專利名稱：一種抗生素耐藥ndm-1基因的熒光檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗生素耐藥NDM-I基因的熒光檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
NDM-I 全稱 New Delhi metallo-β -lactamase 1 (新德里金屬-β -內(nèi)酰胺分解 酶)，因為最初發(fā)現(xiàn)在印度和巴基斯坦等南亞地區(qū)，NDM-I的名稱里包含它的發(fā)現(xiàn)地。這種 酶可分解β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，因此可使任何含β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)失效。近期一種 可抗絕大多數(shù)抗生素的耐藥性超級細菌NDM-I在英美印度等國家小規(guī)模爆發(fā)，這種細菌其 實是一種特殊的酶，它能夠進入大多數(shù)細菌的DNA線粒體中存活，從而使細菌產(chǎn)生廣泛的 耐藥性。由于目前為止臨床最常用的抗生素，包括青霉素與頭孢菌素，以及新發(fā)展的頭霉素 類、硫霉素類、單環(huán)內(nèi)酰胺類等其他非典型內(nèi)酰胺類抗生素，都含有內(nèi)酰胺環(huán) 結(jié)構(gòu)，因此攜帶這種酶的細菌可以使幾乎所有抗生素失效。超級細菌是指攜帶編寫NDM-I 酶基因的細菌。大多數(shù)NDM-I超級病菌出現(xiàn)在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中。NDM-I基因存 在于DNA的結(jié)構(gòu)中，被稱為質(zhì)體。研究人員稱，質(zhì)體可以在細菌中自由復(fù)制和移動，從而使 “超級細菌”的菌種有多種可能，具有傳播和變異的驚人潛能。目前，NDM-I基因已經(jīng)從南亞擴散到歐美等國家，如英國、美國、加拿大、澳大利亞、 荷蘭等，全球已經(jīng)報道有170多人被感染，光是英國就已經(jīng)有超過50例患者；而8月14日 比利時一名男子的死亡，則成為世界上首例由它引起的死亡病例?？蒲泄ぷ髡咴谟《?、巴 基斯坦、英國等開展了較大范圍的流行病學(xué)調(diào)查，產(chǎn)NDM-I腸桿菌科細菌占所監(jiān)測細菌的 1.2% _13%，主要菌種為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他細菌還有陰溝腸桿菌、變形桿 菌、弗勞地枸櫞酸菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普羅威登菌等。這些細菌主要引起尿路、 血流、傷口、肺部和導(dǎo)管相關(guān)感染等。在美國、加拿大、日本、韓國、澳大利亞、比利時以及我 國香港、臺灣地區(qū)等都已經(jīng)有感染病例報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是根據(jù)抗生素耐藥NDM-I基因設(shè)計引物和TaqMan探針，提供一種檢測 抗生素耐藥NDM-I基因的熒光檢測試劑盒及其檢測方法，可實現(xiàn)對細菌體內(nèi)攜帶的NDM-I 基因進行快速、準(zhǔn)確、特異檢測。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種抗生素耐藥NDM-I基因的熒光檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物 和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探 針序列如下上游引物5‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘熒光探針5'-FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3'其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性引物和熒光探針序列的設(shè)計，試劑盒中其他組成，可按本 領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，該試劑盒可用作抗生素耐藥NDM-I基因的定性檢測，也可加入標(biāo)準(zhǔn)品 進行定量檢測。優(yōu)選的，所述試劑盒中還可包括抗生素耐藥NDM-I基因標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品序列 如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcgatg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taaaat acc ttg age ggg cca。以標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度的DNA溶液進行熒光PCR檢測，根據(jù)拷貝濃度的對數(shù)值與標(biāo) 準(zhǔn)品Ct值的關(guān)系可繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得樣品DNA的Ct值后，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可獲得樣 品DNA的拷貝濃度。本發(fā)明還涉及一種抗生素耐藥NDM-I基因的熒光檢測方法，所述方法包括(1)提取待測樣本DNA;(2)取特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA 聚合酶，分別加入陰性對照品或待測樣品DNA配成PCR反應(yīng)體系，于同等條件下進行PCR擴 增反應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進行熒光檢測；所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘熒光探針5‘ -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 ‘其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團；所述陰性對照品可按本領(lǐng)域常規(guī)方法選擇，通常選擇不含靶基因(NDM-I)和對多 種抗生素敏感的非靶細菌，如副溶血性弧菌、志賀菌、沙門菌等。(3)選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線 剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈 良好的對數(shù)增長，則判斷為陽性。為達到定量檢測的要求，所述方法同時以梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液在與樣品 DNA相同條件下進行PCR擴增反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液拷貝濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品 Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品DNA測得的Ct值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣品DNA的拷 貝濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcgatg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taaaat acc ttg age ggg cca。所述PCR反應(yīng)條件可按參照本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR方法，優(yōu)選的，所述PCR擴增 反應(yīng)條件如下95°C變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進行40個循環(huán)擴增。PCR反應(yīng)液通常按如下組成配制(終濃度)PCR buffer終濃度為1Χ、0·3 0. 5 μ M的引物、0. 1 0. 3 μ M的熒光探針、1 2. 5U的DNA聚合酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs， 通常取2 μ L (約50ng/ μ 1)的模板，反應(yīng)總體積通常為20 50 μ L。PCR buffer終濃度 為IX，是指緩沖液中各組分終濃度與IXPCR buffer相同，通常采用市購2XPCR buffer, 體積用量為PCR反應(yīng)液體系總體積的1/2。IXPCR buffer組成如下KC1 50mM, Tris-HCl IOmM, TritonX-1000. 1%, MgC12 1. 5mM。
本發(fā)明建立了利用TaqMan熒光定量PCR技術(shù)檢測抗生素耐藥NDM-I基因的方法， 并經(jīng)檢測人工全基因合成的標(biāo)本，表明該方法切實可行。由于本方法采用了 PCR擴增技術(shù)， 使得抗生素耐藥NDM-I基因的檢測敏感性大大提高，而且由于熒光探針的應(yīng)用，使得其特 異性亦大大提高，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率，使得我們可以在極少的標(biāo)本中獲得足 夠的監(jiān)測信息。本發(fā)明采用了目前較先進的特異性熒光探針雜交定量PCR檢測技術(shù)，在保持高敏 感性的前提下盡量減少假陽性干擾。在實時熒光定量PCR檢測技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對PCR 模板的定量不論是直接PCR還是競爭性PCR，基本上都要通過PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果 經(jīng)計算機圖像處理，根據(jù)電泳條帶的亮度來確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)?biāo)記的PCR 產(chǎn)物以ELISA的方式進行檢測，再由此推測起始模板的量，但這些方法實際上都屬于半定 量水平，因為即使PCR條件已優(yōu)化到最佳程度，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會給 結(jié)果分析帶來影響，從而影響定量這的結(jié)果。隨著實時熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，人們可以 真正地做到對PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高靈敏性，而且由于特 異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使得被檢測基因的特異性大大提高。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在使用本發(fā)明檢測試劑盒，抗生素耐藥NDM-I基因 的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率；可實現(xiàn)對抗生素耐藥NDM-I 基因快速、準(zhǔn)確、特異檢測。


圖1為實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品檢測抗生素耐藥NDM-I基因?qū)崟r熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果，從左至右分別為107、IO6、105、IO4、103、IO2UO1Copies/ μ L標(biāo)準(zhǔn)品。圖2為實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = -3. 559XlgX+36. 34;Υ:對 應(yīng)的CT值；X 抗生素耐藥NDM-I基因的copies。圖3為不同濃度的5例人工合成全基因標(biāo)本熒光定量PCR檢測結(jié)果，CT值 分別為 24. 78,25. 90,27. 26,27. 29 和 28. 05，拷貝數(shù)分別為 1. 307 X IO5Copies/μ L、 4. 72Χ IO4Copies/μ LU. 17X IO4Copies/μ L、1· 13X 104copies/μ L 和 4. 70X 103copies/ μ L0
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 特異性引物、熒光探針和標(biāo)準(zhǔn)品的獲得1、材料細菌基因組DNA提取試劑購自大連寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶購自美國 LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系統(tǒng)、Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司，測序試劑、 377 型測序儀、Bio-Rad icycler PCR 儀、Rotor Gene Q 5-plex 型定量 PCR 儀(Qiagen 公 司)。2、引物及探針設(shè)計與合成
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以抗生素耐藥NDM-I基因序列(注冊號為AB571289)為模板，使用Primer Express (V2. 0，美國ABI公司)軟件分析TaqMan引物和探針位點，從中選擇最佳組合。標(biāo)準(zhǔn)品PCR序列上游引物5，-TGGCCTTGCTGTCCTTGATC-3，，下游引物5，-TGGCCCGCTCAAGGTATTTT-3，，檢測用PCR序列為上游引物5‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘熒光探針5'-FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3'其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。均由上海輝睿生物科技有限公司合成。3、檢測標(biāo)準(zhǔn)品制備采用ABI394寡核苷酸合成儀根據(jù)抗生素耐藥NDM-I基因序列中標(biāo)準(zhǔn)品PCR序列 的位置，全基因合成123bp的寡核苷酸片段。用標(biāo)準(zhǔn)品上下游引物在Bio-Rad icycler PCR 儀上進行PCR擴增PCR反應(yīng)液組成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L標(biāo)準(zhǔn)品上游引物(10 μ Μ)IuL標(biāo)準(zhǔn)品下游引物(10 μ Μ)IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 6 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L)1 μ L水補足至20 μ L。PCR條件為94°C 5分鐘變性，94°C 20秒、55°C 20秒、72°C 20秒進行35個循環(huán)擴 增，最后于72°C延伸5分鐘后置4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后即用克隆系統(tǒng)插入pGEM-T-Easy克隆載體，并將陽性克隆 經(jīng)測序驗證?；厥?23bp片段，即為標(biāo)準(zhǔn)品，測定濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。4、結(jié)果經(jīng)測序，上述設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)品完全與預(yù)期相符，回收的標(biāo)準(zhǔn)品片段序列如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcg atg tcg gtg ccgtcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taa aat acc ttg agcggg cca(SEQ ID No. 4)。實施例2 熒光定量PCR法檢測人工模擬樣本1、標(biāo)本檢測5例人工模擬標(biāo)本，采用基因組DNA提取試劑提取基因組DNA，分別取LOyL做模 板，用檢測用上下游引物在Rotor Gene Q 5-plex型定量PCR儀(Qiagen公司)上進行PCR 擴增。PCR反應(yīng)液組成如下
2 X PCR buffer10. 0 μ L檢測用上游引物(10 μ Μ)IuL檢測用下游引物(10 μ Μ)IuL檢測用熒光探針(10 μ Μ)0. 5uLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L)1 μ L水補足至20 μ L。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進行40個循環(huán)擴增。以非靶細菌肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)為陰性對照于相同條件下進行PCR檢 測，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過 閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，則判斷為陽性。同時在相同條件下以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣本的測定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出檢測樣本中的抗生素耐藥 NDM-I基因的數(shù)量。以副溶血性弧菌(ATCC 17802)、志賀菌(ATCC 12022)、沙門菌(ATCC 50035)、金 黃色葡萄球菌(ATCC 25933)、鮑曼不動桿菌(ATCC25004)和空腸彎曲菌(ATCC 33560)菌株 按照上述方法進行PCR檢測，檢測結(jié)果均呈陰性，說明本發(fā)明方法特異性好。2、樣品檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果參見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖2。5例人工模擬標(biāo)本檢出抗生素耐藥NDM-I基因陽性，檢測結(jié)果參見圖3 :5例 陽性標(biāo)本熒光定量PCR檢測結(jié)果，CT值分別為24. 78,25. 90,27. 26,27. 29和28. 05， 拷貝數(shù)分別為 1. 307 X IO5Copies/μ L、4. 72 X IO4Copies/μ L、l. 17 X IO4Copies/μ L、 1. 13 X 104copies/ μ L 和 4· 70 X IO3Copies/ μ L。本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求 書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗生素耐藥NDM-I基因的熒光檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物和 熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特異性引物 和熒光探針序列如下上游引物5 ‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘ 下游引物5 ‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘ 熒光探針5 ‘ -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 ‘ 其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括抗生素耐藥NDM-I基 因標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下agc gac ttg gcc ttg ctgtcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcg atg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttgtca ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taa aat acc ttg age ggg cca。
3.一種抗生素耐藥NDM-I基因的熒光檢測方法，所述方法包括(1)提取待測樣本DNA;(2)取特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶，分別加入陰性對照品或待測樣品DNA配成PCR反應(yīng)體系，于同等條件下進行PCR擴增反 應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進行熒光檢測；所述特異性引物和熒光探針序列如下 上游引物5 ‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘ 下游引物5 ‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘ 熒光探針5 ‘ -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 ‘ 其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團；(3)選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線剛好 超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好 的對數(shù)增長，則判斷為陽性。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同時以梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶 液在與樣品DNA相同條件下進行PCR擴增反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液拷貝濃度的對數(shù)值為橫 坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品DNA測得的Ct值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得 樣品DNA的拷貝濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg atcagg cag cca cca aaa gcg atg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtgtgg ccg ggg ccg ggg taa aat acc ttg age ggg ccb。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR擴增反應(yīng)條件如下95°C變性2 分鐘，95°C 15秒、60°C 30秒進行40個循環(huán)擴增。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗生素耐藥NDM-1基因的熒光檢測試劑盒及檢測方法。所述試劑盒中特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-CAG CCA CCA AAA GCG ATG T-3′，下游引物5′-CGG CCACAC CAG TGA CAA TA-3′，熒光探針5′-FAM-TGC CGT CGA TCCCAA CGG TG-TAMRA-3′，其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在使用本發(fā)明檢測試劑盒，抗生素耐藥NDM-1基因的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率；可實現(xiàn)對抗生素耐藥NDM-1基因的快速、準(zhǔn)確、特異檢測。
文檔編號G01N21/64GK102002528SQ201010554690
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者張政, 程蘇云, 羅蕓, 金大智 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心