專利名稱：馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥分析技術(shù)領(lǐng)域，用于松針?biāo)幉牡蔫b別及成分比較，尤其涉及馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜(GC)指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
馬尾松(Pinus massoniana Lamb.)是我國(guó)亞熱帶南部潮濕地區(qū)分布最廣的樹(shù)種。 干燥的馬尾松針葉作為一味常用中藥，《本草綱目》上記載“松針，氣味苦、溫，毒，久服令人不老，輕身益氣，主治風(fēng)濕瘡，生毛發(fā)，安五臟，守中，不饑延年?！爆F(xiàn)代研究表明，松針具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，加之資源豐富，再生速度快，因而日益受到人們的重視。有研究從馬尾松松針?biāo)逡旱恼〈疾课环蛛x得到了 5個(gè)化合物(鄭曉珂，馮衛(wèi)生，王彥志，等.松針的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2004,39(11) 820).但有關(guān)不同產(chǎn)地松針的成分研究未見(jiàn)報(bào)道。本專利申報(bào)前期已通過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)篩選出了松針鎮(zhèn)靜催眠有效部位，并開(kāi)展了松針?biāo)幉牡某煞盅芯?，已初步分析得到了馬尾松針的揮發(fā)性成分譜。目前對(duì)馬尾松針揮發(fā)油中的有效成分，中國(guó)藥典2010年版一部尚無(wú)規(guī)定。鑒于藥典(2010年版，一部)中未收載有關(guān)松針的標(biāo)準(zhǔn)；目前尚未見(jiàn)有關(guān)馬尾松針揮發(fā)油成分GC分析的文獻(xiàn)報(bào)道。故發(fā)明一項(xiàng)既能夠快速準(zhǔn)確地進(jìn)行馬尾松針揮發(fā)油成分分析的方法，同時(shí)在某種程度上能夠反映藥材的品質(zhì)的分析方法，具有重要的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值及實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決松針?biāo)幉牡蔫b別及成分比較存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜(GC)指紋圖譜的建立方法，本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供采用上述的氣相色譜(GC)指紋圖譜對(duì)馬尾松藥材及其制劑進(jìn)行鑒別和含量差異分析。 本發(fā)明的指紋圖譜方法分析馬尾松針中揮發(fā)油成分，以石竹烯為參照物，采用GC法，建立馬尾松針揮發(fā)油的氣相色譜指紋圖譜，并對(duì)不同產(chǎn)地的馬尾松針揮發(fā)油成分進(jìn)行比較，為馬尾松藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)，達(dá)到準(zhǔn)確使用藥材，嚴(yán)格區(qū)分其他混淆品的目的。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，該方法包括以下的步驟1)對(duì)照品溶液的制備精密吸取石竹烯對(duì)照品，配制成石竹烯對(duì)照品溶液；2)供試品溶液制備鮮松針采集后，按照揮發(fā)油提取法，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分，連接回流冷凝管，加熱蒸餾，放冷，分取揮發(fā)油層，讀取體積數(shù)后脫水，定容，搖勻，即得供試品溶液；3)氣相色譜分析采集不同產(chǎn)地的松針?biāo)幉亩嗯?，按照步驟2、制備得到供試品溶液，分別進(jìn)樣， 進(jìn)行色譜分析，得到氣相色譜圖；4)松針揮發(fā)油氣相指紋圖譜中共有峰的標(biāo)定通過(guò)對(duì)上述不同產(chǎn)地松針供試品溶液的氣相色譜分析，對(duì)步驟4)所得氣相色譜圖進(jìn)行分析，得到氣相色譜圖；結(jié)果顯示各樣品中大部分成分的色譜峰均出現(xiàn)在保留時(shí)間 5 20min之間，色譜峰分離良好，其中17個(gè)色譜峰為所有供試品所共有的特征峰，其中6 號(hào)為石竹烯，將其作為參比峰；5)松針揮發(fā)油氣相指紋圖譜分析結(jié)果通過(guò)對(duì)上述不同產(chǎn)地松針樣品的氣相色譜分析，松針指紋圖譜特征如下上述樣品的色譜圖中均出現(xiàn)1-17號(hào)峰，其中6號(hào)與石竹烯對(duì)照品色譜圖石竹烯的保留時(shí)間相同； 以石竹烯對(duì)照品保留時(shí)間為參照，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于1.0%，所有樣品中，共有指紋峰峰面積之和占總峰面積之比值均大于69 %。作為優(yōu)選的方法，上述的步驟1)中先將石竹烯對(duì)照品置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，搖勻，制得石竹烯儲(chǔ)備溶液，再精密吸取上述石竹烯儲(chǔ)備溶液，置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1 μ g/mL的石竹烯對(duì)照品溶液。作為優(yōu)選的方法，上述的步驟2、中鮮松針采集后，切成2cm長(zhǎng)小段，陰干至含水量 8%以下，密封保存，精密稱取松針小段，置揮發(fā)油提取器中，加水1L，浸泡10h，然后進(jìn)行提取。作為優(yōu)選的方法，上述的步驟幻中脫水采用無(wú)水硫酸鈉脫水，揮發(fā)油溶解、定容
采用二氯甲烷。作為優(yōu)選的方法，上述的步驟3)中氣相色譜條件如下氫火焰離子化檢測(cè)器FID，HP-5ms色譜柱，30mX0. 32mmX0. 25 μ m，載氣為恒流流速的高純He 1. OmL/min，燃?xì)鉃镠2 :250mL/min，助燃?xì)鉃榭諝?50mL/min ；采用分流進(jìn)樣方式，分流比為50 1 ；進(jìn)樣量為1. 0μ L ；氣化室溫度為280°C ；柱溫程序升溫初溫為50°C，停留2min，以10°C /min升至170°C，保持8min，以 50C /min 升至 250°C，保持 2min ；氫火焰離子化檢測(cè)器的檢測(cè)溫度為300°C。作為優(yōu)選的方法，上述的步驟3)中采用8 15批次不同產(chǎn)地的松針?biāo)幉摹Ｗ鳛樽顑?yōu)選的方法，上述的步驟幻中采用10批次不同產(chǎn)地的松針?biāo)幉摹Ｗ鳛閮?yōu)選的方法，上述的步驟4)中1-17號(hào)色譜峰分別為色譜圖中保留時(shí)間 7. 426min、8. 118min、8. 916min、10. 758min、ll. 406min、14. 083min、14. 556min、14. 823min、 15. 023minU5. 288minU5. 413minU6. 656minU7. 299minU7. 826minU8. 422min> 18. 798min、25. 699min 的色譜峰。為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案馬尾松藥材及其制劑的鑒別方法，該方法采用上述任意一項(xiàng)技術(shù)方案所述的方法建立的氣相色譜-指紋圖譜。馬尾松藥材及其制劑的含量差異分析方法，該方法采用上述任意一項(xiàng)技術(shù)方案所述的方法建立的氣相色譜-指紋圖譜。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，優(yōu)點(diǎn)在于1、中國(guó)藥典2010年版一部中未收載馬尾松，其他國(guó)家及地方標(biāo)準(zhǔn)均無(wú)馬尾松針?biāo)幉臉?biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容；馬尾松針作為近年來(lái)廣泛應(yīng)用的藥材資源，有必要研究并制訂其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，馬尾松針的揮發(fā)油GC指紋圖譜作為馬尾松的鑒別及含量差異分析方法，是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容。本發(fā)明與及文獻(xiàn)方法相比，方法快速，簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均很好，特征性強(qiáng)，能夠作為松針鑒別的依據(jù)，并為馬尾松藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。2、本發(fā)明方法先進(jìn)，采用GC法，建立了馬尾松揮發(fā)油的氣相色譜指紋圖譜。3、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，所使用的儀器設(shè)備和材料普及性好，便于藥材種植、加工及銷售企業(yè)推廣應(yīng)用。


圖1為產(chǎn)地為浙江臨安的松針揮發(fā)油色譜圖，圖中6號(hào)峰為石竹烯。圖2為石竹烯對(duì)照品色譜圖。圖3為10批不同產(chǎn)地松針樣品揮發(fā)油的GC色譜疊加圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，該方法包括以下的步驟1)精密吸取并稱量0. 05mg竹烯對(duì)照品，置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度， 搖勻，制得石竹烯儲(chǔ)備溶液，再精密吸取石竹烯儲(chǔ)備溶液0. 5mL，置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，搖勻，即制備得到質(zhì)量濃度為1 μ g/mL的石竹烯對(duì)照品溶液；2)采集松針(產(chǎn)地浙江臨安)，切成2cm小段后陰干，精密稱取松針小段50g，置揮發(fā)油提取器中，加水1L，浸泡10h，按照揮發(fā)油提取法O010版中國(guó)藥典一部附錄》))，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分，連接回流冷凝管，加熱蒸餾2.證，放冷，分取揮發(fā)油層，讀取體積數(shù)為0. 30mL，加0. 2g無(wú)水硫酸鈉脫水，通過(guò)脫脂棉濾過(guò)，揮發(fā)油用二氯甲烷溶解，脫脂棉用二氯甲烷洗滌2次，洗滌液并入揮發(fā)油溶液中，并定容至10mL，搖勻，即得到以松針?biāo)幉挠?jì)，質(zhì)量濃度為5g/mL的供試品溶液；;3)GC 條件氫火焰離子化檢測(cè)器FID，HP-5ms色譜柱(30mX 0. 32mmX 0. 25 μ m)，載氣為恒流流速的高純He :1. OmL/min，燃?xì)鉃镠2 :250mL/min，助燃?xì)鉃榭諝?50mL/min ；采用分流進(jìn)樣方式，分流比為50 1;進(jìn)樣量為1.(^1^。氣化室溫度為280°C ；柱溫程序升溫初溫為 50°C，停留 2min，以 10°C /min 升至 170°C (保持 8min)，以 5°C /min 升至 250°C (保持 2min)；氫火焰離子化檢測(cè)器的檢測(cè)溫度為300°C ；4) GC 分析取步驟2)的供試品溶液，按步驟3)的條件進(jìn)行測(cè)定。得到GC圖譜見(jiàn)圖1 ；其中1-17號(hào)色譜峰分別為色譜圖中保留時(shí)間7. 426min、8. 118min、8. 916min、10. 758min、 11. 406minU4. 083minU4. 556minU4. 823minU5. 023minU5. 288minU5. 413min>16. 656min、17. 299min、17. 826min、18. 422min、18. 798min、25. 699min 的色譜峰；17 個(gè)特征峰的峰面積之和占總峰面積之比為84. 75%。實(shí)施例2采集不同產(chǎn)地的松針?biāo)幉?0批次，按照上述的方法得到氣相色譜圖，然后進(jìn)行GC 分析。表1為10批松針共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間；表2為10批松針共有指紋峰的相對(duì)峰面積。
權(quán)利要求
1.馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)對(duì)照品溶液的制備精密吸取石竹烯對(duì)照品，配制成石竹烯對(duì)照品溶液；2)供試品溶液制備鮮松針采集后，按照揮發(fā)油提取法，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分，連接回流冷凝管，加熱蒸餾，放冷，分取揮發(fā)油層，讀取體積數(shù)后脫水，定容，搖勻，即得供試品溶液；3)氣相色譜分析采集不同產(chǎn)地的松針?biāo)幉亩嗯危凑詹襟E2)制備得到供試品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析，得到氣相色譜圖；4)松針揮發(fā)油氣相指紋圖譜中共有峰的標(biāo)定通過(guò)對(duì)上述不同產(chǎn)地松針供試品溶液的氣相色譜分析，對(duì)步驟4)所得氣相色譜圖進(jìn)行分析，得到氣相色譜圖；結(jié)果顯示各樣品中大部分成分的色譜峰均出現(xiàn)在保留時(shí)間5 20min之間，色譜峰分離良好，其中17個(gè)色譜峰為所有供試品所共有的特征峰，其中6號(hào)為石竹烯，將其作為參比峰；5)松針揮發(fā)油氣相指紋圖譜分析結(jié)果通過(guò)對(duì)上述不同產(chǎn)地松針樣品的氣相色譜分析，松針指紋圖譜特征如下上述樣品的色譜圖中均出現(xiàn)1-17號(hào)峰，其中6號(hào)與石竹烯對(duì)照品色譜圖石竹烯的保留時(shí)間相同；以石竹烯對(duì)照品保留時(shí)間為參照，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1. 0%，所有樣品中，共有指紋峰峰面積之和占總峰面積之比值均大于69%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟1)中先將石竹烯對(duì)照品置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，搖勻，制得石竹烯儲(chǔ)備溶液，再精密吸取上述石竹烯儲(chǔ)備溶液，置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1 Pg/mL的石竹烯對(duì)照品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟2)中鮮松針采集后，切成2cm長(zhǎng)小段，陰干至含水量8%以下，密封保存，精密稱取松針小段，置揮發(fā)油提取器中，加水1L，浸泡10h，然后進(jìn)行提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟2)中脫水采用無(wú)水硫酸鈉脫水，揮發(fā)油溶解、定容采用二氯甲烷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟3)中氣相色譜條件如下氫火焰離子化檢測(cè)器FID，HP-5ms色譜柱，30mX0. 32mmX0. 25Mm，載氣為恒流流速的高純 He 1. OmL/min，燃?xì)鉃?H2 :250mL/min，助燃?xì)鉃榭諝?50mL/min ；采用分流進(jìn)樣方式，分流比為50:1 ；進(jìn)樣量為1. Ομ ；氣化室溫度為280°C ；柱溫程序升溫初溫為50°C，停留2min，以10°C /min升至170°C，保持8min，以5°C / min 升至 250°C，保持 2min ；氫火焰離子化檢測(cè)器的檢測(cè)溫度為300°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟3)中采用8 15批次不同產(chǎn)地的松針?biāo)幉摹?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟3)中采用10批次不同產(chǎn)地的松針?biāo)幉摹?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法， 其特征在于步驟4)中1-17號(hào)色譜峰分別為色譜圖中保留時(shí)間7. 426min、8. 118min、 8. 916minU0. 758minUl. 406minU4. 083minU4. 556minU4. 823min >15. 023min> 15. 288minU5. 413min 、16. 656min> 17. 299min> 17. 826min> 18. 422min> 18. 798min 、 25. 699min的色譜峰。
9.馬尾松藥材及其制劑的鑒別方法，其特征在于該方法采用權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法建立的氣相色譜-指紋圖譜。
10.馬尾松藥材及其制劑的含量差異分析方法，其特征在于該方法采用權(quán)利要求1 8 任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法建立的氣相色譜-指紋圖譜。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥分析技術(shù)領(lǐng)域，用于松針?biāo)幉牡蔫b別及成分比較，尤其涉及馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜(GC)指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用。馬尾松針揮發(fā)油成分的氣相色譜-指紋圖譜的建立方法，該方法包括以下的步驟1)對(duì)照品溶液的制備；2)供試品溶液制備；3)氣相色譜分析；4)松針揮發(fā)油氣相指紋圖譜中共有峰的標(biāo)定；5)松針揮發(fā)油氣相指紋圖譜分析結(jié)果。本發(fā)明與及文獻(xiàn)方法相比，方法快速，簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均很好，特征性強(qiáng)，能夠作為松針鑒別的依據(jù)，并為馬尾松藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102175807SQ20111002262
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者俞忠明, 壽旦, 張揚(yáng), 李洪玉, 章建民 申請(qǐng)人:浙江省中醫(yī)藥研究院