專利名稱：用于預(yù)測初次不利事件的生物標(biāo)志物的制作方法
用于預(yù)測初次不利事件的生物標(biāo)志物本發(fā)明涉及對象中初次不利事件的預(yù)測、診斷測定方法及其應(yīng)用。心血管疾病的有效預(yù)防依賴于風(fēng)險(xiǎn)個體的準(zhǔn)確鑒定，但是心血管事件經(jīng)常發(fā)生在傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子載荷低的個體中(Khot UN等“冠心病患者中常規(guī)風(fēng)險(xiǎn)因子的流行 t 生，，(Prevalence ofconventional risk factors in patients with coronary heart disease), JAMA, 2003 ；290 :898-904)。因此，近年來，潛在地使用血液循環(huán)中的生物標(biāo)志物以擴(kuò)大常規(guī)風(fēng)險(xiǎn)評估，吸引了越來越多的注意。然而，當(dāng)前的研究在生物標(biāo)志物用于心血管風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的功效方面得出不同的結(jié)論。一些報(bào)告指出，生物標(biāo)志物例如C反應(yīng)蛋白(CRP)和 N端前B型利尿鈉肽(NT-proBNP)有助于風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(Ridker PM等“用于在婦女中評估全面心血管風(fēng)險(xiǎn)的改進(jìn)算法的開發(fā)和驗(yàn)證Reynolds風(fēng)險(xiǎn)評分”(Development and validation of improved algorithms for the assessment of global cardiovascular risk in women :the Reynolds Risk Score), JAMA, 2007 ；297 :611-619 ；Zethelius B 等“使用多種生物標(biāo)志物改進(jìn)心血管疾病引起的死亡的預(yù)測” (Use of multiple biomarkers to improve the prediction of death from cardiovascular causes), N Engl J Med. 2008 ； 358 :2107-2116),而其他研究的結(jié)論則是這些生物標(biāo)志物對增加信息的貢獻(xiàn)相當(dāng)小 (Folsom AR等“使用C反應(yīng)蛋白和其他新風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物增加冠心病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的評估社區(qū)研究中的動脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)，，(An assessment of incremental coronary risk prediction using C-reactive protein and other novel risk markers :the atherosclerosis risk in communities study), Arch Intern Med. 2006 ；166 :1368-1373 ；Wang TJ 等“多種生物標(biāo)志物用于預(yù)測初次重大心血管事件和死亡”(Multiple biomarkers for the prediction of first major cardiovascular events and death), N Engl J Med. 2006 ； 355 :2631-2639)。許多因素影響生物標(biāo)志物預(yù)測結(jié)果的好壞，包括所研究的群體和所選的具體生物標(biāo)志物。聚焦于老年或高風(fēng)險(xiǎn)群體的研究通常得出生物標(biāo)志物性能的良好估計(jì)(Zethelius B等“使用多種生物標(biāo)志物改進(jìn)心血管疾病引起的死亡的預(yù)測”(Use of multiple biomarkers to improve the prediction of death from cardiovascular causes)， N Engl J Med. 2008 ；358 :2107-2116 ；Blankenberg S 等“在心臟結(jié)果預(yù)防評估(HOPE)研究中多種生物標(biāo)志物和N端前腦利尿鈉肽在使用常規(guī)風(fēng)險(xiǎn)因子預(yù)測復(fù)發(fā)心血管事件的情形下的 t匕較性影口向”(Comparative impact of multiple biomarkers and N-Terminal pro-brain natriuretic peptide in the context of conventional risk factors for the prediction of recurrent cardiovascular events in the Heart Outcomes Prevention Evaluation (HOPE) Study. Circulation. 2006 ；114 :201-208)，但是對新風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物的最大需求存在于低到中風(fēng)險(xiǎn)群體中，對于這些群體來說數(shù)據(jù)最為沖突(de Lemos JA，Lloyd-Jones DM “用于心血管風(fēng)險(xiǎn)評估的多種生物標(biāo)志物組”(Multiple biomarker panels for cardiovascular risk assessment. N Engl J Med. 2008 ；358 :2172-2174)。 對于用于評估新生物標(biāo)志物的統(tǒng)計(jì)學(xué)判據(jù)來說，廣范接受的是基本關(guān)聯(lián)性度量例如風(fēng)險(xiǎn)比或優(yōu)勢比不足以評估預(yù)后功效，但是對于使用何種度量存在爭論(Cook NR:“受試者工作特性曲線在風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測中的使用和誤用”(Use and misuse of the receiver operating characteristic curve in risk prediction), Circulation. 2007 ;115 :928-935)。較新的標(biāo)準(zhǔn)評估生物標(biāo)志物為患者指派臨床風(fēng)險(xiǎn)類別的恰當(dāng)性(Ridker PM等“用于在婦女中評估全面心血管風(fēng)險(xiǎn)的改進(jìn)算法的開發(fā)和驗(yàn)證=Reyn0Ids風(fēng)險(xiǎn)評分”(Development and validation of improved algorithms for the assessment of global cardiovascular risk in women : the Reynolds Risk Score), JAMA, 2007 ；297 :611-619 ；Pencina MJ^ “評估新標(biāo)志物的增加預(yù)測能力從ROC曲線下面積到重新分類等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker :from area under the ROC curve to reclassification and beyond), Stat Med. 2008 ;27 :157-172)，但是只有幾項(xiàng)研究引入了這些標(biāo)準(zhǔn)(Zethelius B等“使用多種生物標(biāo)志物改進(jìn)心血管疾病引起的死亡的預(yù)測”(Use of multiple biomarkers to improve the prediction of death from cardiovascular causes),N Engl J Med. 2008 ；358 :2107-2116)。另一個重要的考慮因素是生物標(biāo)志物的選擇。盡管幾種生物標(biāo)志物在針對傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行調(diào)整后一致地預(yù)測了心血管事件(Vasan RS.“心血管疾病的生物標(biāo)志物分子基礎(chǔ)和實(shí)踐考慮”(Biomarkers of cardiovascular disease :molecular basis and practical considerations), Circulation. 2006 ；113 2335-236 ，但很少有初級預(yù)防研究同時(shí)引入多種提供信息的生物標(biāo)志物，而這種方法對于提供增加的信息來說具有最大前景(de Lemos JA, Lloyd-Jones DM:“用于心血管風(fēng) I^i5Fi古白勺$禾中Lt示; · ，， (Multiple biomarker panels for cardiovascular risk assessment. N Engl J Med. 2008 ；358 :2172-2174)。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)這種肽，作為一種從人類嗜鉻細(xì)胞瘤分離的包含52個氨基酸的新的降血壓肽，在1993年首次被描述(Kitamura等，(1993)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 :553-560)。同年，包含185個氨基酸的前體肽的編碼cDNA和該前體肽的完整氨基酸序列也被描述(Kitamura 等，(1993)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 194 720-725)。前體肽特別在N端包含有21個氨基酸的信號序列，被稱為“前腎上腺髓質(zhì)素原，，(pre-pro-ADM)。ADM肽包含pre-pro-ADM的95到146位氨基酸，其由pre-pro-ADM通過蛋白水解切割而形成。在pre-pro-ADM的切割中形成的某些肽片段已進(jìn)行了詳細(xì)的表征，特別是生理活性肽腎上腺髓質(zhì)素(ADM)和“PAMP”，后者是包含在pre-pro-ADM中緊隨信號肽的21個氨基酸之后的20個氨基酸02-41位)的肽。另一個未知功能并具有高的離體穩(wěn)定性的片段是中段腎上腺髓質(zhì)素原(MR-proADM) Gtruck 等，(2004), Peptides 25(8) :1369-7 ，對其已開發(fā)出一種可靠的定量方法(Morgenthaler 等(2005), Clin. Chem. 51(10) :1823-9)。1993年ADM的發(fā)現(xiàn)和定性引發(fā)了大量研究活動和無數(shù)出版物，它們的結(jié)果最近已被總結(jié)在多篇綜述文章中，在本說明書的情況下，具體來說參考在“Peptides”雜志的 ADM ?？?P印tides 22(2001))中發(fā)現(xiàn)的文章，特別是(TakahashU2001)，P印tides 22， 1691和Eto Q001)，P印tides 22,1693-1711)。該主題進(jìn)一步綜述在Hinson等的文章中 (Hinson等，(2000)，Endocr. Rev. 21 (2)，138-167)。ADM可以被當(dāng)作多功能調(diào)控肽。它以帶有C端甘氨酸的無活性形式釋放到循環(huán)中(Kitamura等，(1998)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 244(2),551-555)。ADM是有效的血管舒張劑。降血壓效應(yīng)已與ADM的C端部分中的肽區(qū)段具體相關(guān)聯(lián)。另一方面，ADM的N端肽序列表現(xiàn)出升血壓效應(yīng)(Kitamura等，(2001)，Peptides 22， 1713-1718)。本發(fā)明的主題是用于在對象中預(yù)測初次不利事件或鑒定具有發(fā)生初次不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象的方法，以及測定方法和捕獲探針的應(yīng)用。本發(fā)明的主題是用于在健康對象中預(yù)測發(fā)生不利事件的風(fēng)險(xiǎn)或鑒定具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的健康對象的方法，所述方法包含·測定從所述對象獲得的樣品中腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平；以及·將所述腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平單獨(dú)或與其他預(yù)后臨床和/或?qū)嶒?yàn)室參數(shù)聯(lián)合使用，用于預(yù)測初次不利事件或由此推斷發(fā)生不利事件的風(fēng)險(xiǎn)。在一個具體實(shí)施方案中，這種不利事件可能是初次在該對象中診斷到。在一種情況下，初次事件可能是例如冠狀血管事件，這意味著該對象以前沒有過冠狀血管事件。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)測了發(fā)生初次不利事件的風(fēng)險(xiǎn)，并鑒定了具有發(fā)生初次不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“腎上腺髓質(zhì)素原”和術(shù)語“腎上腺髓質(zhì)素原或其片段” 是指腎上腺髓質(zhì)素原的完整分子或其至少12個氨基酸的片段，包括但不限于腎上腺髓質(zhì)素、PAMP和MR-proADM。在優(yōu)選實(shí)施方案中，腎上腺髓質(zhì)素原是指腎上腺髓質(zhì)素原的完整分子或其除了成熟腎上腺髓質(zhì)素之外的至少12個氨基酸的片段。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中， 腎上腺髓質(zhì)素原是指腎上腺髓質(zhì)素原的完整分子或其除了成熟腎上腺髓質(zhì)素或成熟腎上腺髓質(zhì)素的片段之外的至少12個氨基酸的片段。因此，在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中， “測定腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平”是指測定腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平，其中不測定成熟腎上腺髓質(zhì)素和/或成熟腎上腺髓質(zhì)素的片段的水平。腎上腺髓質(zhì)素的前體肽(前腎上腺髓質(zhì)素原)的氨基酸序列在

圖1中給出(SEQ ID NO :1)。腎上腺髓質(zhì)素原涉及前腎上腺髓質(zhì)素原序列的22到185位氨基酸殘基。腎上腺髓質(zhì)素原(pro-ADM)的氨基酸序列在圖2中給出(SEQ ID NO :2)。pro-ADM的N端20肽 (PAMP)涉及pre-pro-ADM的22-41位氨基酸殘基。PAMP的氨基酸序列在圖3中給出(SEQ ID NO. 3)。MR-腎上腺髓質(zhì)素原(MR-pro-ADM)涉及pre-pro-ADM的45-92位氨基酸殘基。 MR-pro-ADM的氨基酸序列提供在圖4中(SEQ ID NO :4)。成熟腎上腺髓質(zhì)素(ADM)的氨基酸序列在圖5中給出(SEQ ID NO 5)。在本文中，當(dāng)在蛋白或肽的上下文中提到時(shí)，術(shù)語“片段”是指可以從較大蛋白或肽得到的較小蛋白或肽，因此其包含較大蛋白或肽的部分序列。所述片段從較大蛋白或肽通過其一個或多個肽鍵的皂化作用而產(chǎn)生。在本發(fā)明的文本中，在表述例如“蛋白酶水平”、“被分析物水平”和類似的表述中， 術(shù)語“水平”是指在相應(yīng)上下文中提到的分子實(shí)體的量，或在酶的情況下它也可以是指酶活性。不利事件被定義為損害個體健康的事件。所述不利事件不受限制，但可以選自冠狀血管事件、心血管事件、死亡、心力衰竭、 糖尿病、高血壓。在本發(fā)明的文本中，除非另有陳述，否則術(shù)語“糖尿病(diabetes) ”是指糖尿病(diabetes mellitus)。優(yōu)選情況下，糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。在本文中， 優(yōu)選情況下初次不利事件是初次冠狀血管事件或初次心血管事件。
冠狀血管事件被定義為致死或非致死急性冠狀血管綜合征，包括心肌梗塞或由缺血性心臟病引起的死亡。心血管事件被定義為致死或非致死急性冠狀血管綜合征，包括心肌梗塞、致死或非致死中風(fēng)、或由心血管疾病引起的死亡。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是用于在對象中預(yù)測初次不利事件或鑒定具有發(fā)生初次不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象的方法，其中所述不利事件是冠狀血管或心血管事件，特別優(yōu)選為冠狀血管事件。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述對象是具有低負(fù)荷傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子的對象，所述傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子選自但不限于吸煙(被定義為在過去一年中的任何吸煙)、糖尿病、高脂血癥、高血壓、高體重指數(shù)(BMI)(即優(yōu)選情況下所述對象具有低于30、優(yōu)選低于觀、更優(yōu)選低于27、更優(yōu)選低于沈、最優(yōu)選低于25的BMI)、男性、抗高血壓治療和年齡(風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡而增加；優(yōu)選情況下所述對象的年齡低于55歲、優(yōu)選低于60歲、更優(yōu)選低于65歲、更優(yōu)選低于70歲、 最優(yōu)選低于75歲)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，對于本發(fā)明的所有情況來說，所述對象是“健康的”或 “表觀健康的”。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“健康的”或“表觀健康的”是指個體以前不具有或可選地未察覺到具有心血管或冠狀血管事件或心力衰竭，并且其不正患有急性傳染病。優(yōu)選情況下，健康的或表觀健康的是指個體以前不具有心血管或冠狀血管事件或心力衰竭，并且其不正患有急性傳染病。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，“健康的”或“表觀健康的”對象是以前不具有或可選地未察覺到具有心血管或冠狀血管事件的個體。此外，優(yōu)選情況下，“健康的”或“表觀健康的”對象未患有糖尿病和/或高血壓。在特定實(shí)施方案中，表觀健康的對象可能患有糖尿病、高脂血癥和/或高血壓。在這種情況下，不利事件可以不選自糖尿病和/或高血壓。在一個實(shí)施方案中，表觀健康的對象正患有糖尿病。在這種情況下，不利事件不是糖尿病。在另一個實(shí)施方案中，健康的對象正患有高血壓。在這種情況下，不利事件不是高血壓。最優(yōu)選情況下，表觀健康的對象不現(xiàn)實(shí)任何疾病的任何癥狀。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，不利事件是冠狀血管事件，并且“健康的”或“表觀健康的”對象可以患有糖尿病、高脂血癥和/或高血壓。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，不利事件是心血管事件，并且“健康的”或“表觀健康的”對象可以患有糖尿病、高脂血癥和/或高血壓。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，不利事件是心血管或冠狀血管事件，并且“健康的”或“表觀健康的”對象正患有糖尿病。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，不利事件是心血管或冠狀血管事件，并且“健康的”或“表觀健康的”對象正患有高血壓。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，不利事件是心肌梗塞，并且“健康的”或“表觀健康的” 對象正患有糖尿病、高脂血癥和/或高血壓。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，不利事件是心肌梗塞，并且“健康的”或“表觀健康的”對象不顯示任何疾病的任何癥狀。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，不利事件是由缺血性心臟病引起的死亡，并且“健康的”或“表觀健康的”對象正患有糖尿病、高脂血癥和/或高血壓。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中， 不利事件是缺血性心臟病，并且“健康的”或“表觀健康的”對象不顯示任何疾病的任何癥狀。然而，一般來說，在“健康的”或“表觀健康的”對象正患有特定疾病的情況下，本發(fā)明的以及如本文中定義的初次不利事件不能是該特定疾病。例如，如果“健康的”或“表觀健康的”對象正患有糖尿病，則本文所定義的初次不利事件不是糖尿病。如果表觀健康的對象正患有高血壓，則本文所定義的初次不利事件不是高血壓。根據(jù)本發(fā)明，健康的和表觀健康的對象的亞組是同一個對象亞組，因?yàn)楸碛^健康的人是還未被診斷為具有或已具有涉及所述對象的健康的事件或病癥的人，這意味著表觀健康的人是被認(rèn)為是健康的人。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，測定所述腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平并將其用作單一標(biāo)志物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，對象中初次不利事件的預(yù)測或具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象的鑒定，通過附加地測定和使用實(shí)驗(yàn)室參數(shù)來改進(jìn)，所述實(shí)驗(yàn)室參數(shù)選自CRP、LpLA2、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C和包括ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、 BNP, proBNP、NT-proBNP的A型與B型利尿鈉肽及其前體和片段、甘油三酯、HDL膽固醇或其亞組分、LDL膽固醇或其亞組分、⑶F 15、ST2、降鈣素原及其片段、血管加壓素原及其包括和肽素、血管加壓素和神經(jīng)垂體激素運(yùn)載蛋白的片段、內(nèi)皮素原-1及其包括CT-proET-1、 NT-proET-1、大內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素_1的片段。當(dāng)在本文中提到時(shí)，在CRP、LpLA2、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C和包括ANP、proANP、 NT-proANP、MR-proANP、BNP, proBNP、NT-proBNP的A型與B型利尿鈉肽及其前體和片段、 ⑶F 15、ST2、降鈣素原或其片段、血管加壓素原及其包括和肽素、血管加壓素和神經(jīng)垂體激素運(yùn)載蛋白的片段、內(nèi)皮素原-1及其包括CT-proET-1、NT-proET-1、大內(nèi)皮素_1和內(nèi)皮素-1的片段，上下文中，這些術(shù)語是指完整分子或其至少12個氨基酸的片段。術(shù)語“附加地測定”不暗示、盡管也不排除這些測定在技術(shù)上組合。術(shù)語“附加地使用”被定義為參數(shù)——它可以是實(shí)驗(yàn)室和/或臨床參數(shù)——的任何類型的數(shù)學(xué)組合，其為對象經(jīng)歷不利事件的風(fēng)險(xiǎn)或鑒定具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象進(jìn)行描述。這種數(shù)學(xué)組合的一個實(shí)例是Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，從其可以推導(dǎo)出對象經(jīng)歷不利事件的風(fēng)險(xiǎn)，但是也可以使用其他方法。本發(fā)明還包括將個體的標(biāo)志物水平與預(yù)定值進(jìn)行比較。預(yù)定值可以采取各種形式。它可以是單一截止值，例如群體的中位數(shù)或平均值或75^9(^、95&或99&百分位數(shù)。 它可以根據(jù)對比組來建立，例如一個規(guī)定組中的風(fēng)險(xiǎn)為另一個規(guī)定組中的風(fēng)險(xiǎn)的兩倍。它可以是范圍，例如將測試群體等量(或不等量)地分組，例如低風(fēng)險(xiǎn)組、中風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，或分成四等分，最低的四分之一是具有最低風(fēng)險(xiǎn)的個體，最高的四分之一是是具有最高風(fēng)險(xiǎn)的個體。在所選的特定群體中，預(yù)定值可以隨著他們的嗜好、種族、遺傳等而變化。例如， “健康的”或“表觀健康的”非吸煙者群體(沒有可檢測到的疾病并且沒有心血管障礙既往病史)與吸煙群體或其成員以前患有心血管障礙的群體相比，可以具有不同的標(biāo)志物“正?！狈秶?。因此，所選的預(yù)定值可以考慮個體所屬類別。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員可以使用不超出常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來選擇適合的范圍和類別。上面提到的標(biāo)志物的水平可以通過任何本技術(shù)領(lǐng)域公認(rèn)的方法來獲得。典型情況下，水平通過測量體液例如血液、淋巴、唾液、尿液等中標(biāo)志物的水平或活性來測定。水平可以通過免疫測定法或用于測定標(biāo)志物水平的其他常規(guī)技術(shù)來測定。公認(rèn)的方法包括將患者的體液樣品送往商業(yè)化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測量，但是也可以在現(xiàn)場進(jìn)行測量。標(biāo)志物的特定組合對于在對象中預(yù)測不利事件或鑒定具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象，似乎特別有價(jià)值。因此，在本發(fā)明的一種情況下，只測定并使用下列標(biāo)志物的水平proBNP或其具有至少12個氨基酸的片段或前體、CRP、LpLA2與腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的組合。該特定組合似乎特別有價(jià)值，其中在對象中預(yù)測初次心血管事件，或鑒定具有發(fā)生初次心血管事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象?？蛇x地或此外，測定到的腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平可以與臨床參數(shù)組合。 因此，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在對象中預(yù)測初次不利事件或鑒定具有發(fā)生初次不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象，通過除了腎上腺髓質(zhì)素原或其片段之外還測定和使用臨床參數(shù)來改進(jìn)，所述臨床參數(shù)選自年齡、性別、收縮壓、舒張壓、抗高血壓治療、體重指數(shù)、糖尿病的存在、當(dāng)前吸煙。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在對象中預(yù)測不利事件或鑒定具有發(fā)生不利事件的高風(fēng)險(xiǎn)的對象，通過除了腎上腺髓質(zhì)素原或其片段之外還測定和使用選自上面提到的臨床和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)來改進(jìn)。在本發(fā)明的方法的另一種情況下，只測定并使用下列標(biāo)志物的水平proBNP或其具有至少12個氨基酸的片段或前體與腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的組合。該特定組合似乎特別有價(jià)值，其中在對象中預(yù)測冠狀血管事件，或鑒定具有發(fā)生冠狀血管事件、特別是初次冠狀血管事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象。在本發(fā)明的方法的特定實(shí)施方案中，腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的所述水平的使用，包括將腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的所述水平與閾值水平進(jìn)行比較，由此，當(dāng)腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的所述水平超過所述閾值水平時(shí)，在對象中預(yù)測了心血管事件或初次心血管事件，或鑒定了具有發(fā)生(初次)不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象。這種閾值水平可以從例如Kaplan-Meier分析(圖6)來獲得，其中所調(diào)查群體中冠狀血管事件隨時(shí)間的發(fā)生根據(jù)群體的MR-proADM四分位數(shù)來描述。根據(jù)這種分析，所調(diào)查群體中具有高于75th百分位數(shù)、即高于0. 52nmol/L的MR-proADM水平的對象，具有顯著增加的發(fā)生初次不利冠狀血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。該結(jié)果得到伴有對經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行全面調(diào)整的Cox回歸分析的支持MR-proADM最高的四分位(所有對象的MR-proADM水平高于 0. 52nmol/L)與所有其他對象相比，與發(fā)生初次不利冠狀血管事件的增加的風(fēng)險(xiǎn)(HR = 1. 6 95% CI 1. 2-2. 2)非常顯著地相關(guān)。其他優(yōu)選的截止值是例如正常群體的90th、95th或99th百分位數(shù)。通過使用比75th 百分位數(shù)更高的百分位數(shù)，人們減少了鑒定到的假陽性對象的數(shù)量，但是人們可能錯過鑒定具有中等、盡管仍然升高的風(fēng)險(xiǎn)的對象。因此，人們可以根據(jù)被認(rèn)為更加合適的是以也鑒定到“假陽性”為代價(jià)而鑒定大多數(shù)有風(fēng)險(xiǎn)對象，還是以錯過幾個具有中等風(fēng)險(xiǎn)的對象為代價(jià)而主要鑒定高風(fēng)險(xiǎn)對象，來挑選截止值。通過使用個體的MR-proADM值和其他預(yù)后性實(shí)驗(yàn)室和臨床參數(shù)來計(jì)算個體風(fēng)險(xiǎn)的其他數(shù)學(xué)可能性是例如NRI (凈重新分類指數(shù))或IDI (綜合鑒別指數(shù))。所述指數(shù)可以按照Pencina的文獻(xiàn)來計(jì)算(Pencina MJ等“評估新標(biāo)志物的增加預(yù)測能力從ROC曲線下面禾只至丨J重新分類等” (Evaluating the added predictive ability of a new marker from area under the ROC curve to reclassification and beyond), Stat Med. 2008 ； 27 :157-172)。簡單來說，NRI (凈重新分類指數(shù))(基于按照ATPIII風(fēng)險(xiǎn)算法的CVD風(fēng)險(xiǎn)類型， 10年風(fēng)險(xiǎn)< 10、10- < 20和20+% )通過向經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因子的模型添加例如MR-proADM，來計(jì)算是否人們將事實(shí)上具有事件的顯著數(shù)量的對象移動到更高風(fēng)險(xiǎn)類型，并將沒有事件的對象移動到更低風(fēng)險(xiǎn)類型。IDI (綜合鑒別指數(shù))功能類似，但是不使用10年風(fēng)險(xiǎn)< 10、 10- < 20和20+%的界限，并且代之以計(jì)算“全部綜合移動”，即添加MR-proADM是否使具有事件的對象在連續(xù)風(fēng)險(xiǎn)等級中向上移動，并使不具有事件的對象在連續(xù)風(fēng)險(xiǎn)等級中向下移動。NRI具有臨床關(guān)聯(lián)性，當(dāng)越過20%的“魔力(magical)邊界”時(shí)，意味著患者應(yīng)該作為次級預(yù)防患者進(jìn)行治療，因此意味著需要進(jìn)行某種治療(根據(jù)心臟病學(xué)預(yù)防準(zhǔn)則)。因此，本發(fā)明還涉及前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用于在對象中預(yù)測發(fā)生不利事件的風(fēng)險(xiǎn)或鑒定具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象的方法，其中腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平單獨(dú)或與其他可用于預(yù)后的實(shí)驗(yàn)室或臨床參數(shù)聯(lián)合使用，通過可以選自下列可選方案的方法用來預(yù)測對象發(fā)生不利事件的風(fēng)險(xiǎn)·與“健康”或“表觀健康”對象群體中全部預(yù)定樣品中的腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平的中位數(shù)進(jìn)行比較， 與“表觀健康”對象群體中全部預(yù)定樣品中的腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平的分位數(shù)(例如75th、90th、95th或99th百分位數(shù))進(jìn)行比較，·根據(jù)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析或使用風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算例如NRJ(凈重新分類指數(shù))或 IDI (綜合鑒別指數(shù))進(jìn)行計(jì)算。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品和尿液樣品或任何上面提到的樣品的提取物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，測量MR-proADM的水平。MR-proADM包含 Pre-Pro-ADM的第45-92位氨基酸。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，使用診斷測定方法測量腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平，所述測定方法使用一個或多個針對位于Pre-pro-ADM的第45-92位中的一個或多個表位的捕獲探針。當(dāng)在本文中提到時(shí)，“測定方法”或“診斷測定方法”可以是在診斷學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用的任何類型的測定方法。這樣的測定方法可以基于待檢測被分析物與具有一定親和性的一種或多種捕獲探針的結(jié)合。對于捕獲分子與靶分子或目標(biāo)靶分子之間的相互作用來說，親和常數(shù)優(yōu)選大于IO8M4。在本發(fā)明的文本中，“捕獲分子”是可用于結(jié)合來自樣品的目標(biāo)靶分子、即被分析物的分子。因此，捕獲分子必須在空間上和表面特征例如表面電荷、疏水性、親水性、路易斯供體和/或受體是否存在等方面適當(dāng)改形(shaped)，以特異性結(jié)合靶分子或目標(biāo)靶分子。 因此，結(jié)合可以由例如捕獲分子與靶分子或目標(biāo)靶分子之間的離子、范德華、JI-Ji、δ-π、 疏水或氫鍵相互作用或兩種或以上上面提到的相互作用的組合來介導(dǎo)。在本發(fā)明的情形中，捕獲分子可以例如選自核酸分子、糖類分子、PNA分子、蛋白質(zhì)、抗體、肽或糖蛋白。優(yōu)選情況下，捕獲分子是抗體，包括其與目標(biāo)靶或分子具有足夠親和性的片段，并包括重組抗體或重組抗體片段，以及所述抗體或其源自于變體鏈的長度為至少12個氨基酸的片段的化學(xué)和/或生物化學(xué)修飾的衍生物。優(yōu)選的檢測方法包括各種格式的免疫測定法，例如放射免疫測定法、化學(xué)發(fā)光和熒光免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、基于Luminex的珠子陣列、蛋白質(zhì)微陣列測定法，以及快速檢測格式例如免疫層析條樣試驗(yàn)。測定法可以是均相或非均相測定法、競爭和非競爭性夾心測定法。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，測定法采用夾心測定法形式，其是非競爭性免疫測定法，其中待檢測和/或定量分子與第一抗體并與第二抗體結(jié)合。第一抗體可以結(jié)合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或條上，并且第二抗體是例如用染料、放射性同位素或反應(yīng)性或催化活性部分標(biāo)記的抗體。然后通過適合的方法測量與被分析物結(jié)合的標(biāo)記抗體的量。“夾心測定法”所涉及的通用組合物和步驟是已確立的，并為專業(yè)技術(shù)人員所公知。(《免疫測定手冊》(The Immunoassay Handbook) ,David Wild Elsevier LTD，Oxford ；第三片反(2005 年 5 月)， ISBN-13 :978-0080445267 ；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb ；10(1) :4-10. PMID :16376134)，在此引為參考。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，測定方法包含兩種捕獲分子，優(yōu)選為都作為分散相存在于液體反應(yīng)混合物中的抗體，其中第一種標(biāo)記組分附著在第一種捕獲分子上，其中所述第一種標(biāo)記組分是基于熒光或化學(xué)發(fā)光淬滅或擴(kuò)增的標(biāo)記系統(tǒng)的一部分，并且所述標(biāo)記系統(tǒng)的第二種標(biāo)記組分附著于第二種捕獲分子上，使得當(dāng)兩種捕獲分子與被分析物結(jié)合后產(chǎn)生可測量信號，允許檢測在包含樣品的溶液中形成的夾心復(fù)合物。更優(yōu)選情況下，所述標(biāo)記系統(tǒng)包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與熒光染料或化學(xué)發(fā)光染料、特別是花青素類型染料的組合。在本發(fā)明的情形中，基于熒光的測定方法包含使用染料，所述染料可以例如選自 FAM(5-或6-羧基熒光素)、VIC、NED、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如 CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、Cy7、占噸、6-羧基-2，，4，，7，，4，7-六氯熒光素(HEX)、 TET、6-羧基-4，，5-二氯-2，，7，- 二甲氧基熒光素(JOE)、N，N，N' , N'-四甲基 _6_ 羧基羅丹明(TAMRA)、6_羧基-X-羅丹明(ROX)、5_羧基羅丹明-6G (R6G5)、6_羧基羅丹明-6G(RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒岡綠、香豆素類例如傘形酮、苯并亞胺類例如Hoechst 33258 ；菲啶類例如德克薩斯紅、雅吉瓦黃、Alexa Fluor、PET、溴化乙錠、吖啶類染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、嚇啉染料、聚甲炔染料等。在本發(fā)明的情形中，基于化學(xué)發(fā)光的測定方法包含根據(jù)化學(xué)發(fā)光材料的物理原理使用染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化學(xué)技術(shù)百科全書》(Encyclopedia of chemical technology)第四版，J. I. Kroschwitz 執(zhí)行主編，Μ. Howe-Grant 編輯，John ffiley&Sons, 1993,vol. 15,p. 518-562中，在此引為參考，包括在551-562頁中的引用文獻(xiàn)。 優(yōu)選的化學(xué)發(fā)光染料是吖啶酯。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，使用具有低于0. 3nmol/L的檢測極限以及在正常范圍內(nèi) <30% CV的測定間精確度的MR-proADM測定方法，在對象中預(yù)測初次不利事件或鑒定具有發(fā)生初次不利事件的高風(fēng)險(xiǎn)的對象。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是使用針對腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的捕獲探針、例如抗體，在對象中預(yù)測初次不利事件或鑒定具有發(fā)生初次不利事件的高風(fēng)險(xiǎn)的對象。在本發(fā)明的情形中，特別優(yōu)選的是使用針對包含在Pre-pro-ADM的第45_92位氨基酸中的表位的一種或多種抗體。
實(shí)施例下面的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了更詳細(xì)的概述，但是不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明的主題內(nèi)容的限制。方法研究群體Malme飲食與癌癥(The Malmo Diet and Cancer) (MDC)研究是基于社區(qū)的、 前瞻性流行病學(xué)組群，包含在1991年至1996年間登記的28，449人。從該組群中隨機(jī)選擇 6，103人參加MDC心血管組群(MDC Cardiovascular Cohort)，該組群被設(shè)計(jì)用于調(diào)查動脈粥樣硬化的流行病學(xué)。4，707個對象的心血管風(fēng)險(xiǎn)因子和血漿生物標(biāo)志物的完整數(shù)據(jù)可用。 將在基線時(shí)患有流行的心血管疾病的參加者排除后，在冠狀血管事件分析中有4，601位參加者，在所有心血管事件分析中有4，483位參加者。臨床檢查和測定法所有參加者經(jīng)歷了病史、身體檢查和標(biāo)準(zhǔn)心血管風(fēng)險(xiǎn)因子的實(shí)驗(yàn)室評估。在仰臥位休息10分鐘后使用水銀血壓計(jì)測量血壓。糖尿病被定義為空腹血糖高于6. Ommol/ L、自己報(bào)告的糖尿病醫(yī)生診斷或使用抗糖尿病藥物。吸煙由自己提供的調(diào)查問卷引出， 其中當(dāng)前吸煙被定義為在過去一年中的任何吸煙。我們在Malme大學(xué)醫(yī)院臨床化學(xué)科 (Department of Clinical Chemistry,University HospitalMalmo)
了空腹總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯。LDL膽固醇按照Friedewald的公式計(jì)算。使用在收集后立即在_80°C下冷凍的空腹血漿樣本，評估了所有參加者的心血管生物標(biāo)志物。C反應(yīng)蛋白通過高靈敏度測定法測量(Tina-quant CRP, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)。LpPLA2活性使用[3H]-血小板活化因子作為底物進(jìn)行雙份測量 (Persson M等“在中年非糖尿病對象中升高的Lp_PLA2水平為心血管事件發(fā)生時(shí)的代謝綜合征添力口了預(yù)后信息，，(Elevated Lp-PLA2 levels add prognostic information to the metabolic syndrome on incidence of cardiovascular events among middle-aged nondiabetic subjects), Arterioscler Thromb Vase Biol.2007 ;27 :1411-1416)。 MR-proANP和MR-proADM使用靶向相應(yīng)肽中間區(qū)中的氨基酸的免疫發(fā)光夾心測定法測量 (BRAHMS, AG, Germany) (Morgenthaler NG等“用于人類血漿中心房利尿鈉肽原中間區(qū)白勺免疫發(fā)光定法，，(Immunoluminometric assay for the midregion of pro-atrial natriuretic peptide in human plasma), Clin Chem. 2004 ；50 :234-236 ；Morgenthaler NG等“使用免疫發(fā)光測定法測量血漿中的中段腎上腺髓質(zhì)素原”(Measurement of midregional proadrenomedul1 in in plasma with an immunoluminometric assay),Clin Chem. 2005 ；51 :1823-1829)。NT-proBNP 使用 Dimension RxL N-BNP 方法(Dade-Behring, Germany)測定(Di SF 等“Dade Behring Dimension RxL 自動化 N 端 proBNP (NT-proBNP)方法的分析評估以及與 Roche Elecsys 2010 的比較”(Analytical evaluation of the Dade Behring Dimension RxL automated N-Terminal proBNP(NT-proBNP)method and comparison with the Roche Elecsys 2010),Clin Chem Lab Med. 2005 ；43 :1263-1273)。 半胱氨酸蛋白酶抑制劑C使用粒子增強(qiáng)的免疫濁度測定法測量(N Latex Cystatin C,Dade Behring, IL) (Shlipak MG等“半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與老年人中死亡和心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，，(Cystatiri C and the risk of death and cardiovascular events among elderly persons)，N Engl J Med. 2005 ；352 :2049-2060)。臨床終點(diǎn)我們研究了兩種主要結(jié)果冠狀血管事件和所有心血管事件。確定結(jié)果事件的步驟以前已經(jīng)詳細(xì)描述(Rosvall M等“冠狀血管事件的發(fā)病率和病例致死率與頸總動脈內(nèi)月莫-中匿#，，(Incident coronary events and case fatality in relation to common carotid intima-media thickness), J Intern Med. 2005 ；257 :430-437 ；Rosvall M等“中風(fēng)發(fā)病率與即使不存在斑塊情況下的頸動脈MT相關(guān)”ancidence of stroke is related to carotid IMT even in the absence of plaque),Atherosclerosis. 2005 ； 179 325-331)。冠狀血管事件被定義為致死或非致死急性冠狀血管綜合征，包括心肌梗塞或由缺血性心臟病引起的死亡。所有心血管事件被定義為致死或非致死急性冠狀血管綜合征， 包括心肌梗塞、致死或非致死性中風(fēng)或由心血管疾病引起的死亡。事件通過將每位瑞典公民的10位數(shù)個人身份證號與兩個登記中心——瑞典醫(yī)院出院登記中心(Swedish Hospital Discharge Register)和瑞典死亡原因登記中心(Swedish Cause of Death Register)進(jìn)行聯(lián)絡(luò)來鑒定。心肌梗塞分別根據(jù)《國際疾病分類》第9和第10修訂版(International Classification of Diseases 9th and 10th Revisions) (ICD9 和 ICD10)的代碼組 410 和121來定義。由缺血性心臟病引起的死亡根據(jù)代碼組412和414(1⑶9)或122-123和 125(1⑶10)在瑞典死亡原因登記中心中定義。致死或非致死中風(fēng)使用代碼組430、431和 434(1⑶9)。使用這些登記中心的結(jié)果的分類以前已驗(yàn)證過(Engstrom G等“都市群體中中風(fēng)發(fā)病的地理分布與社會經(jīng)濟(jì)環(huán)境和心血管風(fēng)險(xiǎn)因子的流行性的關(guān)聯(lián)”(Geographic distribution of stroke incidence within an urban population :relations to socioeconomic circumstances and prevalence of cardiovascular risk factors)， Stroke. 2001 ；32 :1098-1103)。結(jié)果的隨訪延伸到 2003 年 12 月 31 日。統(tǒng)計(jì)分析具有非正態(tài)分布的連續(xù)生物標(biāo)志物變量在分析前進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。我們執(zhí)行了多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，以檢測生物標(biāo)志物與事件發(fā)生率之間的關(guān)聯(lián)。我們證實(shí)，風(fēng)險(xiǎn)假定的均衡性得到滿足。風(fēng)險(xiǎn)比被表示成相應(yīng)生物標(biāo)志物的每ISD的增量。每種生物標(biāo)志物針對每個終點(diǎn)進(jìn)行單獨(dú)測試，并對傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子(年齡、性別、收縮壓、舒張壓、抗高血壓療法的使用、當(dāng)前吸煙、糖尿病、LDL膽固醇、HDL膽固醇和體重指數(shù))進(jìn)行調(diào)整。接下來，將與結(jié)果顯示出顯著關(guān)聯(lián)性的所有生物標(biāo)志物包含在逆向剔除模型中，并強(qiáng)制加入傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子。P < 0. 05被用作將生物標(biāo)志物保留在該模型中的標(biāo)準(zhǔn)。為了評估模型的差別，我們?yōu)槭褂脗鹘y(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子并使用或不使用生物標(biāo)志物的模型計(jì)算C-統(tǒng)計(jì)數(shù)值。C-統(tǒng)計(jì)數(shù)值是受試者工作特征曲線下面積的概括(Pencina MJ 等“評估新標(biāo)志物的增加預(yù)測能力從ROC曲線下面積到重新分類等”(Evaluating theadded predictive ability of a new marker :from area under the ROC curve to reclassification and beyond), Stat Med. 2008 ；27 :157-172)。我們使用 10 年時(shí)冠狀血管或心血管事件的發(fā)生率作為結(jié)果。為了評估風(fēng)險(xiǎn)模型的全局校準(zhǔn)，我們?yōu)槭褂没虿皇褂蒙飿?biāo)志物的模型計(jì)算Hosmer-Lemeshow統(tǒng)計(jì)數(shù)值。Hosmer-Lemeshow統(tǒng)計(jì)數(shù)值的不顯著的P-值表示在預(yù)測的風(fēng)險(xiǎn)十分位數(shù)中預(yù)測和觀察到的事件率之間的良好一致性。我們還按照以前檢建議的方法(Ridker PM等“用于在婦女中評估全面心血管風(fēng)險(xiǎn)的改進(jìn)算法的開發(fā)和驗(yàn)證Reynolds風(fēng)險(xiǎn)評分”(Development and validation of improved algorithms for the assessment of global cardiovascular risk in women the Reynolds Risk Score), JAMA, 2007 ；297 :611-619 ；Pencina MJ 等“評估新標(biāo)志物的增加預(yù)測能力從ROC曲線下面積到重新分類等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker :from area under the ROC curve to reclassification and beyond), Stat Med. 2008 ;27 :157-172)，評估了在國家膽固醇教育項(xiàng)目成年人治療組 III(National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III)(ATP3)中生物標(biāo)志物重新分類風(fēng)險(xiǎn)的能力。根據(jù)傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子分值，參加者最初被分類為低、中或高風(fēng)險(xiǎn)，如果他們的預(yù)測冠狀血管事件10年風(fēng)險(xiǎn)分別< 10%、10%到< 20%或彡20%的話。 然后允許使用添加的生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)將參加者重新分類到不同類別中。我們評估了被重新分類的參加者的數(shù)量，也按照(Pencina MJ等“評估新標(biāo)志物的增加預(yù)測能力從ROC曲線下面禾只到重新分類等，，(Evaluating the added predictive ability of a new marker from area under the ROC curve to reclassification and beyond), Stat Med. 2008 ；27 157-172)的描述計(jì)算了凈重新分類指數(shù)(NRI)和綜合鑒別指數(shù)(IDI)。在NRI的計(jì)算中， 如果個體被重新分類到更高類別并在后來發(fā)生冠狀血管事件，或者如果他們被重新分類到更低類別并在隨訪期間保持未發(fā)生事件，則認(rèn)為個體被準(zhǔn)確重新分類。IDI是模型性能的類似度量，當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)模型為發(fā)生事件的個體指派更高概率并為保持無事件的個體指派更低概率時(shí)，模型性能得到改進(jìn)。與NRI相反，IDI是基于連續(xù)概率，因此指數(shù)的改進(jìn)不依賴于擴(kuò)過風(fēng)險(xiǎn)類別閾值的移動。所有分析使用Stata軟件8. 0版(MataCorp)進(jìn)行，例外的是用于風(fēng)險(xiǎn)假定的均衡性的檢驗(yàn)，其使用用于R的存活率包來進(jìn)行，以及C-統(tǒng)計(jì)數(shù)值，其使用用于R的ROCR包來產(chǎn)生(www, r-proiect. org)。如果雙邊P-值小于0. 05，檢驗(yàn)被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果研究樣品的特征顯示在表1中。樣品的平均年齡是58歲。使用單一生物標(biāo)志物預(yù)測心血管事件在平均10. 6年的隨訪期間，分別在288位和169位參加者中發(fā)生了初次心血管和初次冠狀血管事件。用于單個生物標(biāo)志物與心血管事件的關(guān)聯(lián)的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的結(jié)果顯示在表2中。在對傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行調(diào)整后，6種生物標(biāo)志物中的5種(NT-proBNP、CRP、 半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、MR-proADM、LpPLA2)是心血管事件發(fā)生的顯著預(yù)測因子。使用了幾種標(biāo)準(zhǔn)來總結(jié)向經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因子添加單個生物標(biāo)志物的預(yù)后功效(表2)。 基于經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因子的模型的C-統(tǒng)計(jì)數(shù)值為0. 772，并且添加單個生物標(biāo)志物導(dǎo)致C-統(tǒng)計(jì)數(shù)值的少量增加(< 0. 005)。模型的校準(zhǔn)良好，包含或不包含生物標(biāo)志物時(shí)Hosmer-Lemeshow P-值> 0. 05。對于所有生物標(biāo)志物來說，NRI和IDI都不顯著。
使用單一生物標(biāo)志物預(yù)測冠狀血管事件用于冠狀血管事件的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的結(jié)果顯示在表3中。當(dāng)與經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因子一起單個加入到模型中時(shí)，6種生物標(biāo)志物中的4種(NT-proBNP、MR-proANP、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、MR-proADM)是冠狀血管事件發(fā)生的顯著預(yù)測因子。NT-proBNP和MR-proADM的升高與冠狀血管事件的最高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，調(diào)整過的風(fēng)險(xiǎn)比每SD增量分別為1.置信區(qū)間，1.07-1. 44)和 1. 25 (95% 置信區(qū)間，1. 10-1.42)。與經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因子相結(jié)合用于預(yù)測冠狀血管事件的C-統(tǒng)計(jì)數(shù)值是0. 777。對于心血管事件來說，添加單個生物標(biāo)志物不顯著提高C-統(tǒng)計(jì)數(shù)值(表幻。包含或不包含生物標(biāo)志物時(shí)模型校準(zhǔn)良好(Hosmer-Lemeshow ρ > 0. 05)，并且NRI不顯著。對于MR-proADM來說 IDI顯著(p = 0. 02)，對于NT-proBNP來說邊界顯著(p = 0. 05)。多種生物標(biāo)志物用于心血管和冠狀血管事件通過將生物標(biāo)志物成組加入到用于心血管事件和冠狀血管事件的預(yù)測模型中，測試了生物標(biāo)志物的組合。然后使用逐步逆向剔除來除去提供信息較少的生物標(biāo)志物，使用 P < 0. 05作為保留的標(biāo)準(zhǔn)。保留了三種生物標(biāo)志物用于預(yù)測心血管事件(NT-proBNP、CRP 和LpPLA2)，并保留了兩種生物標(biāo)志物用于預(yù)測冠狀血管事(NT-proBNP和MR-proADM)。用于兩種結(jié)果的多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的結(jié)果顯示在表4中。將顯著生物標(biāo)志物的組摻入到用于心血管和冠狀血管事件的預(yù)測模型中，導(dǎo)致C-統(tǒng)計(jì)數(shù)值的少量增加(約0.01)。對于任一種結(jié)果來說NRI不顯著。另一方面，IDI的ρ-值對于心血管事件來說為0. 06，對于冠狀血管事件為0. 02。表5分別顯示了使用用于心血管事件(A組)和冠狀血管事件(B組)的生物標(biāo)志物重新分類的參加者的數(shù)量。對于心血管事件來說，使用生物標(biāo)志物將273位參加者(6% ) 移動到更高或更低風(fēng)險(xiǎn)類別中。只有39位參加者(0.8%)被移動到高風(fēng)險(xiǎn)類別中(10年預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)> 20% )。對于冠狀血管事件來說，137位(3% )參加者被重新分類到更高或更低風(fēng)險(xiǎn)類別中，其中只有22位(0. 5% )被移動到高風(fēng)險(xiǎn)類別中。為每種終點(diǎn)構(gòu)建了簡單生物標(biāo)志物風(fēng)險(xiǎn)分值。三種生物標(biāo)志物預(yù)測心血管事件的 β系數(shù)在量值上相似，兩種生物標(biāo)志物預(yù)測冠狀血管事件的β系數(shù)也是如此。因此，我們選擇在生物標(biāo)志物風(fēng)險(xiǎn)打分時(shí)對每種生物標(biāo)志物進(jìn)行同等權(quán)重。對于心血管疾病來說，每位參加者被指派0、1、2或3的分值，對應(yīng)于升高的生物標(biāo)志物的數(shù)量，升高被定義為水平高于平均值1SD。通過類似方式，對于冠狀血管事件來說，每位參加者被指派0、1或2的分值。 圖6描述了根據(jù)生物標(biāo)志物風(fēng)險(xiǎn)計(jì)分值得到的心血管(圖Α)或冠狀血管(圖B)事件的累積發(fā)生率。表1 研究樣品的特征(n = 4，601)
1權(quán)利要求
1.一種用于在健康對象中預(yù)測發(fā)生不利事件的風(fēng)險(xiǎn)或鑒定具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的健康對象的方法，所述方法包含 測定從所述對象獲得的樣品中腎上腺髓質(zhì)素原或其至少12個氨基酸的片段的水平；以及 使用所述腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平預(yù)測初次不利事件或由其推斷發(fā)生初次不利事件的風(fēng)險(xiǎn)，其中對象是健康的。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述不利事件是冠狀血管或心血管事件。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中對象是具有低負(fù)荷傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子的對象，所述傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子選自吸煙、糖尿病、高脂血癥、高血壓、高體重指數(shù)、男性、抗高血壓治療和年齡。
4.權(quán)利要求1到3的方法，其中測定腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平并將其用作單一標(biāo)志物。
5.權(quán)利要求1到3的方法，其中對象中初次不利事件的預(yù)測或具有發(fā)生初次不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象的鑒定，通過附加地測定和使用至少一種其他標(biāo)志物的水平來改進(jìn)，所述其他標(biāo)志物選自CRP、LpLA2、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C和包括ANP、proANP、NT-proANP、 MR-proANP、BNP, proBNP、NT-proBNP的A型與B型利尿鈉肽及其前體和片段、甘油三酯、 HDL膽固醇或其亞組分、LDL膽固醇或其亞組分、⑶F 15、ST2、降鈣素原及其片段、血管加壓素原及其包括和肽素、血管加壓素和神經(jīng)垂體激素運(yùn)載蛋白的片段、內(nèi)皮素原-ι及其包括 CT-proET-l、NT-proET-l、大內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素_1的片段。
6.權(quán)利要求5的方法，其中只測定并使用下列標(biāo)志物的水平proBNP或其具有至少12 個氨基酸的片段或前體、CRP、LpLA2與腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的組合。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在對象中預(yù)測初次心血管事件或鑒定具有發(fā)生初次心血管事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象。
8.權(quán)利要求5的方法，其中只測定并使用下列標(biāo)志物的水平proBNP或其具有至少12 個氨基酸的片段或前體，與腎上腺髓質(zhì)素原或其至少12個氨基酸的片段的組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中在對象中預(yù)測初次冠狀血管事件或鑒定具有發(fā)生初次冠狀血管事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象。
10.權(quán)利要求1到9的方法，其中附加地測定選自下列的至少一種臨床參數(shù)年齡、性別、收縮壓、舒張壓、抗高血壓治療、體重指數(shù)、糖尿病的存在、當(dāng)前吸煙。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用于在對象中預(yù)測發(fā)生不利事件的風(fēng)險(xiǎn)或鑒定具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象的方法，其中腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平單獨(dú)或與其他可用于預(yù)后的實(shí)驗(yàn)室或臨床參數(shù)聯(lián)合使用，通過可以選自下列可選方案的方法用來預(yù)測對象發(fā)生不利事件的風(fēng)險(xiǎn)與“健康”或“表觀健康”對象群體中全部預(yù)定樣品中的腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平的中位數(shù)進(jìn)行比較，與“健康”或“表觀健康”對象群體中全部預(yù)定樣品中的腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的水平的分位數(shù)進(jìn)行比較，根據(jù)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析或使用風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算例如NRJ (凈重新分類指數(shù))或IDI (綜合鑒別指數(shù))進(jìn)行計(jì)算。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中使用診斷測定方法測量MR-proADM的水平，所述診斷測定方法包含一個或多個針對位于Pre-pro-ADM的第45-92位氨基酸中的一個或多個表位的捕獲探針。
13.MR-proADM測定方法在對象中預(yù)測不利事件或鑒定具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象中的應(yīng)用，所述測定方法具有低于0. 3nmol/L和/或低于健康對象群體的中位數(shù)的檢測極限，以及在正常范圍內(nèi)< 30% CV的測定間精確度。
14.針對腎上腺髓質(zhì)素原或其片段的捕獲探針在對象中預(yù)測不利事件或鑒定具有發(fā)生不利事件的提高風(fēng)險(xiǎn)的對象中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中捕獲探針針對位于Pre-pro-ADM的第45-92位氨基酸中的一個或多個表位。
全文摘要
本發(fā)明的主題是用于預(yù)測初次冠狀血管和心血管事件的測定方法和體外方法，以及可用于其中的生物標(biāo)志物。
文檔編號G01N33/74GK102203616SQ200980139928
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日
發(fā)明者克里斯托弗·牛頓-陳, 奧勒·米蘭德, 安德烈亞斯·貝格曼, 托馬斯·J·王, 約阿希姆·斯特魯克 申請人:B.R.A.H.M.S有限公司