yōu)選，四個或更多值)對應(yīng)不同的光譜加權(quán)函數(shù)(例如不同的光譜波段)。當成分的數(shù)目增大時，對信號和純粹光譜的數(shù)值的數(shù)量應(yīng)該也增加。在上面的實施例中考慮測量裝置的光學效率是值得的，以理解這些技術(shù)提供的可能改進來自哪里。首先，使用的鏡頭是F/2. 8型而不是對于這種工作更典型的F/1. 2或 F/1.8，這一選擇導致2.4-5.4Χ的更少的光線收集。接著，VARISPEC濾波器具有約25%的透射，并收集25nm范圍，和具有80%透射和收集40nm范圍的典型干涉濾波器形成對比。比起可能用于此項工作的設(shè)備來說，這進一步使靈敏度降低了 5. IX的因子，比起本領(lǐng)域的一些可選擇方案在光通量上的總體的減少為12. 3X-27. 8X。C⑶照相機被冷卻在周圍環(huán)境以下25°到約0°C，這對普通的C⑶傳感器來說是典型的，而不象在例如來自Roper Scientific (Trenton，新澤西)的ChemiPro系統(tǒng)的成象工作站中所用的傳感器，其用液氮冷卻以達到比周圍低100°C或更低的溫度。如這些所顯出的那樣，這些技術(shù)的有效不是來自在聚集或收集光線的極端效率上；而是其來自使用光譜選擇性以識別和去掉背景自發(fā)熒光的效果。在其他實施例中，光譜加權(quán)函數(shù)可以與通帶不同。重要的是不同圖象的光譜加權(quán)不同。例如，技術(shù)人員可以使用干涉儀來獲取光譜信息，如圖10中以方塊圖形式示出那樣。干涉儀對路徑差異Z的一些選定值的光譜響應(yīng)在圖11中示出。這樣獲得的圖象可以用于實行本發(fā)明，或是直接地或是在從干涉圖轉(zhuǎn)變到光譜之后。使用干涉圖的適用性可以通過看它們在涉及種類之間的辨識有多好來檢驗，其可以由例如cos θ這樣的測量或由實驗研究來決定。圖10的方塊圖與圖8中的類似，除了 步驟815、820、825和830由相應(yīng)的步驟 1015、1020、1025和1030代替，其使用干涉圖而不是特定光譜波段作為光譜加權(quán)函數(shù)；有一個可選擇步驟1032其描述將光譜濾波后的圖象傅立葉變換以產(chǎn)生光譜立方體；而步驟835 被步驟1035代替，其與獲得的數(shù)據(jù)的形式相一致(及可選擇的傅立葉變換)決定對靶化合物和自發(fā)熒光的光譜或干涉圖加權(quán)，用于產(chǎn)生矩陣E。干涉儀可以是機械類型的例如Mgnac設(shè)計，或者它可以是如美國專利 6421131 “雙折射干涉儀”所描述的雙折射干涉儀。后者使用固定的延遲元件例如石英板， 與切換裝置一起，以使延遲器彼此相加或抵消，從而使用這些元件，連同可變延遲元件，技術(shù)人員可以在較寬范圍內(nèi)產(chǎn)生任何想要的延遲。當偏振光遇到該組合件，它的偏振狀態(tài)以依賴于光線波長的方式而改變，而這一點可以在出口的分析器檢偏器上檢測出來。在干涉儀的任何特定設(shè)定上的光譜響應(yīng)是在1/λ的正弦曲線，在允許離散之后。通過在已知的延遲值上取一系列讀數(shù)，并完成傅立葉變換，可以確定光線的光譜。這樣的裝置可用在成象系統(tǒng)中以在圖象中的每個點上獲得一光譜，或者只是獲得一組圖象，而不同的正弦曲線光譜響應(yīng)函數(shù)在該組的組成項中。一般地說，任何光譜成象裝置都可以使用，假如它產(chǎn)生足夠的光譜信息以區(qū)別靶化合物和背景自發(fā)熒光的發(fā)射的話。精確估量純粹光譜我們現(xiàn)在轉(zhuǎn)到，怎樣確定在上面的例子中的純粹光譜F和G，以及更廣泛地，怎樣首先精確估量純粹光譜以用于在將信號光譜分解(即不混合)成它們的成分光譜的問題上。圖12示出在光譜不混合技術(shù)的方塊圖形式中的步驟，其中技術(shù)人員估量純粹光譜以用作在光譜不混合中的輸入光譜。該步驟有時叫作光譜成分分解以獲得純粹的輸入光譜。其不應(yīng)與在每個象素上的信號光譜被分解(或不混合)成在不混合中的純粹輸入光譜的相對貢獻相混淆。該方塊圖與圖8中的類似，除了步驟835被替代為，完成光譜成分分解(步驟 1235)和確定對應(yīng)自發(fā)熒光和靶化合物的本征量(步驟1237)以用在步驟840中的矩陣E 中。通常，可以使用任何產(chǎn)生所涉及光譜的適當估量的方法。對于一些靶化合物，從出版的參考文獻上有對該材料的已知光譜?？蛇x擇的，使用如此處描述的光譜成象工作站，技術(shù)人員可以通過放置包含足夠濃度的靶化合物的樣品在成象儀前并取得它的光譜而直接獲得光譜。相反地，經(jīng)?？梢詫夹g(shù)人員具有先驗知識的樣本一個區(qū)域成象，在那個區(qū)域上沒有靶化合物，以這種方式，技術(shù)人員可以獲得對該成分的估量。多種數(shù)據(jù)分析技術(shù)可以被用在對光譜不混合的成分光譜的確定當中，例如主要成分分析(PCA)，其從圖象立方體中識別最正交的光譜本征量，并產(chǎn)生分數(shù)圖象示出在遍及圖象中的每個本征量的加權(quán)。如果在一個包含來自靶化合物和來自背景自發(fā)熒光的貢獻的圖象上完成PCA分析，從PCA來的矢量可以被用于提出對所涉及光譜的估量。這些可以結(jié)合其他數(shù)學處理來實現(xiàn)，并且有其他已知的的用于識別低維光譜矢量的方法,例如投景i追蹤，一種在L. JimenezfPD. Landgrebe,“Hyperspectral Data Analysis and Feature Reduction Via Projection Pursuit，，， IEEE Transactions on Geoscience and Remote Sensing, Vol.37 No. 6，pp2653_2667，1999 年 11 月描述的技術(shù)。其他技術(shù)包括，例如獨立成分分析(ICA)，投影追蹤和端項檢測算法。這些技術(shù)典型地并不很好地適合在生命科學中的應(yīng)用。例如，一些技術(shù)被最優(yōu)化以用于給包含帶有密集光譜形狀的邊界明確的窄峰的光譜的光譜成象數(shù)據(jù)集。在一些技術(shù)中，比起用于分析的單獨的光譜特征和峰，光譜范圍較大。然后，峰的出現(xiàn)，或者峰的比率可以被用于給要分開的“端項”分類。不幸的，在生物學樣品中的成分通常不具有這樣的邊界明確的窄峰。對一些技術(shù)的另一問題是，它們輸出與在原始圖象立方體某處以純粹形式出現(xiàn)的光譜有關(guān)的圖象。在生命科學的許多情況中，在圖象立方體中出現(xiàn)的信號光譜是成分的混合。在老鼠中的被標記的腫瘤情況中，不太可能發(fā)現(xiàn)在老鼠上有存在腫瘤而沒有自發(fā)熒光這樣的位置。如果所關(guān)心的成分沒有在原始圖象立方體的某處上為純粹的形式，那么這些技術(shù)不太可能會輸出準確表現(xiàn)所關(guān)心成分的豐度的圖象。有一些技術(shù)，有時叫“凸殼”算法，其在即使端項沒有以純粹形式存在于圖象時也估量真實的端項，但是效果取決于在圖象立方體中的信號光譜離端項有多近。對一些技術(shù)的另一問題是它們僅工作在非監(jiān)督的方式下，這使得用從樣品的知識中得到的信息來指引它們到正確的方向上的機會更小。當這些技術(shù)的大多數(shù)被用于生命科學的樣品，代表成分的豐度的輸出圖象經(jīng)常不與已知的樣品的生理或解剖特征密切相關(guān)。一些技術(shù)在某些情況下工作地很好，而其他技術(shù)在其他情況下工作地很好。在圖13A、13B和13C中示出的是由典型的無生命科學(例如遙感)端項檢測算法基于對圖2的老鼠的圖象立方體產(chǎn)生的示例性的成分豐度圖象。請注意到?jīng)]有輸出圖象看起來剛好對應(yīng)腫瘤或者剛好對應(yīng)皮膚中的自發(fā)熒光。在生命科學中，以及在特定的熒光應(yīng)用中，光譜特征是寬廣和平滑的，經(jīng)常橫越檢測的光譜范圍的大部分。通常，所關(guān)心的成分光譜、靶熒光，示出為對經(jīng)常更大和壓倒性的自發(fā)熒光信號的更改。用于分析樣品和決定成分的關(guān)鍵信息在于對高度重疊的光譜成分的單獨的檢測和定量。獲得這樣的信息更適于能夠在光譜形狀中實行細微偏移的技術(shù)。更適合生命科學的技術(shù)應(yīng)該首先善于拋棄最大的成分，自發(fā)熒光，然后精確分離和量化更小的重疊的光譜成分。這些特性與無生命科學(例如遙感)的應(yīng)用的那些有明顯的不同。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種對精確估量深部組織成象的純粹光譜起作用的方法是，對較容易獲得的一個成分的純粹光譜使用一個估量并使用它幫助從兩個成分都出現(xiàn)的圖象立方體中的數(shù)據(jù)中顯露出另一成分的純粹光譜。這一點的實行包括計算剩余光譜技術(shù)，其將在下面被更詳細地描述。剩余技術(shù)一些用于降低自發(fā)熒光并沒有對靶化合物光譜有先驗知識的技術(shù)包括，考慮對給定象素的信號光譜S( λ )，從它減去自發(fā)熒光F( λ )的最大量同時使剩余的信號在所有光譜波導中是正定的。就是說，技術(shù)人員對每個象素定義一個所謂的剩余光譜Ra(A)Ra(A) = S(A )-aF(A ) [5a]
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然后選擇參數(shù)a的最大值與具有在每個光譜波道中的非負值的RaU)相一致。然后得到的光譜RaU)被用作擦去了自發(fā)熒光的信號光譜。技術(shù)人員也可以不基于上面列舉的嚴格的非負準則，而是合并小的負的分布的一些相關(guān)準則來進行對參數(shù)“a”的確定，以考慮對例如散粒噪聲或檢測器噪聲的這樣的因素。用于去掉自發(fā)熒光光譜的最大數(shù)量的最優(yōu)化準則的另外的例子包括使用不同的誤差函數(shù)，下面會更詳細地描述其中的一些。可選擇的，技術(shù)人員可以尋求當靶化合物的發(fā)射光譜是已知而自發(fā)熒光光譜是未知的時候通過類似的方法，通過尋求從S(X)中減去與正的剩余相一致的靶發(fā)光G(X)的最大數(shù)量，然后匯報在每個象素上減去的數(shù)量作為靶化合物的圖象，來確定靶化合物的分布。在這種情況中，給出對每個象素的剩余光譜Rb(X)如下Rb ( λ ) = S ( λ ) -bG ( λ ) [5b]其中技術(shù)人員選擇參數(shù)b的最大值與在每個光譜波道中具有非負值的RbU)相一致。另外，上面描述的與方程如和恥有關(guān)的剩余技術(shù)可以被擴展到已知樣品的一個或更多額外成分的光譜且技術(shù)人員想要去掉它們對信號的貢獻時的情況。在這種情況中， 剩余光譜被重寫以基于該額外光譜并符合在每個光譜波道中正的剩余，從觀察到的信號中減去每個這樣的成分的貢獻。剩余技術(shù)假定提供了對成分光譜至少其中之一的初始估量。其可以通過前面的知識或測量而提供，或者其可基于圖象立方體數(shù)據(jù)本身而確定。在后面的情況中，其可以由用戶的引導(即監(jiān)督技術(shù))或者沒有用戶的引導(即無監(jiān)督技術(shù))而確定。例如使用者可以能夠識別光譜圖象立方體的其中一個成分名義上被隔絕的至少一個區(qū)域，由此從在該區(qū)域的數(shù)據(jù)上確定對該成分的純粹光譜(例如，通過平均來自在該區(qū)域的象素的信號光譜)。在另一例子中，沒有用戶的引導，可以假定因為自發(fā)熒光會主宰圖象立方體中的光譜信息，技術(shù)人員可以只是簡單地平均在每個象素中的光譜信息以確定對自發(fā)熒光的純粹光譜的估量。此外，可以在一個、一些或所有象素上計算剩余光譜。例如，在上面描述的兩個成分的情況中，可以從每個象素中的剩余光譜直接構(gòu)建深部組織圖象，其現(xiàn)在假定為僅與靶化合物相關(guān)。然而，在其他例子中，可以對僅一個或一些象素計算剩余光譜作為用于估量純粹光譜的更復雜的處理的一部分。另外，剩余技術(shù)可以應(yīng)用到從圖象立方體中獲得的預處理數(shù)據(jù)集上。例如，來自圖象立方體中一些或所有象素的信號光譜可以被平均以產(chǎn)生隨后剩余技術(shù)被應(yīng)用的已處理信號光譜。下面的同樣涉及計算剩余光譜更詳細的技術(shù)，說明這些各種各樣的可能性。這些技術(shù)即使對表現(xiàn)更難的樣品的圖象立方體也能起作用，這些樣品是技術(shù)人員在熒光體內(nèi)成象、熒光顯微鏡方法和明視場顯微鏡方法中會遇到的。剩余技術(shù)的更具體的例子步驟1 確定成分的數(shù)量在用于獲得純粹光譜的一些技術(shù)中第一個步驟是確定在給定樣品中出現(xiàn)了多少成分。一些剩余技術(shù)包括一自動步驟以描畫或識別樣品中的表現(xiàn)出或顯示出很可能是單獨的成分的位置的區(qū)域。剩余技術(shù)能夠無監(jiān)督操作，或者用使用者提供的光譜作為起點。在無監(jiān)督模式中，第一迭代使用在圖象立方體中的所有信號光譜的平均值作為要被減去的第一“光譜矢量”。 在每個象素上完成最優(yōu)擬合近似以確定能向光譜矢量分配的象素的信號光譜的數(shù)量。然后這個數(shù)量的光譜矢量被從圖象立方體中減去，并產(chǎn)生表現(xiàn)被減去的數(shù)量的成分圖象。在隨后的迭代中，假定最高強度的區(qū)域(在減去后)為下一個光譜最純粹成分并使用這些區(qū)域以獲得下一個光譜矢量。(在一象素位置處的“強度”由對在該象素處所有波長的信號光譜求積分來計算。)被完成的減去光譜矢量的迭代次數(shù)可以被預先指定，或者可以繼續(xù)下去知道剩下的剩余信號的量減少到指定百分比以下。這種方法具有這樣的優(yōu)點即，“剝離”并放入到單獨的成分圖象中的光譜差異經(jīng)常是非常接近來自成分的純粹光譜。在并非是這樣的情況中，一些使用者輸入可能能夠引導它。例如，如果第一光譜矢量是整個圖象立方體的平均光譜并且并不接近成分光譜之一，這種情況對例如用剃光的老鼠而不是裸鼠時可能會發(fā)生，那么使用者可以在圖象中指向應(yīng)該是自發(fā)熒光的那里，而處理可以使用它作為第一光譜矢量。圖14A、14B和14C示出由在對圖2的老鼠的圖象立方體上的由上述的無監(jiān)督迭代剩余技術(shù)產(chǎn)生的輸出圖象。請注意到這些第一三個成分對應(yīng)解剖上有意義的特征-來自皮膚的自發(fā)熒光圖象(圖14A)、來自毛囊周圍皮脂的自發(fā)熒光圖象(圖14B)，及來自其他成分的相對較低信號的被標記的腫瘤圖象(圖14C)。這種光譜成分分解技術(shù)在用于提供成分圖象其向使用者表示出最有意義的成分在哪里和表示出圖象光譜應(yīng)該被從哪里選取以作為進入下一迭代的輸入，是有用的。有時分解的成分光譜足夠接近實際光譜而成為對純粹成分光譜的良好估量。如果情況是這樣， 由迭代剩余技術(shù)產(chǎn)生的成分圖象對任何計劃的定量分析例如腫瘤測量或協(xié)同定位測定，都足夠純粹。然而，有時因為初始的光譜矢量使用來自整個圖象的平均光譜，以及成分圖象表現(xiàn)了成分的一些混合，分解的成分光譜不是足夠精確。步驟2 計算純粹成分光譜在確定了在給定樣品中出現(xiàn)了多少成分之后，可以使用從圖象立方體數(shù)據(jù)使用來自步驟1中的迭代剩余技術(shù)的成分圖象選取的光譜來計算純粹成分光譜。一種進行這一點以及進一步改進信號的精確分配到合適的成分圖象中的方法是， 使用來自步驟1的成分圖象作為進一步分析的引導。換句話說，步驟1提供了對純粹光譜的初始估量并基于那些初始估量提供了成分圖象，其然后可被用于改進對純粹光譜的初始估量。例如使用者可以基于對樣品的知識，該樣品被認為是表現(xiàn)了預期的成分(例如包括特定靶化合物的成分)以及與該預期成分公共定位的自發(fā)熒光成分，從步驟1中的迭代剩余技術(shù)中選擇成分圖象。使用者首先使用成分圖象來選擇圖象立方體的對應(yīng)沒有預期成分的自發(fā)熒光成分的區(qū)域(例如，一組一個或更多毗鄰或不毗鄰的象素)，其被指定為光譜 “A”。然后使用者使用該成分圖象來選擇示出與該共同定位的自發(fā)熒光在一起的大強度的預期成分(例如腫瘤)的一區(qū)域的一個或更多象素，其被指定為光譜“A+B”。然后這些區(qū)域被用于表示在圖象立方體數(shù)據(jù)中的象素位置，從圖象立方體數(shù)據(jù)中提取剩余技術(shù)使用的光譜“Α”\( λ)和光譜A+B”Sa+bU)。對于多個所希望的分量這個過程可以重復。近似的量Q的剩余技術(shù)使用最優(yōu)化誤差函數(shù)出現(xiàn)在SA+B( λ)中。這個 Sa(A)的量然后被從Sa+bU)中減去以留下最優(yōu)值被用于估量純粹光譜“Β”&(λ)的差值光譜Δ ( λ )(有一個光學偏移常數(shù)C)。該差值光譜給出為Δ (λ) = Sm(X)-QSaU)+C [6]剩余技術(shù)通過最小化一誤差函數(shù)，對Q = Qopt以及可選擇的C = C°pt確定最優(yōu)值?？梢允褂酶鞣N可能的誤差函數(shù)的任何一種。一個示例性的誤差函數(shù)θι·Γι(Δ)(其中 Δ ε Δ (λ)隱含地為λ的函數(shù))給出為err^A) = (θ"δ+1) Δ2 [7]該剩余技術(shù)使erri在λ上的平均值最小化。選擇此誤差函數(shù)Kr1 ( Δ )以偏愛正的Δ值，因為負的光譜在物理上是不相容的?？蛇x擇的，最小均方差(MMSE)準則 (例如err2(A) = Δ2)可以和Δ為正的約束條件一起使用。然而，這樣的嚴格約束條件對應(yīng)與特定類型的最小化技術(shù)可能不相容的間斷的誤差函數(shù)。也可以進行其他修正。例如，歸一化的誤差函數(shù)err3(A) = θγΓι ( Δ ) / [SA+B ( λ )+SA( λ ) ][8]可以被用于對由具有相同的相對量的較大數(shù)值的SA+BU)引起的較大數(shù)值的erri(A)進行修正。其大小在噪聲閾值之下的erri(A)(或err3(A))的值可以被設(shè)定為零。一旦已經(jīng)計算了最優(yōu)化值Q°pt和C°pt，則如下所示計算純粹光譜λ )Sb(A) = SA+B( λ )-Q-Sa( λ ) +Copt [9]步驟3 使用純粹成分光譜不混合在純粹成分光譜在步驟2中被確定以后，可以使用這些純粹成分光譜在圖象立方體數(shù)據(jù)上完成不混合。在簡單的系統(tǒng)中如果已經(jīng)知道成分，這有時是有效的。然而，在某些情況中因為它假定所有測得的信號屬于一個或另一個成分圖象，從而使不混合的圖象中的信號之和等于總的檢測到的信號，它可能不是最理想的。如果在圖象立方體中特定象素處的光譜由比確定的純粹成分光譜表現(xiàn)出來的更多的成分組成，那么未料到的成分可以并很可能會被不精確地分配到靶化合物圖象中。為了解決這一問題，可以以“有監(jiān)督”的方式來使用步驟1中的迭代剩余技術(shù)，其中來自步驟2的光譜被用作到每個迭代中的輸入以“剝出”成分圖象。每個迭代產(chǎn)生與被用作那個迭代的輸入的光譜相對應(yīng)的成分圖象。這樣具有的優(yōu)點是它不會強加100%的總和，而留下留在殘余圖象中的那些以用于進一步的處理，如果希望的話。在圖15A和15B中示出了這種方法能起多大作用的例子。圖15A示出在越過腫瘤區(qū)域上具有相同強度的自發(fā)熒光，顯示出信號是精確分配在正確的圖象中的。圖15B示出被標記的腫瘤，看起來與其他熒光成分很好地隔開?？梢砸愿鞣N方式來配置這種能力以提供非常有效的檢查和分析樣品的工具。例如，它可以被配置為從數(shù)據(jù)集中去掉成分，當它們被使用者用輸入裝置(例如鼠標)指出時?？梢匀サ艟哂邢嗤庾V記號的不僅在使用者選定位置的光譜成分以及在圖象立方體的其他位置上的光譜成分。對選定成分的光譜可以使用步驟2予以確定，并如步驟3所述那樣被去掉。而且，包含了沒使它進入成分圖象的信號的殘余圖象可以被檢查以看出是否有沒預料到或不知道的其他成分。它們本身的以及在任何組合中的任何步驟都是有用的。步驟1和2在許多情況中本身具有價值。
圖16是處理1600的流程圖，該處理說明在上面步驟1處理中的迭代剩余技術(shù)。處理1600提取可用于從圖象立方體數(shù)據(jù)計算純粹成分光譜的光譜矢量。得到的純粹成分光譜可用作輸入光譜，起用于不混合及/或儲存用于在光譜數(shù)據(jù)庫中以后的使用。使用者或者通過從樣品中獲得數(shù)據(jù)，或者通過載入前面獲得的圖象立方體數(shù)據(jù)，而提供1602圖象立方體數(shù)據(jù)。然后，用各種方法中的任何方法提供第一光譜矢量。使用者可以從光譜庫(例如表現(xiàn)各種類型的對要被成象的樣品的類型的自發(fā)熒光的光譜庫)中選擇1604第一光譜矢量。使用者可以從研究區(qū)(ROI)基于表現(xiàn)自發(fā)熒光(例如在圖象立方體中的一個圖象)的圖象選擇1606第一光譜矢量。使用者可以從前面獲得的圖象立方體選擇1608第一光譜矢量?？蛇x擇的，處理1600從圖象立方體數(shù)據(jù)自動確定1610第一光譜矢量(例如通過求來自所有象素的信號光譜的平均值來計算“平均光譜”)。然后處理1600在圖象立方體上完成非負的約束不混合以確定1612對每個象素的量，其表現(xiàn)要被從該象素的信號光譜中減去的當前的光譜矢量的數(shù)量。在每個象素上，處理1600從能被減去又不會使得到的剩余光譜在任何波長上變負的信號光譜上減去1614當前光譜矢量的最大量。處理輸出1616成分圖象其表現(xiàn)在每個象素上被減去的當前的光譜矢量以及能在后面的處理(例如在成分圖象中提供的信息可用于定位優(yōu)選的用于輸入到 PCSC處理的光譜)中使用的對應(yīng)的當前的光譜矢量的數(shù)量。然后處理1600從一組在得到的“剩余圖象立方體”(例如一圖象立方體其具有如上計算的作為信號光譜的剩余光譜)中表現(xiàn)最大“誤差”的一個或更多象素確定下一個光譜矢量。例如，處理1600選擇1618下一個光譜矢量作為在剩余圖象立方體中最強烈的N 個象素(例如N= 2 的光譜的平均。可選擇的，處理1600選擇最強烈的N個象素并然后選擇該N個象素的子集R，其在最強烈的N個象素的指定光譜角距離θ內(nèi)。處理1600重復這些步驟1612、1614、1616和1618，直到已經(jīng)達到最小強度水平或者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)指定數(shù)量的光譜矢量1620。另外的實施例上面的技術(shù)可以應(yīng)用到更寬范圍的深部組織樣品中，包括，例如，活的有機體、哺乳動物(例如人、嚙齒動物等)、皮下組織、器官等等。例如樣品也可以使在水性樣品場所的斑馬魚。一般地說，上面的技術(shù)，例如用于估量純粹光譜的技術(shù)，可以用于無深部組織的生物樣品，包括例如組織切片、細胞、顯微鏡載物片樣品。樣品架將取決于樣品，但除了包括用于固持動物例如老鼠的樣品架之外，它們可以包括，例如培養(yǎng)皿、微滴定盤、蛋白質(zhì)陣列、DNA陣列、凝膠盤，或者組織微陣列盤。對于體內(nèi)成象，樣品可以是研究對象或動物坐、擱放或被固定于其上的表面。當然，可以使用不同于GFP的靶化合物。例如同樣的裝置可用于觀看老鼠或其他樣品，其被轉(zhuǎn)染以表達或者黃色熒光蛋白(YFP)或是紅色熒光蛋白(RFP)或兩者并在去掉自發(fā)熒光信號以后產(chǎn)生靶化合物的圖象。也有發(fā)展出來的突變株，其也可以使用。當產(chǎn)生有用的結(jié)果時，這些中的任何都可以和GFP結(jié)合。此外，例如，靶化合物可以基于量子點，其尺寸分布被修改以提供各種光譜記號。除了可調(diào)液晶光譜濾波器，用于光譜濾波的其他實施例是可能的，包括例如，聲光可調(diào)光譜濾波器、一組光譜濾波器、光譜濾波器輪、色散棱鏡、光柵、分光計，或者單色儀。例如，技術(shù)人員可以使用包含多個帶通濾波器的電動濾波器輪。又一實施例可以使用來自 Optical Insights (Tucson, AZ)的雙象系統(tǒng)一次在四個光譜波段上觀看樣本，雖然空間分辨率較低。波段被選擇以給出在靶化合物和背景自發(fā)熒光之間有所區(qū)別的光譜，即具有明顯不同于1的cos θ，優(yōu)選為0. 8或更小。也有許多用于獲得光譜解析圖象的技術(shù)。例如，一些這樣的技術(shù)包括“光柵掃描” 系統(tǒng)其中每個象素被照明并獲得發(fā)射光譜，通過順序探測每個象素獲得圖象；“推帚”系統(tǒng)， 其中通過從一排或一條樣品中取發(fā)射光線從一排樣品中獲得光譜，并輸入它通過成象光柵以獲得來自樣品的一排光譜，然后沿成象系統(tǒng)下面移動樣品(或者成象系統(tǒng)在樣品上移動)而獲得另一排直到建立圖象；以及“真實成象”系統(tǒng)，其取樣品的光譜解析圖象。此外，當上面的技術(shù)和分析集中在來自樣品的光線被光譜濾波以在選定成分之間區(qū)分開的情形時。同樣的算法可以應(yīng)用到用于照明樣品的光線被光譜濾波以在選定成分之間區(qū)分開的情形。換句話說，除了注重樣品中的不同成分的發(fā)射光譜，技術(shù)人員可注重樣品中的不同成分的激發(fā)光譜。在這樣的實施例中，從樣品的特定區(qū)域測得的光線被光譜解析為對于激發(fā)光線的不同的光譜加權(quán)函數(shù)的函數(shù)。用于光譜不混合的基本原理保持不變， 然而，因為對每個光譜加權(quán)函數(shù)測得的光線的強度會根據(jù)這些成分在對應(yīng)該光譜加權(quán)函數(shù)處被光線激發(fā)的程度而包括來自不同成分的貢獻。例如，圖17示出光譜成象系統(tǒng)100’，其包括用于在多重激發(fā)波長波段之間切換的激發(fā)側(cè)光譜濾波器1700。得到的圖象立方體數(shù)據(jù)可以象上面描述那樣被處理，其中例如在方程[1]中的波長λ被用于表示給定的激發(fā)波長(或波長波段)。用于這種技術(shù)的照明源可以是寬帶源其然后象上面描述那樣被光譜濾波，或者可以是具有不同光譜發(fā)射的源的陣列，例如LED或二極管陣列。這種技術(shù)也在美國申請?zhí)?0/226，592(公開號US-2003-0081204-A1)中得到進一步的描述，其在此并入作為參考。其他也可以使用的用于提供激發(fā)光線的技術(shù)如在美國申請?zhí)?0/163，233(公開號 US-2003-0223248-A1)中描述的，其在此并入作為參考。另外，在一些實施例中，可以收集數(shù)據(jù)作為激發(fā)和發(fā)射波長這兩者的函數(shù)。雖然是按照測量熒光來描述上面的技術(shù)，同樣的技術(shù)可以被應(yīng)用以基于其他類型的光測量來確定一個或更多靶化合物的濃度。光發(fā)射現(xiàn)象可以基于任何熒光、透射、反射、 散射、拉曼散射，或磷光。例如，可以從Menlo Park，加利福尼亞的Nanoplex Technologies Inc.，(www. nanoplex. com)得到的納米顆?？捎糜谔峁├l(fā)射的靶化合物。一些這樣的測量可以包括將測得的信號轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌麊挝?。重要的是該測量提供有用的光譜信息以將想要的對應(yīng)靶化合物的信號與其他信號成分區(qū)分開來，因而提高測量的完整性和靈敏度。例如，一些實施例涉及光線傳輸通過吸收性的介質(zhì)。在這種情況下，測得的光線的強度以對靶化合物的濃度的指數(shù)關(guān)系減少。然而，轉(zhuǎn)換成“光學密度”(例如通過使用對數(shù)函數(shù))使得可以進行線性不混合技術(shù)。這種光學密度技術(shù)在美國申請?zhí)?0/226，592(公開號US-2003-0081204-A1)中得到進一步的描述，其在此并入作為參考。其他實施例可包括基于在幾個選定的波長或波長波段上的亮度比的測量。用于估量純粹光譜的實施例也可以包括無監(jiān)督技術(shù)，例如群集分析。群集分析通過將光譜分成群來識別樣品的具有相似光譜響應(yīng)的區(qū)域，使得在群內(nèi)的光譜響應(yīng)差異為最小，同時使在光譜響應(yīng)的群之間差異最大。在這一實現(xiàn)過程中，群集分析的結(jié)果包括，對每個群的群心光譜(即對該群的加權(quán)平均光譜)，以及對應(yīng)的群成員地圖(即群的空間分布)。放在一起，它們回答了兩個通常提出的關(guān)于光譜成象的問題不同類型的光譜出現(xiàn)在哪里，以及該光譜的光譜特征是什么。一旦通過探索性的無監(jiān)督分析識別出帶有特定成分的區(qū)域，可以使用有監(jiān)督分選器更徹底地調(diào)查這些成分的位置。用于有監(jiān)督分選器的訓練集光譜可以被從由無監(jiān)督分析識別為包含特定成分的區(qū)域中提取出來，或者可以使用對樣品的組成的先前的知識從數(shù)據(jù)集中選擇它們。然后有監(jiān)督的分選器可以通過定位具有與訓練光譜相匹配的光譜輪廓的區(qū)域來提純圖象的分段。無監(jiān)督分析，結(jié)合有監(jiān)督分選器，提供了一種沒有對樣品中出現(xiàn)的成分的數(shù)量和性質(zhì)有先驗了解時定位組成成分的方法。另外，使用為訓練集選擇的光譜作為在庫光譜搜尋程序中的靶也能使得可以進行成分的自動識別。有監(jiān)督圖案識別方法可能更適合臨床或產(chǎn)業(yè)上有用的數(shù)據(jù)分析方法的發(fā)展。有監(jiān)督圖案識別技術(shù)例如線性判別分析(LDA)或神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)利用了研究者經(jīng)常已經(jīng)具有相當數(shù)量的可得到的光譜數(shù)據(jù)(或是生化的或臨床的)這一事實。例如，研究者可能知道光譜產(chǎn)生自明確的樣品成分或組織類型。然后此信息可用于訓練一 LDA算法以識別在光譜中的變量(峰值頻率、帶寬、相對強度等)的特殊組合，其為這些樣品成分或組織類型的特征。樣品圖象的光譜分析和構(gòu)建可以在硬件或軟件或兩者的結(jié)合中完成。可以使用標準的編程技術(shù)遵循此處描述的方法在計算機程序中完成電子處理。程序代碼被應(yīng)用到輸入數(shù)據(jù)以完成在此處描述的光譜不混合功能及產(chǎn)生輸出信息例如樣品圖象。該輸出信息被施加到一個或更多輸出裝置例如顯示監(jiān)視器。每個程序優(yōu)選為在高水平的程序性或面向?qū)ο蟮木幊陶Z言中完成以與一計算機系統(tǒng)通訊。然而，該程序可以在匯編語言或機器語言中完成，如果希望的話。在任何情況中， 語言可以是編譯過的或翻譯過的語言。此外，該程序可以在為該目的而預編程序的專用的集成電路上運行。每個這樣的計算機程序優(yōu)選為存儲在可由一般的或特殊用途編程的計算機讀取的儲存介質(zhì)或裝置(例如CD-ROM或磁盤)上。用于在該儲存介質(zhì)或裝置被計算機讀取時設(shè)定和操作該計算機以完成此處描述的過程。計算機程序也可以在程序執(zhí)行期間駐留在高速緩沖存儲器或者主存當中。例如，圖1中的計算機180可以包括處理器、輸入/輸出控制卡、用戶界面例如鍵盤和監(jiān)視器，以及存儲器。儲存在計算機可讀介質(zhì)中的程序被儲存在計算機的存儲器中，當被執(zhí)行時，該程序使處理器執(zhí)行分析光譜濾波圖象的步驟。其他的方面、特征和優(yōu)點在下面的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種裝置，包括構(gòu)建為支撐樣品的樣品架； 照明樣品的照明源；安置以檢測來自樣品的光線的檢測器；及耦合到檢測器上的電子處理器，其中該電子處理器構(gòu)建為(i)提供關(guān)于從樣品的不同空間位置來的光線的光譜解析信息，其中該光線包括來自樣品中的不同成分的貢獻，該光譜解析信息包括關(guān)于其中用于照明樣品的光線被光譜濾波的一組圖象的信息，并且對每個圖象的光譜濾波對應(yīng)不同的光譜加權(quán)函數(shù)；( )對至少一些不同空間位置上的每一個分解該光譜解析信息為來自對至少樣品中的成分的第一個的純粹光譜的光譜估量的貢獻；及(iii)基于該分解構(gòu)建樣品的圖象以優(yōu)先示出一個選定的成分， 其中分解包括基于對應(yīng)第一組一個或更多不同空間位置的光譜解析信息和對成分的第二個的純粹光譜的光譜估量獲得對第一成分的純粹光譜的估量；以及，其中純粹光譜的光譜估量對應(yīng)于將得到的光譜解析信息，只要對應(yīng)于該光譜估量的成分對光線作出貢獻，而且，純粹光譜的光譜估量包括多個值。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，還包括安置在照明源和樣品之間的光譜濾波裝置，以對用于照明樣品的光線進行光譜濾波。
3.如權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于該光譜濾波裝置包括液晶可調(diào)光譜濾波器、 聲光可調(diào)光譜濾波器、一組光譜濾波器、光譜濾波器輪、色散棱鏡、光柵、分光計或單色儀。
4.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于照明源提供可調(diào)激發(fā)光。
5.一種裝置，包括構(gòu)建為保持包括深部組織的樣品的樣品架，其中該深部組織支撐靶化合物； 構(gòu)建為照明樣品以使它發(fā)出輻射的照明源，其中發(fā)出的輻射包括來自靶化合物的發(fā)光和來自樣品中的一個或更多其他成分的發(fā)光；構(gòu)建為將對檢測器發(fā)出的輻射成象的成象系統(tǒng)；光譜濾波裝置，其構(gòu)建為用多個不同的光譜加權(quán)函數(shù)的每一個對發(fā)出的輻射或者對用于照明樣品的照明源的光線進行光譜濾波；檢測器，其構(gòu)建為對每個光譜加權(quán)函數(shù)檢測所發(fā)出的輻射的圖象；及電子處理器，其構(gòu)建為(a)處理儲存的圖象以確定在樣品的多個不同空間位置的每一個上來自與靶化合物和至少一個或更多其他成分相關(guān)的光譜估量的貢獻；以及(b)構(gòu)建樣品的深部組織圖象，其中來自其他成分的信號相對于來自靶化合物的信號被減小。
6.如權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于樣品架構(gòu)建為保持動物。
7.如權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于成象系統(tǒng)具有大于或等于1的縮小率。
8.如權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于成象系統(tǒng)構(gòu)建為對一視場成象，該視場具有在檢測器上大于2cm的對角線尺寸。
9.如權(quán)利要求5所述的裝置，其中，所述光譜濾波裝置位于樣品和檢測器之間，以對所發(fā)出的輻射進行光譜濾波。
10.如權(quán)利要求9所述的裝置，其中，所述光譜濾波裝置包括液晶可調(diào)光譜濾波器、聲光可調(diào)光譜濾波器、一組光譜濾波器、光譜濾波器輪、色散棱鏡、光柵、分光計或單色儀。
11.如權(quán)利要求5所述的裝置，其中，所述光譜濾波裝置位于樣品和檢測器之間，以對用于照明樣品的照明光線進行光譜濾波。
12.如權(quán)利要求11所述的裝置，其中，所述光譜濾波裝置包括液晶可調(diào)光譜濾波器、聲光可調(diào)光譜濾波器、一組光譜濾波器、光譜濾波器輪、色散棱鏡、光柵、分光計或單色儀。
全文摘要
本發(fā)明特征在于一種方法，包括(i)提供關(guān)于從包括深部組織的樣品的不同空間位置響應(yīng)于對樣品的照明來的光線的光譜解析信息，其中該光線包括來自樣品中的不同成分的貢獻；(ii)對至少一些不同空間位置上的每一個分解該光譜解析信息為來自與至少樣品中的一些成分有關(guān)的貢獻；及(iii)基于該分解構(gòu)建樣品的深部組織的圖象以優(yōu)先示出一選定成分。
文檔編號G01J3/44GK102266219SQ20111016652
公開日2011年12月7日 申請日期2004年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月23日
發(fā)明者保羅.J.克羅寧, 克利福德.C.霍伊特, 柯克.W.戈西奇, 理查德.M.利文森 申請人:劍橋研究和儀器設(shè)備股份有限公司