專(zhuān)利名稱(chēng)：：豬瘟病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR鑒別檢測(cè)試劑盒及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明所涉及的豬瘟病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR鑒別檢測(cè)試劑盒及其生產(chǎn)方法，屬于獸醫(yī)微生物學(xué)領(lǐng)域動(dòng)物病毒學(xué)技術(shù)。
背景技術(shù)：
：豬癌(ClassicalSwineFever，CSF)是由豬癌病毒(ClassicalSwineFevervirus,CSFV)引起的豬的高度致死性、接觸性傳染病，其特征是小血管壁的變性，導(dǎo)致內(nèi)臟器官中的多發(fā)性出血、壞死和梗死(殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué).第二版.北京科學(xué)出版社，1997,645-664)。根據(jù)OIE制定的《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》2006年版，CSF被列為必須報(bào)告的疫病之一，在我國(guó)被列為“二類(lèi)動(dòng)物疫病”，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。目前臨床上CSF在流行特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)和病理變化等方面表現(xiàn)出非典型性的特征，同時(shí)存在著與其它病混合感染的狀況。因此對(duì)其診斷非常困難(周緒斌，王新平，宣華，涂長(zhǎng)春.鑒別牛病毒性腹瀉粘膜病毒和CSFV復(fù)合PCR方法及其應(yīng)用.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，22(6)173-179)，必須依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室診斷才能確診。由于CSFV在細(xì)胞內(nèi)繁殖滴度較低，并且不產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的病變，致使從病原學(xué)角度的診斷技術(shù)研究很困難；且豬瘟病毒只有一個(gè)血清型，致使無(wú)法從血清學(xué)角度區(qū)別感染群和免疫群，目前CSF的各種不太成熟的試劑盒通常存在靈敏度較低、特異性差、耗時(shí)等問(wèn)題。自2009年豬瘟已被國(guó)家納入強(qiáng)制免疫動(dòng)物疫病目錄，對(duì)疫苗免疫豬和自然感染豬的鑒別診斷具有十分重要的意義(Van0irschot，J.Τ.Vaccinologyofclassicalswinefever:fromlabtofield.VeterinaryofMicrobiology.2003,96:367_384.),但是目前尚沒(méi)有成熟的方法或試劑盒能鑒別檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗免疫群和野毒感染群。目前常見(jiàn)的CSF病原學(xué)診斷技術(shù)主要有病毒分離法、免疫熒光技術(shù)、兔體交互免疫試驗(yàn)、ELISA抗原捕獲法、RT-PCR技術(shù)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法等。豬瘟病毒分離技術(shù)(HaegemanA，DewulfJ,VranckenR,TignonΜ,RibbensS,KoenenF.CharacterisationofthediscrepancybetweenPCRandvirusisolationinrelationtoclassicalswinefevervirusdetection.JournalofVirologicalMethods.2006,136:44_50)是豬癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，敏感，但檢測(cè)周期長(zhǎng)、費(fèi)力、需實(shí)驗(yàn)設(shè)施，不適合全群普查；豬瘟免疫熒光技術(shù)又可分為直接免疫熒光和間接免疫熒光，應(yīng)用熒光標(biāo)記的一抗或二抗對(duì)組織切片進(jìn)行染色觀察，以檢測(cè)是否有CSFV感染。免疫熒光法是目前檢測(cè)CSF病原的法定方法，但該法需要有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)人員，該技術(shù)經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)，在制片特別是組織切片過(guò)程中難度大，耗時(shí)長(zhǎng)。組織抹片的制作也可能由于選定的樣品為非病灶區(qū)而漏檢。因而該方法也受到一定程度的限制；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法用敏感仔豬進(jìn)行接種試驗(yàn)或用兔體交互免疫試驗(yàn)進(jìn)行病原的鑒定，此法可用來(lái)鑒別豬瘟兔化弱毒疫苗毒和野毒感染，但該法需在有條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，而且費(fèi)時(shí)；抗原捕獲ELISA法(D印nerK,PatonDJ,CruciereC,DeMiaGM,MullerA,KoenenF,StarkR,LiessB.Evaluationoftheenzyme—1inkedimmunosorbentassayfortherapidscreeninganddetectionofclassicalswinefevervirusantigensinthebloodofpigs.RevueScientifiqueetTechnique.1995,14(3):677_689.)利用雙抗夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法捕獲CSFV于酶標(biāo)板上，然后利用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行顯色，根據(jù)吸光值的高低來(lái)判斷有無(wú)CSFV，目前這種試劑盒主要靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴，而且敏感度較氐；RT-PCR技術(shù)(HandelK，KehlerH，HillsK，PasickJ.Comparisonofreversetranscriptase-polymerasechainreaction,virusisolation,andimmunoperoxidaseassaysfordetectingpigsinfectedwithlow,moderate，andhighvirulentstrainsofclassicalswinefevervirus.JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation.2004,16(2):132_138.)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和反轉(zhuǎn)錄套式PCR(RT-Npcr)對(duì)CSFV成功進(jìn)行了擴(kuò)增。雖然該法具有操作簡(jiǎn)便，快速，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但RT-nPCR要經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄、PCR、二次PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳，大量檢測(cè)時(shí)易造成氣溶膠污染，不利于實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)。上述各種方法及其不太成熟的試劑盒通常存在靈敏度較低、特異性差、耗時(shí)、無(wú)法區(qū)分免疫群與感染群等諸多問(wèn)題。因此開(kāi)發(fā)豬瘟病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR鑒別檢測(cè)技術(shù)對(duì)于豬瘟病原的鑒別檢測(cè)具有十分重要的意義。本發(fā)明的目的是利用TaqMan-MGB熒光定量PCR技術(shù)，建立豬瘟病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR快速鑒別檢測(cè)技術(shù)，從而制備用于CSFV快速鑒別檢測(cè)的試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容一、本發(fā)明的主要技術(shù)原理實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction,RQ-PCR)技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的一種新型核酸定量技術(shù)(Heid，C.A.,etal.,RealtimequantitativePCR.[J].GenomeRes,1996.6(10)986-94.技術(shù)是通過(guò)始點(diǎn)定量和熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累積熒光強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)的，它可以采用絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)煞N方式實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RQ-PCR)技術(shù)包括探針類(lèi)和染料類(lèi)兩種(Wittwer，C.Τ.，etal.，ContinuousfluorescencemonitoringofrapidcycleDNAamplification.Biotechniques,1997.22(1)=130-1,134-8)。探針類(lèi)是利用與模板特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，以TaqManTM技術(shù)為代表，常用的熒光基團(tuán)是FAM，TET，VIC，HEX；染料類(lèi)是應(yīng)用一種能與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，熒光信號(hào)強(qiáng)弱與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量，常用的是SYBRGreenI染料。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)常用TaciMan技術(shù)(Heid，C.Α.，etal.，RealtimequantitativePCR.GenomeRes,1996.6(10)986-94.),^ΗPerkinElmer它在PCR擴(kuò)增體系中加入一條20多bp的特異熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記上熒光發(fā)射基團(tuán)(R)和淬滅基團(tuán)(Q)，在PCR反應(yīng)中設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)模板系列對(duì)照反應(yīng)管和陰性對(duì)照管，在PCR擴(kuò)增的退火或延伸步驟中檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，得出實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RQ-PCR)的動(dòng)力學(xué)曲線圖。探針完整時(shí)，兩者發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，F(xiàn)RET)，R基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)淬滅；PCR擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)，Taq酶發(fā)揮5'-3'外切酶活性，將探針降解，R基團(tuán)與Q基團(tuán)分離，Q基團(tuán)淬滅作用隨即消失，R基團(tuán)釋放熒光信號(hào)，被熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收，即每完成一次擴(kuò)增，就有一個(gè)熒光信號(hào)累積，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步(Hiyoshi，M.andHosoiS.，AssayofDNAdenaturationbypolymerasechainreaction-drivenfluorescentlabelincorporationandfluorescenceresonanceenergytransfer.AnalBiochem,1994.221(2):306_11；Holland,P.Μ.,etal.,Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5'-3'exonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase.ProcNatlAcadSciUSA,1991.88(16)7276-80.)。其工作原理見(jiàn)圖1。TaqManMGB探針(TaqManMinorGrooveBinderprobe)(Decaro,N.,etal.,Aminorgroovebinderprobereal-timePCRassayfordiscriminationbetweentype2-basedvaccinesandfieldstrainsofcanineparvovirus.JVirolMethods,2006.136(1-2)65-70)與普通TaqMan水解探針不同之處在于TaqManMGB探針的3’端連接一個(gè)不發(fā)熒光的Q基團(tuán)和一個(gè)特殊的小溝結(jié)合子(MinorGrooveBinder)，這種特殊的設(shè)計(jì)賦予了MGB探針三大優(yōu)勢(shì)一是顯著提高Tm值，這樣可以減少探針設(shè)計(jì)長(zhǎng)度，對(duì)AT富含區(qū)的探針設(shè)計(jì)更為有利；二是可以降低背景熒光信號(hào)，提高信噪比，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確，分辨率更高；三是提高了探針與互補(bǔ)模板的結(jié)合特異性，即使一個(gè)堿基的不匹配都能精確分辨。該方法已經(jīng)廣泛用于等位基因鑒定、單核苷酸多態(tài)性分析、定點(diǎn)突變檢測(cè)等。其工作原理見(jiàn)圖2。計(jì)算樣品的CT值就可以確定樣品的起始模板量。CT值是指樣品管的熒光信號(hào)達(dá)到某一固定閾值的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)，閾值是由所選定作為基線的各個(gè)循環(huán)數(shù)的ARn值的平均數(shù)加上其標(biāo)準(zhǔn)差所得的數(shù)值決定。PCR循環(huán)在到達(dá)CT值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此CT值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的CT值是恒定的。根據(jù)CT值與初始模板濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，利用標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖3。利用各樣品的CT值即可計(jì)算樣品的起初模板量。二、本發(fā)明的詳細(xì)描述1.MGB探針和引物的設(shè)計(jì)對(duì)GenBank公布的豬瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和綿羊邊界病病毒(BDV)全序列進(jìn)行綜合比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在其5'端非編碼區(qū)的137位存在一個(gè)A/GSNP位點(diǎn)，即豬瘟兔化弱毒疫苗病毒株在該位點(diǎn)為A，而其它野毒株和其他疫苗株該位點(diǎn)為G，利用PrimerExpress2.O軟件，針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了豬瘟病毒野毒株特異的MGB探針，并在兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)了一套通用引物，命名為上游引物MGB-F、下游引物MGB-R、探針MGB-P，序列如下MGB-F:5，-CATGCCCACAGTAGGACTAGCAAA-3，MGB-R:5，-GAACTACTGACGACTGTCCTGTACTCA-3，MGB-P:5，-FAM-CTAGCCGTAGTGGCGA-MGB-3，其中FAM為羧基熒光素；MGB為小溝結(jié)合子。2.陽(yáng)性對(duì)照的制備陽(yáng)性對(duì)照采用豬瘟石門(mén)標(biāo)準(zhǔn)毒株(SM)特異克隆其非編碼區(qū)約300bp的片段體外逆轉(zhuǎn)錄獲得，濃度為(0.1260.368μg/10μL)。制備方法如下(1)目的片段擴(kuò)增采用SNP-F:GACGGCCGAACTGGGCTA；SNP-RATTCAACTCCATGTGCCATGAA作為引物，按常規(guī)RT-PCR反應(yīng)體系配成RT-PCR反應(yīng)液，加入陽(yáng)性SMRNA模板，用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，得到大量目的片段，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和分離擴(kuò)增產(chǎn)物，紫外顯像可見(jiàn)一條分子量大小為307bp的特異條帶(見(jiàn)序列6)，且無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，證明擴(kuò)增成功，在亮帶部位切下PCR凝膠產(chǎn)物保存?zhèn)溆谩?2)純化目的片段采用的GelExtractionKit試劑盒純化上述PCR凝膠產(chǎn)物中的目的核酸片段，再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行粗略定量。(3)連接與轉(zhuǎn)化反應(yīng)按pGM-TEasy連接試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行PCR純化產(chǎn)物與T載體的連接反應(yīng)，構(gòu)建含目的片段質(zhì)粒。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入T0P10感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂于加有40μLX-Gal(20mg/mL)禾口8μLIPTG(200μg/mL)的瓊脂平板，37°C培養(yǎng)1216h。(4)克隆菌落的擴(kuò)大培養(yǎng)與鑒定培養(yǎng)后平板上長(zhǎng)出藍(lán)色和白色菌落，挑取飽滿、表面清亮的單個(gè)白色菌落接種于含有氨芐抗性的5mlLB培養(yǎng)基中，每個(gè)菌落都記錄編號(hào)，37°C、180r/min搖床培養(yǎng)1216h。應(yīng)用PlasmidMiniKitI質(zhì)料提取試劑盒對(duì)每個(gè)菌落的培養(yǎng)菌液進(jìn)行質(zhì)料的提取，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。(5)體外轉(zhuǎn)錄以鑒定后的陽(yáng)性質(zhì)料為模板，按Promega公司的RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystem-T7試劑盒說(shuō)明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄。(6)轉(zhuǎn)錄后處理1)力卩RQlRNase-FreeDNase至終濃度為1μ/μg模板DNA，37°C放置15min。2)用1倍體積的TE飽和苯酚(pH4.5)氯仿異戊醇=25241抽提，渦旋lmin,12000r/min離心2min。3)將上層水相轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加1倍體積的氯仿異戊醇=241，渦旋lmin,12000r/min離心2min。4)將上層水相轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加1倍體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和1倍體積的異丙醇或2.5倍體積的95%乙醇，混勻置于冰上25min，12000r/min離心lOmin。5)輕輕棄去或吸出上清，用Iml的70%乙醇清洗離心管，真空環(huán)境下干燥離心管中的RNA，并用TE緩沖液重懸RNA，保存在_70°C。(7)轉(zhuǎn)錄后鑒定與檢驗(yàn)經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA用IXTE緩沖液(IOmMTris-HCl,ρΗ8·5，ImMEDTA)按1100到1300稀釋?zhuān)米贤夥止夤舛扔?jì)測(cè)定OD26tZOD28tl比值(0D26C1/0D28C1=1.92.1之間說(shuō)明所得的RNA純度較高，比值若低于1.9可能有蛋白污染，若高于2.1則可能RNA已降解)及OD26tl的值(IOD26tl相當(dāng)于大約40ug/mlRNA)，鑒定合格的即可用作陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品原液。將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品原液用DEPC水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫蕉鄠€(gè)梯度的稀釋液，各個(gè)梯度的稀釋液用試劑盒CSFVTaqMan-MGBPCR檢測(cè)試劑進(jìn)行CT值標(biāo)定，取CT值在15.0-20.0的稀釋液作為試劑盒的強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照，取CT值在35.0左右的稀釋液作為試劑盒的弱陽(yáng)性對(duì)照。3.質(zhì)控樣本及陰性對(duì)照的信息質(zhì)控樣本菌、毒株及細(xì)胞見(jiàn)表1，試驗(yàn)用豬瘟兔化弱毒疫苗信息見(jiàn)表2。表1質(zhì)控菌、毒株及細(xì)胞背景信息<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.陰性對(duì)照背景信息采用無(wú)特異性病原(SPF)豬扁桃體或頌下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)，按15倍體積加入磷酸鹽緩沖液(PBS)液，于研缽或組織勻漿器中充分研磨，然后3000r/min離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中備用。4)用于陰性對(duì)照及質(zhì)控樣本RNA的制備。(1)取1.5mLEppendorf管，每管加入500μLTrizol，分別加入被檢樣品，一份樣品換一個(gè)吸頭，充分混勻，靜置5min；再加入200μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5s(不能過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻)。于4°C、12000r/min離心15min。(2)取1.5mLEppendorf管，加入500μL異丙醇(4°C預(yù)冷)，做標(biāo)記。取1)中的上清約500μL(注意不要吸出中間層)轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻，4°C靜置20min。(3)于4°C、12000r/min離心15min，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入600μL75%乙醇，顛倒洗滌。(4)4°C、12000g離心lOmin，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。(5)4000r/min離心10s，將管壁殘液甩到管底，用微量加樣器小心吸干，一種樣品換用一個(gè)吸頭，室溫干燥3lOmin。(6)加入25μLDEPC水輕輕混勻，溶解RNA，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉腞NA須在2h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；若需長(zhǎng)期保存須放置-70°C冰箱。5.試齊[JTrizol裂解試劑(TrizolRegeant,200mL/瓶)、SuperScriptIII(200U/μL)反轉(zhuǎn)錄酶(SuperScriptIIIReverseTranscriptase)購(gòu)自Invitrogen公司；TaqHSDNA聚合酶(5U/μL)、10XPCR緩沖液(PCRBuffer,pH8.3Tris-HCl,IOOmM；KCl,500mM；MgCl2,15mM)、dNTP混合液(dNTPMixture,2.5mM/每種)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TaqManMGB探針和引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。6.TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系的建立以CSFVSM株病毒作為模板進(jìn)行TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR，經(jīng)過(guò)對(duì)SSIII反轉(zhuǎn)錄酶、TaqHSDNA聚合酶(TaqHSDNAPolymerase)、上下游引物、探針和反應(yīng)體系的逐步優(yōu)化。最終選用的反應(yīng)體系見(jiàn)表1。表3CSFVTaqMan-MGBPCR反應(yīng)體系組分~""“"““~~~一~““~~i*TiL)“IOxPCRBuffer5dNTPMixture(2.5μΜeach)1.6SSIIIReverseTranscriptase(200υ/μ)0.3TaqHSDNAPolymerase(5υ/μ)0.5MGB-F(ΙΟμΜ)3MGB-R(ΙΟμΜ)3MGB-P(5μΜ)1.6RNASolution10ddH2Q25儀器熒光PCR檢測(cè)儀(ABI7500熒光定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司廣品)O反應(yīng)條件:50°C,20min；94°C,4min；88°C，8s；60°C,35s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)在60°C時(shí)采集一次MGB探針釋放的熒光信號(hào)。三、試劑盒生產(chǎn)組裝及應(yīng)用1.試劑盒生產(chǎn)組裝(1)對(duì)照品及水陽(yáng)性和弱陽(yáng)性對(duì)照采用豬瘟石門(mén)標(biāo)準(zhǔn)毒株(SM)特異克隆其非編碼區(qū)約300bp的片段體外逆轉(zhuǎn)錄獲得特異RNA，含量分別為(陽(yáng)性對(duì)照0.1260.368yg/10yL)和(弱陽(yáng)性對(duì)照0.0130.037μg/10μL)，300μL/管分裝，各2管，-20°C凍存?zhèn)溆?。制備方法?jiàn)附件。陰性對(duì)照采用無(wú)特異性病原(SPF)豬的扁桃體或頌下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)，按15倍體積加入0.焦磷酸二乙酯(DEPC)水，于組織勻漿器中充分研磨，然后30001·/min離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中，分裝成200μL/管，共10管，_20°C凍存?zhèn)溆?。焦碳酸二乙?DEPC)水20mL/瓶。(2)試劑Trizol裂解液40mL/瓶，分裝至棕色瓶中，4°C存放備用。TaqMan-MGBPCR反應(yīng)液每個(gè)反應(yīng)包括IOXPCRBuffer5μL、dNTPMixture(2.5μMeach)1·6μL,MGB-F(10μΜ)3μL,MGB-R(10μΜ)3μL，共12.6μL。50個(gè)反應(yīng)共計(jì)630μL，分裝成2管(365μL/管，有50μL富余)。反應(yīng)酶每個(gè)反應(yīng)包括SSIII反轉(zhuǎn)錄酶0.3yL、TaqHSDNA聚合酶0.5μL，共0.8μ。50個(gè)反應(yīng)共計(jì)45yL(有5yL富余)，分裝成1管。探針溶液用0.焦磷酸二乙酯(DEPC)水稀釋成5μM，每個(gè)反應(yīng)需1.6μL。50個(gè)反應(yīng)共計(jì)90μL(有10μL富余)，分裝成1管，-20°c凍存?zhèn)溆谩?3)試劑盒組裝(以48頭份計(jì))取上述陽(yáng)性對(duì)照和弱陽(yáng)性對(duì)照各2管，陰性對(duì)照10管，TaqMan-MGBPCR反應(yīng)液2管、反應(yīng)酶1管、探針溶液1管、Trizol1瓶(40ml)，0.焦磷酸二乙酯(DEPC)水1瓶(20ml)，正放于試劑盒中；8聯(lián)PCR反應(yīng)管及管蓋6排。2試劑盒的相關(guān)試驗(yàn)(1)特異性試驗(yàn)采用本發(fā)明人按本發(fā)明提供的方法制備的20080801、20080802、20080803三個(gè)批號(hào)的CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)試劑盒反應(yīng)液，分別取質(zhì)控樣本200μL提取RNA，按優(yōu)化后的體系和循環(huán)條件，進(jìn)行TaqMan-MGBPCR反應(yīng)，檢測(cè)其特異性。同時(shí)采用5個(gè)不同廠家的6批次豬瘟兔化弱毒疫苗株作有效性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，17個(gè)CSFV質(zhì)控株檢測(cè)均為陽(yáng)性，HCLV株檢測(cè)陰性，12個(gè)非CSFV病原檢測(cè)均為陰性，ΡΚ15細(xì)胞對(duì)照檢測(cè)陰性。證實(shí)該方法具有很好的特異性，且能鑒別豬瘟兔化弱毒疫苗株與其它CSFV株。(2)靈敏度試驗(yàn)200μLSM血毒提取RNA，紫外分光光度計(jì)(NanoDropND-1000)測(cè)定OD26tl、OD26tl/OD280,換算成濃度為64ng/μL，10—1到10_1Q梯度稀釋后，同時(shí)進(jìn)行FQ-PCR和RT_nPCR反應(yīng)(TuCC,etal..PhylogeneticcomparisonofclassicalswinefevervirusinChina.VirusResearch.2001，(81)29-37)，檢測(cè)其靈敏度。表4CSFVRT-nPCR和TaciMan-MGBPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果_測(cè)序梯度RT-nPCRTaqMan-MGBPCR值“IO"1++13.52IO"2++16.86IO"3++20.28IO4++23.67IO"5++27.07IO"6++30.44IO"7++34.02IO"8—+37.38IO"9—-37.98IO"10-一.39.77注‘‘+”表示測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性；‘‘_”表示測(cè)序結(jié)果陰性由CT值可知ICT110_8間的CT值與模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，相鄰兩個(gè)模板濃度間的CT值相差約3.3，與理論上計(jì)算的模板濃度相差10倍，CT值相差3.3相符，RT-nPCR檢測(cè)10"，由此TaqMan-MGBPCR比常規(guī)RT_nPCR的靈敏度高出10倍。(3)重復(fù)性試驗(yàn)采用20080801、20080802、20080803共3批CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)試劑盒試劑，對(duì)30個(gè)質(zhì)控樣本，采用MeDiProSuperSystem-32核酸提取儀，嚴(yán)格按照其操作說(shuō)明進(jìn)行RNA提取，溶于100μL0.焦磷酸二乙酯(DEPC)水，37°C放置20min，待其充分溶解，每個(gè)反應(yīng)取10μL，按優(yōu)化好的反應(yīng)體系和循環(huán)條件進(jìn)行CSFVTaqMan-MGBPCR反應(yīng)，每個(gè)樣本做9個(gè)重復(fù)。檢測(cè)結(jié)果參數(shù)統(tǒng)一設(shè)定為315cycle基線(Baseline)，2000閾值(Threshold)0根據(jù)CT值計(jì)算試劑盒三批試劑批間、批內(nèi)變異系數(shù)(CV)。結(jié)果顯示20080801批試劑對(duì)30個(gè)質(zhì)控樣本的檢測(cè)CT值變異系數(shù)為1.04%5.88%；20080802批試劑對(duì)30個(gè)質(zhì)控樣本的檢測(cè)CT值變異系數(shù)為1.06%7.23%；20080803批試劑對(duì)30個(gè)質(zhì)控樣本的檢測(cè)CT值變異系數(shù)為0.75%9.93%，說(shuō)明三批試劑具有很好的批內(nèi)重復(fù)性；同時(shí)，20080801,20080802,20080803批試劑對(duì)30個(gè)質(zhì)控樣本的檢測(cè)CT值變異系數(shù)為0.60%5.71%，均小于10%，說(shuō)明20080801,20080802,20080803這3批試劑具有很好的批間可重復(fù)性。(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)分別使用CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)試劑盒的20080801、20080802、20080803批試劑對(duì)30個(gè)質(zhì)控樣本進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)月1次，每批試劑做3個(gè)重復(fù)，持續(xù)5個(gè)月，檢測(cè)該CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，批號(hào)20080801、20080802、20080803的3批CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)試劑盒對(duì)30個(gè)質(zhì)控樣本的5個(gè)月的CT值變化不大，說(shuō)明該CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)試劑盒在5個(gè)月內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。(5)符合性試驗(yàn)本研究采用CSFVRT-nPCR方法作為CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)方法的符合參比，對(duì)122份臨床樣本RNA同時(shí)進(jìn)行CSFVTaqMan-MGBPCR禾口CSFVRT-nPCR檢測(cè)，結(jié)果CSFVTaqMan-MGBPCR與RT-nPCR符合率為94.3%。(6)臨床檢測(cè)對(duì)河北、湖南、北京、福建、山東、江西、四川7個(gè)省市的925份臨床樣本采用CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)試劑盒進(jìn)行CSFV檢測(cè)，同時(shí)以RT_nPCR作為符合。對(duì)925份臨床樣本檢測(cè)，MGB熒光定量PCR檢出101份，陽(yáng)性率為10.9%；RT-nPCR檢出40份，陽(yáng)性率為4.3%。符合率為92.8%(858/925)。說(shuō)明兩種方法符合率較高。3.試劑盒的應(yīng)用(1)樣品前處理及存放1)血液樣品每個(gè)反應(yīng)取200μL全血提取RNA。2)組織臟器取待檢樣品50IOOmg于潔凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加ImL0.1%焦磷酸二乙酯(DEPC)水混勻，4°C，3000r/min離心15min，取200μL上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的1.5mLEppendorf管中，編號(hào)備用。3)細(xì)胞培養(yǎng)物每個(gè)反應(yīng)取200μL細(xì)胞培養(yǎng)物提取RNA。制備的樣本在2°C8°C條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h，若需長(zhǎng)期保存應(yīng)置-70°C以下，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過(guò)3次)。(2)待檢樣品RNA的制備1)取1.5mLEppendorf管，每管加入500μLTrizol，分別加入被檢樣品，一份樣品換一個(gè)吸頭，充分混勻，靜置5min；再加入200μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5s(不能過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻)。于4°C、12000r/min離心15min。2)取1.5mLEppendorf管，加入500μL異丙醇(4°C預(yù)冷)，做標(biāo)記。取1)中的上清約500μL(注意不要吸出中間層)轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻，4°C靜置20min。3)于4°C、12000r/min離心15min，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，力口入600yL75%乙醇，顛倒洗滌。4)40C、12000g離心lOmin，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。5)4000r/min離心10s，將管壁殘液甩到管底，用微量加樣器小心吸干，一種樣品換用一個(gè)吸頭，室溫干燥3lOmin。6)加入25μLDEPC水輕輕混勻，溶解RNA，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA須在2h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；若需長(zhǎng)期保存須放置-70°C冰箱。(3)擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行。從試劑盒中取出豬瘟病毒TaqMan-MGBPCR反應(yīng)液、反應(yīng)酶和探針溶液，在室溫下融化后，2000r/min離心5s。設(shè)需PCR數(shù)為n，其中η為待檢樣品數(shù)X重復(fù)數(shù)、1管陽(yáng)性對(duì)照、1管弱陽(yáng)性對(duì)照及1管陰性對(duì)照之和，每個(gè)樣本測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表3。表5反應(yīng)體系配制表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>反/k酶0.8從探針溶液1.6μι合計(jì)15.0μΙ>(4)加樣在樣本處理區(qū)進(jìn)行。在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入上述待檢樣品RNA的制備中制備的10μLRNA溶液，補(bǔ)水至50μL蓋緊管蓋。陽(yáng)性對(duì)照和弱陽(yáng)性對(duì)照管中分別加入IOL陽(yáng)性對(duì)照和弱陽(yáng)性對(duì)照，補(bǔ)水至50μL。(5)TaqMan-MGBPCR檢測(cè)在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行。將上述PCR管放入熒光PCR檢測(cè)儀(ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司產(chǎn)品)內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置第一階段，反轉(zhuǎn)錄50°C/20min；第二階段，預(yù)變性94°C/4min；第三階段，88°C/8s,60°C/35s，40個(gè)循環(huán)，60°C采集熒光信號(hào)。試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后，由檢測(cè)儀上根據(jù)采集的動(dòng)態(tài)熒光信號(hào)曲線和CT值綜合判定結(jié)^ο(6)結(jié)果判定1)結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照無(wú)CT值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照CT值應(yīng)在15.020.0、弱陽(yáng)性對(duì)照CT值應(yīng)在35.0左右并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。3)結(jié)果描述及判定①陰性無(wú)CT值并且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中無(wú)豬瘟病毒。②陽(yáng)性CT值<35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在豬瘟病毒。③可疑(^值>35且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣本建議重做。重做結(jié)果出現(xiàn)CT值(35和典型的擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，否則為陰性。圖ITaqMan熒光定量PCR工作原理在PCR反應(yīng)退火過(guò)程中，探針(5‘標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán))先于上下游引物和模板互補(bǔ)結(jié)合，引物在聚合酶作用下由5'-3'進(jìn)行新生鏈合成，合成過(guò)程中探針被聚合酶5'-3'外切酶活性降解，3'端淬滅基團(tuán)失去對(duì)5'熒光基團(tuán)的淬滅作用，釋放出特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，該信號(hào)被檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR擴(kuò)增的全程監(jiān)控。圖2TaqManMGB探針工作原理MGB探針的5'標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接一個(gè)不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)和一個(gè)特殊的小溝結(jié)合子，這種特殊的設(shè)計(jì)使得MGB探針與模板的結(jié)合特異性更高，探針序列必須與模板序列完全互補(bǔ)匹配才能與之退火結(jié)合，引發(fā)聚合酶介導(dǎo)的探針降解，釋放熒光，檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到信號(hào)；但如果有一個(gè)堿基不匹配，MGB探針就不能和模板互補(bǔ)結(jié)合，不能引發(fā)聚合酶介導(dǎo)的探針降解，不能釋放熒光，檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不到熒光信號(hào)。圖3標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線利用本發(fā)明制備的體外轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行8個(gè)梯度的10倍系列稀釋?zhuān)幢景l(fā)明的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，由ABI7500軟件作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為CT值，曲線斜率為-3.339，線性相關(guān)系數(shù)為0.998。圖4本發(fā)明的技術(shù)路線圖510倍梯度稀釋的CSFVRNART-nPCR(A)和TaciMan-MGBPCR擴(kuò)增(B)將本發(fā)明的體外轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行8個(gè)梯度的10倍系列稀釋?zhuān)瑫r(shí)進(jìn)行RT-nPCR檢測(cè)和熒光定量檢測(cè)，A為RT-nPCR方法的檢測(cè)結(jié)果，B為熒光定量的檢測(cè)結(jié)果，圖5-1中17泳道出現(xiàn)條帶，說(shuō)明該方法可以檢測(cè)到10_7梯度；而圖5-2在10_8梯度曲線還有熒光信號(hào)，說(shuō)明本發(fā)明的熒光定量PCR方法能檢測(cè)到10_8梯度，證實(shí)本發(fā)明的熒光定量PCR方法檢測(cè)靈敏度比RT-nPCR高一個(gè)數(shù)量級(jí)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)根據(jù)GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV(BarbaraΕ,WilliamS.D.,DavidJL，，DISEASEOFSWINE..I.S.U.Press.Vol.8Th.1999=AMES,IOffAU.S.A)全序列進(jìn)行綜合比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在豬瘟病毒基因組5'端非編碼區(qū)的137位存在一個(gè)A/GSNP位點(diǎn)，即豬瘟兔化弱毒疫苗株在該位點(diǎn)位A，而其它豬瘟毒株該位點(diǎn)為G，利用PrimerExpress2.0軟件，針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了野毒株特異的MGB探針，并在兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)了一套通用引物，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶濃度、DNA聚合酶濃度、上下游引物濃度和探針濃度的進(jìn)一步優(yōu)化，建立了CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)方法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法與RT-nPCR符合率為94.3%，且靈敏度比RT-nPCR敏感10倍；特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，17個(gè)CSFV質(zhì)控株檢測(cè)均為陽(yáng)性，HCLV株和12個(gè)非CSFV病原檢出率均為零，說(shuō)明該方法具有很強(qiáng)的CSFV特異性，且能鑒別HCLV和其他豬瘟毒株。從反應(yīng)時(shí)間和試驗(yàn)成本等方面都體現(xiàn)了TaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)CSFV的優(yōu)越性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，可以歸納為1)特異性好=TaqMan-MGBPCR定量技術(shù)通過(guò)MGB探針的單突變特異性對(duì)CSFV核酸的SNP位點(diǎn)行甄別，達(dá)到鑒別檢測(cè)豬瘟野毒的目的，準(zhǔn)確性高，同時(shí)靶序列由特異引物和探針雙重控制，特異性好，假陽(yáng)性低。而對(duì)疫苗毒不予檢測(cè)，從而達(dá)到在野毒檢測(cè)中排除疫苗免疫的干擾；2)靈敏度高反應(yīng)過(guò)程由熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控，熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)具有很靈敏的檢測(cè)能力；3)線性關(guān)系好由于熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與模板擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)熒光信號(hào)的檢測(cè)可以直接對(duì)樣品初始模板濃度進(jìn)行定量；4)操作簡(jiǎn)單自動(dòng)化程度高，TaqMan技術(shù)對(duì)模板的擴(kuò)增和檢測(cè)在閉管的情況下一步完成，不需要開(kāi)蓋，對(duì)環(huán)境污染機(jī)會(huì)少；5)沒(méi)有后處理過(guò)程不用雜交、電泳、拍照等過(guò)程。序列表<110>中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所<120>豬瘟病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-CR鑒別檢測(cè)試劑盒及其生產(chǎn)方法<130><160>6<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明所設(shè)計(jì)和使用的上游引物MGB-F。<400>1CATGCCCACAGTAGGACTAGCAAA24<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明所設(shè)計(jì)和使用的下游引物MGB-R。<400>2GAACTACTGACGACTGTCCTGTACTCA27<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明所設(shè)計(jì)和使用的探針MGB-P。<400>3CTAGCCGTAGTGGCGA16<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明制備陽(yáng)性對(duì)照所設(shè)計(jì)和用于的引物SNP-F。<400>4GACGGCCGAACTGGGCTA18<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明制備陽(yáng)性對(duì)照所設(shè)計(jì)和用于的引物SNP-R。<400>5ATTCAACTCCATGTGCCATGAA22<210>6<211>307<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品目的基因片段序列。<400>6GACGGCCGAACTGGGCTAGCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGT60AGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGAC120GTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTA180ACCCTAGCGGGGGTCGCTAGGGTGAAATCACACCACGTGATGGGAGCACGACCTGATAGG240GCGCTGCAGAGGCCCACTATTAGGCTAGTATAAAAATCTCTGCTGTTCATGGCACATGGA300GTTGAAT30權(quán)利要求一種豬瘟病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR鑒別檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒是由試劑、對(duì)照品、水和PCR反應(yīng)管所組成1)陽(yáng)性對(duì)照采用豬瘟石門(mén)標(biāo)準(zhǔn)毒株特異克隆其非編碼區(qū)約300bp的片段體外逆轉(zhuǎn)錄獲得，濃度為0.126～0.368μg/10μL；2)陰性對(duì)照采用無(wú)特異性病原豬扁桃體或頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)，按1∶5倍體積加入磷酸鹽緩沖液，于研缽或組織勻漿器中充分研磨，然后3000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中備用；3)Trizol裂解液40mL/瓶，分裝至棕色瓶中，4℃存放備用；4)TaqMan-MGBPCR反應(yīng)液每個(gè)反應(yīng)包括10×PCR緩沖液5μL、2.5μMdNTP混合物1.6μL、10μMMGB-F3μL、10μMMGB-R3μL，共12.6μL，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)630μL，分裝成2管；MGB-F和MGB-R為本發(fā)明人設(shè)計(jì)、由專(zhuān)業(yè)公司合成的引物MGB-FCATGCCCACAGTAGGACTAGCAAAMGB-RGAACTACTGACGACTGTCCTGTACTCA；5)反應(yīng)酶每個(gè)反應(yīng)包括SSIIITM反轉(zhuǎn)錄酶0.3μL、TaqHSDNA聚合酶0.5μL，共0.8μL，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)45μL，分裝成1管；6)探針溶液按本發(fā)明所設(shè)計(jì)并由專(zhuān)業(yè)公司合成的探針MGB-P5’-FAM-CTAGCCGTAGTGGCGA-MGB-3’，由5’-FAM和-MGB-3’修飾，合成的探針用0.1％焦磷酸二乙酯水稀釋成5μM，每個(gè)反應(yīng)需1.6μL，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)90μL，分裝成1管，-20℃凍存?zhèn)溆谩?.如權(quán)利要求1所述一種豬瘟病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR鑒別檢測(cè)試劑盒，其特征在于陽(yáng)性對(duì)照制備過(guò)程中使用的引物為SNP-F:GACGGCCGAACTGGGCTA；SNP-R:ATTCAACTCCATGTGCCATGAA。全文摘要本發(fā)明設(shè)計(jì)一種豬瘟病毒TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR鑒別檢測(cè)試劑盒及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明針對(duì)該豬瘟病毒基因組5′端非編碼區(qū)的137位存在一個(gè)A/GSNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)了野毒株特異的MGB探針，并在兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)了一套通用引物，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶濃度、DNA聚合酶濃度、上下游引物濃度和探針濃度的進(jìn)一步優(yōu)化，建立了CSFVTaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)方法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法與RT-nPCR符合率為94.3％，且靈敏度比RT-nPCR敏感10倍；特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，17個(gè)CSFV質(zhì)控株檢測(cè)均為陽(yáng)性，HCLV株和12個(gè)非CSFV病原檢出率均為零，說(shuō)明該方法具有很強(qiáng)的CSFV特異性。該方法僅能檢測(cè)豬瘟病毒野毒株，而不能檢測(cè)疫苗株和其它非豬瘟病毒株。從反應(yīng)時(shí)間和試驗(yàn)成本等方面都體現(xiàn)了TaqMan-MGBPCR鑒別檢測(cè)CSFV的優(yōu)越性。文檔編號(hào)G01N21/64GK101812539SQ200910242080公開(kāi)日2010年8月25日申請(qǐng)日期2009年12月3日優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日發(fā)明者劉俊,徐璐,王棟,王琴,范學(xué)政,趙啟祖,鄒興啟申請(qǐng)人:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所