專(zhuān)利名稱(chēng)：整合素αVβ₃檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)的檢測(cè)方法，尤其是提供了一種應(yīng)用免疫膠 體金技術(shù)研制的整合素α νβ 3檢測(cè)試劑盒，同時(shí)還公開(kāi)了其制備方法，屬于疾病檢測(cè)技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療不孕癥以來(lái)，人類(lèi)輔助生殖技術(shù)(ART)得到飛 速發(fā)展，但胚胎著床成功率提高并不明顯。子宮內(nèi)膜容受性是胚胎著床的一個(gè)重要因素，在 不孕癥患者的治療過(guò)程中，了解子宮內(nèi)膜的容受狀態(tài)，對(duì)IVF-ET治療方案的制定有重要 的指導(dǎo)意義。判斷子宮內(nèi)膜容受性的金標(biāo)準(zhǔn)是子宮內(nèi)膜活檢，但由于這是一項(xiàng)侵入性檢查 而限制了其在IVF-ET周期中的應(yīng)用。超聲參數(shù)與激素水平對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的評(píng)價(jià)還不 十分準(zhǔn)確。因此目前需要一個(gè)合理的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性，為IVF-ET提供治療指 導(dǎo)。整合素α Vi3 JintegrinaVii3)是評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的一個(gè)可靠的分子指標(biāo)，整合 素α νβ3檢測(cè)試劑盒的研制及臨床實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，將推動(dòng)整合素0￥03在1￥ 41~中廣泛應(yīng) 用，從而提高IVF-ET的成功率，具有廣闊的市場(chǎng)前景。目前檢測(cè)整合素α νβ 3的方法包括免疫組化、ELISA、Western blot等，可用于科 學(xué)研究，但用于臨床則存在很多弊端，如操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)一種整合素α νβ 3檢測(cè)試劑盒，用于評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性。本發(fā)明還提供了整合素α νβ 3檢測(cè)試劑盒的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明提供的整合素α V β 3檢測(cè)試劑盒，在硝酸纖維素膜的兩端分別設(shè)有金標(biāo)墊 和吸收墊，金標(biāo)墊上端為樣品墊，金標(biāo)墊包被有純化的整合素α V β 3抗體膠體金偶聯(lián)標(biāo)記 物，檢測(cè)線(xiàn)包被有純化的整合素α νβ3抗體，質(zhì)控線(xiàn)包被有正常抗小鼠IgG抗體，質(zhì)控線(xiàn)側(cè) 貼有吸收墊。本發(fā)明整合素α νβ3檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟
本發(fā)明根據(jù)抗原抗體能特異結(jié)合的免疫學(xué)基本原理，將純化的整合素α Υβ 3抗體用膠 體金標(biāo)記，噴點(diǎn)于玻璃纖維膜上制備成金標(biāo)墊，將純化的整合素α νβ 3抗體和正常抗小鼠 IgG抗體分別包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上的檢測(cè)線(xiàn)處和質(zhì)控線(xiàn)處，當(dāng)被檢樣品中含有整 合素α ￥日3抗原時(shí)，則于金標(biāo)墊與膠體金標(biāo)記的整合素α νβ3抗體結(jié)合，并在吸收墊的作 用下，向前滲透泳動(dòng)，與檢測(cè)線(xiàn)上的整合素α V β 3抗體再次結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶。本發(fā)明試劑盒的使用方法如下取宮腔沖洗液標(biāo)本約Iml超聲粉碎處理后加入小 試管中，然后插入試紙條，待1-2分鐘反應(yīng)帶清晰后觀(guān)察結(jié)果(見(jiàn)圖2)。出現(xiàn)1條紅色(對(duì) 照)沉淀線(xiàn)，診斷為陰性；出現(xiàn)2條紅色(樣品和對(duì)照)沉淀線(xiàn)，診斷為陽(yáng)性，未出現(xiàn)沉淀線(xiàn) 則為無(wú)效。本發(fā)明的積極效果在于首次應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)制備整合素α Υβ 3檢測(cè)試劑盒，并擬應(yīng)用于臨床，以推動(dòng)整合素α νβ3在臨床的廣泛應(yīng)用，提高對(duì)子宮內(nèi)膜容受性判 斷的準(zhǔn)確性，可以快速，靈敏檢測(cè)特定蛋白，避免了復(fù)雜的操作，無(wú)需特殊檢測(cè)儀器，結(jié)果 易于觀(guān)察判斷，可以適應(yīng)多種檢測(cè)環(huán)境，以及多種檢測(cè)需要。并且檢測(cè)結(jié)果可以長(zhǎng)期保存， 便于對(duì)照分析?？捎糜谌庋鬯降拿庖邫z測(cè)，樣本用量極小，對(duì)操作者無(wú)毒性，對(duì)環(huán)境無(wú)污 染等。因此應(yīng)用膠體金技術(shù)研制整合素α 檢測(cè)試劑盒具有重大的社會(huì)意義和廣闊的 市場(chǎng)前景。


圖1.整合素α νβ3檢測(cè)裝置示意圖；(Α:縱切圖；B 平面圖)
1.樣品墊；2.金標(biāo)墊；3.硝酸纖維素膜；4.吸收墊；5.檢測(cè)線(xiàn)；6.質(zhì)控線(xiàn)； 圖2.整合素α νβ 3試劑盒檢測(cè)結(jié)果判定。
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改 動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1
根據(jù)圖1所示，整合素α νβ3檢測(cè)試劑盒由經(jīng)過(guò)處理的樣品墊1、金標(biāo)墊2、硝酸纖維 素膜3、檢測(cè)線(xiàn)5、質(zhì)控線(xiàn)6和吸收墊4組成，其中，金標(biāo)墊2包被有純化的整合素α νβ 3抗 體膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測(cè)線(xiàn)5包被有純化的整合素α νβ 3抗體，質(zhì)控線(xiàn)6包被有正?？?小鼠IgG抗體，質(zhì)控線(xiàn)6側(cè)貼有吸收墊4。實(shí)施例2
1、膠體金顆粒的制備取1%氯金酸溶液1ml加99 ml超純水成終濃度0. 01%的氯金 酸溶液，加熱沸騰后，取1%檸檬酸三鈉1. 6 ml 一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，繼續(xù) 加熱至溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍(lán)黑色最終變?yōu)榱良t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5 min，室溫冷卻， 補(bǔ)充失水至原體積。在透射電鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)金顆粒大小基本一致，分布均勻。測(cè)量100個(gè) 膠體金顆粒直徑，計(jì)算平均直徑約20nm。
2、免疫膠體金復(fù)合物的制備目測(cè)法確定膠體金與整合素^乂^抗體用量比例。用 0. 1 mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至8. 2，取11支潔凈試管，每管分裝膠體金 溶液(1 ml/管)。將整合素^￥03抗體逐級(jí)稀釋后(由0.5yg 5g另設(shè)對(duì)照管)，順序 加入一系列裝有1 ml膠體金的試管中混勻；5min后，在2 11管內(nèi)分別加入10%氯化鈉 溶液0. 1ml，混勻，室溫靜置2 h以上觀(guān)察結(jié)果；1號(hào)管既不加抗體也不加氯化鈉溶液，為對(duì) 照管；未加抗體的11號(hào)管也為對(duì)照(見(jiàn)表1);未加抗體及加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管， 即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的試管則保持膠體金的紅色 不變。以此使膠體金紅色不變而抗體含量最低試管的蛋白量，即為穩(wěn)定1 ml膠體金的必需 蛋白量，也即最低穩(wěn)定量。在膠體金標(biāo)記整合素α νβ3抗體最低穩(wěn)定量的基礎(chǔ)上再加上10 %即為穩(wěn)定膠體金所需整合素α νβ3抗體的實(shí)際所需用量，根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量 計(jì)算出所需要的整合素ανβ3抗體的總量。在電磁攪拌下，將標(biāo)準(zhǔn)整合素0\^3抗體溶液加入膠體金溶液中，加入整合素α νβ3抗體時(shí)應(yīng)逐滴加入，Img的整合素0\^3抗體大約 5min加完；在磁性攪拌下加入終濃度為1 %的牛血清白蛋白(BSA)。
表1確定膠體金與整合素α νβ 3抗體用量比例
1號(hào)管2-10號(hào)管11號(hào)管膠體金溶液Iml+++整合素α Vg3抗體++-5min10%氯化鈉溶液0. Iml-++2h
3、免疫膠體金的純化采用低溫超速離心法純化金標(biāo)整合素α νβ 3抗體，以除去溶液 中未標(biāo)記的整合素α νβ 3抗體和未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種 聚合物。先將金標(biāo)整合素ανβ3抗體在4°C下，3000r/min低速離心40min，小心吸取上清 液，棄去沉淀；上清再以10000r/min 4°C離心40min，棄去上清。用0. Olmol/L、pH7. 4的 PBS (內(nèi)含1 % BSA, 0. 02 %疊氮鈉)溶解沉淀至原體積，充分穩(wěn)定后過(guò)夜。再以4°C IOOOOr/ min離心40min，棄上清液。用0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (內(nèi)含1 % BSA, 0. 02 %疊氮鈉)溶 解沉淀至原體積的1/10，4°C貯存?zhèn)溆谩?、金標(biāo)墊(結(jié)合釋放墊)的制備將膠體金標(biāo)記整合素α νβ 3抗體作1 :5，1 :10，1 50，1 :100,1 :500,1 :1000稀釋后，均勻等量浸于同樣大小的玻璃纖維素膜制成金標(biāo)墊。達(dá) 到試紙條敏感度要求的最適膠體金復(fù)合物的稀釋度，為工作濃度。保存液稀釋膠體金標(biāo)記 整合素α Υβ 3抗體原液至工作濃度，均勻浸于玻璃纖維素膜，冷凍真空干燥后密封保存。5、固相硝酸纖維素膜的制備硝酸纖維素膜的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)區(qū)，定義為檢測(cè)帶，將整合 素ανβ3抗體以直線(xiàn)形包被于檢測(cè)帶，距離檢測(cè)帶5 mm遠(yuǎn)的質(zhì)控帶(C)以直線(xiàn)形包被正 ?？剐∈驣gG抗體。37°C干燥2 h，4°C密封保存。6、樣品墊的處理1%的BSA作為封閉蛋白質(zhì)均勻浸于玻璃纖維素膜，室溫干燥備用。7、吸收墊用硬質(zhì)吸水濾紙制備。8、材料組裝在塑料底板上分別將吸液用玻璃纖維、凍干金標(biāo)記抗整合素α νβ 3 玻璃纖維、已固定有抗整合素α νβ3抗體和抗小鼠IgG抗體的硝酸纖維素膜及硬質(zhì)吸水濾 紙按圖1裝配，配件與塑料底板的結(jié)合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按 縱向剪切，裁成寬度為4mm的條狀即可。實(shí)施例3 試紙使用方法 (1)樣品制備
宮腔沖洗液超聲粉碎處理。(2)操作取超聲粉碎處理后的宮腔沖洗液標(biāo)本約Iml加入小試管中，然后將樣品 墊1端插入試紙條，注意不要超過(guò)樣品墊1，待1分鐘左右取出平放，5分鐘讀取結(jié)果。(3)檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖2，
出現(xiàn)1條紅色(對(duì)照)沉淀線(xiàn)(質(zhì)控線(xiàn)6)，診斷為陰性；
出現(xiàn)2條紅色(樣品和對(duì)照)沉淀線(xiàn)(檢測(cè)線(xiàn)5，質(zhì)控線(xiàn)6)，診斷為陽(yáng)性，未出現(xiàn)沉淀線(xiàn) 則為無(wú)效。
權(quán)利要求
1.一種整合素α ￥33檢測(cè)試劑盒，在硝酸纖維素膜的兩端分別設(shè)有金標(biāo)墊和吸收墊， 金標(biāo)墊上端為樣品墊，其特征在于金標(biāo)墊包被有純化的整合素α νβ 3抗體膠體金偶聯(lián)標(biāo) 記物，檢測(cè)線(xiàn)包被有純化的整合素α νβ3抗體，質(zhì)控線(xiàn)包被有正?？剐∈驣gG抗體，質(zhì)控線(xiàn) 側(cè)貼有吸收墊。
2.權(quán)利要求1所述整合素α￥卩3檢測(cè)試劑盒制備方法，包括下述步驟將純化的整合 素α νβ3抗體用膠體金標(biāo)記，噴點(diǎn)于玻璃纖維膜上制備成金標(biāo)墊，將純化的整合素ανβ3 抗體和正?？剐∈驣gG抗體分別包被在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線(xiàn)處和質(zhì)控線(xiàn)處，當(dāng)被檢樣 品中含有整合素α \^3抗原時(shí)，則于金標(biāo)墊與膠體金標(biāo)記的整合素0￥03抗體結(jié)合，并在 吸收墊的作用下，向前滲透泳動(dòng)，與檢測(cè)線(xiàn)上的整合素α V β 3抗體再次結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn) 的色帶。
全文摘要
本發(fā)明提供一種整合素αVβ3檢測(cè)試劑盒及其制備方法，將純化的整合素αVβ3抗體用膠體金標(biāo)記，噴點(diǎn)于玻璃纖維膜上制備成金標(biāo)墊，將純化的整合素αVβ3抗體和正常抗小鼠IgG抗體分別包被在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線(xiàn)處和質(zhì)控線(xiàn)處，當(dāng)被檢樣品中含有整合素αVβ3抗原時(shí)，則于金標(biāo)墊與膠體金標(biāo)記的整合素αVβ3抗體結(jié)合，并在吸收墊的作用下，向前滲透泳動(dòng)，與檢測(cè)線(xiàn)上的整合素αVβ3抗體再次結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶。本發(fā)明應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)制備整合素αVβ3檢測(cè)試劑盒,并擬應(yīng)用于臨床,以推動(dòng)整合素αVβ3在臨床的廣泛應(yīng)用,提高對(duì)子宮內(nèi)膜容受性判斷的準(zhǔn)確性,可以快速，靈敏檢測(cè)特定蛋白，避免了復(fù)雜的操作，無(wú)需特殊檢測(cè)儀器，結(jié)果易于觀(guān)察判斷，可以適應(yīng)多種檢測(cè)環(huán)境，以及多種檢測(cè)需要。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102147410SQ20101060375
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者于曉艷, 徐影, 徐耀宏, 李相軍, 石艷, 鄒穎剛, 鄭連文, 高海成, 黃冰玉 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)