專利名稱：魯米諾直接鍵合的納米金在免疫分析中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魯米諾直接鍵合的納米金的應(yīng)用，特別涉及其在免疫分析中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化學(xué)發(fā)光是化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的光發(fā)射現(xiàn)象。作為一種光學(xué)檢測(cè)手段，它不 需要光源，具有靈敏度高、線性范圍寬、背景噪聲小、儀器簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛 用于免疫分析中(Wu，A. H. B. Clin. Chim. Acta 2006,369,119 ；Zhan, W. ；Bard, A. J. Anal. Chem. 2007, 79,459 ；Yin, Χ. B. ；Qi, B. ；Sun ；Χ. P. ；Yang ；X. R. ；Wang ；Ε. K. Anal. Chem. 2004, 77, 3525 ；Jie, G. F. ；Huang, H. P. ；Sun, Χ. 1. ；Zhu, J. J. Biosens. Bioelectron. 2008, 23, 1896 ；Egashira, N. ；Morita, S. ；Hifumi, Ε. ；Mitoma, Y. ；Uda, Τ.Anal. Chem. 2008,80, 4020)，目前已經(jīng)成為許多大醫(yī)院的主要臨床分析手段之一。各種化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的 性能很大程度上取決于所采用的探針?，F(xiàn)有商業(yè)化的化學(xué)發(fā)光分析探針主要包括以下兩 類(a)化學(xué)發(fā)光分子如異魯米諾及其衍生物、吖啶酯和聯(lián)吡啶釕等。采用發(fā)光分子作為 探針，不僅需要縮合反應(yīng)將發(fā)光分子與生物分子結(jié)合，還需要對(duì)縮合反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行純 化，操作過(guò)程十分復(fù)雜、耗時(shí)。(b)酶如過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等。利用酶分子對(duì)特定化 學(xué)發(fā)光反應(yīng)的催化作用，建立了一系列酶促化學(xué)發(fā)光生物分析方法。這類方法的主要問(wèn)題 是酶分子容易失活，影響分析的穩(wěn)定性。此外，上述以發(fā)光分子和酶作為探針的分析技術(shù)還 存在下列一些缺陷，比如分析成本高，難以進(jìn)行低含量組分的檢測(cè)，難以進(jìn)行快速、現(xiàn)場(chǎng)的 分析。近年來(lái)，由于納米材料獨(dú)特的生物相容性、表面特性和化學(xué)發(fā)光特性，人們開(kāi)始嘗 試將納米材料作為探針應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析中。納米金由于其良好的穩(wěn)定性和生物兼 容性已被用作化學(xué)發(fā)光免疫分析的探針。2005年，Lu研究小組和Li研究小組各自建立了 納米金標(biāo)記的“溶出”化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其原理均是在免疫反應(yīng)后將納米金氧化溶解 為三價(jià)金離子Au(III)，然后利用Au(III)對(duì)魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的催化或氧化作用進(jìn)行 檢測(cè)(Fan，A.P. ； Lau, C. W. ；Lu, J. Z. Anal. Chem. 2005, 77, 3238 ；Li, Ζ. F. ；Wang, Y. C. ；Liu, C. H. ；Li, Y. K. Anal. Chim. Acta 2005，551，85)。這種方法的主要缺陷在于溶解氧化納米金 需要十分苛刻的實(shí)驗(yàn)條件(如高濃度的HNO3-HCl,或者有毒的HBr-Br2)，導(dǎo)致較高的背景 化學(xué)發(fā)光。之后，兩個(gè)研究小組相繼報(bào)道了以納米金直接作為催化型探針的免疫分析方法 (Wang, Ζ. P. ；Hu, J. Q. Jin, Y. ；Yao, X. ；Li, J. H. Clin. Chem. 2006, 52,1958 ；Duan, C. F.； Yu, Y. Q. ；Cui，H. Analyst 2008，133，1250)，利用納米金對(duì)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的催化作用直接進(jìn) 行發(fā)光檢測(cè)，避免了“溶出”過(guò)程。Li研究小組利用不規(guī)則納米金對(duì)魯米諾-過(guò)氧化氫體系 化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)作用進(jìn)行直接測(cè)定。雖然這種方法避免了苛刻的溶出過(guò)程，但是，這種不規(guī) 則納米金的合成難以控制，需要長(zhǎng)時(shí)間恒溫反應(yīng)(40°C，24h)和除氧操作，同時(shí)合成的納米 金單分散性差，影響批次之間的重現(xiàn)性，限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用。Duan等人研究發(fā)現(xiàn)，粒 徑為8 68nm的普通球狀納米金能夠誘導(dǎo)魯米諾-硝酸銀體系在425nm處產(chǎn)生快速的強(qiáng) 光發(fā)射(Duan，C. F. ；Yu, Y. Q. ；Cui, H. Analyst 2008，133，1250)。在此基礎(chǔ)上，將常規(guī)的檸檬酸鹽保護(hù)的納米金粒子作為免疫分析的探針，利用納米金對(duì)魯米諾-硝酸銀化學(xué)發(fā)光反 應(yīng)的催化作用，建立了一種測(cè)定人體IgG的微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法。與已經(jīng)報(bào)道 的基于納米金的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法相比，該方法避免了苛刻的溶出過(guò)程，避免了不規(guī) 則納米金的合成，提高了該化學(xué)發(fā)光免疫分析方法在臨床診斷中的可用性。但是上述基于 納米金的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其檢測(cè)限為0. 5-100ng/mL IgG，分析靈敏度有待提高。并 且發(fā)光試劑仍需免疫反應(yīng)后單獨(dú)引入，因此在免疫分析的應(yīng)用中具有一定的局限性。因此， 開(kāi)發(fā)能夠克服上述缺陷的新型免疫分析探針和化學(xué)發(fā)光免疫分析新技術(shù)是十分必要的。魯米諾(luminol)，又名發(fā)光氨?；瘜W(xué)名稱為3_氨基鄰苯二甲酰胼，化學(xué)式為 C8H7N3O2。常溫下是一種黃色晶體或者米黃色粉末，是一種比較穩(wěn)定的人工合成的有機(jī)化合 物。它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于合成、水溶性好，是目前應(yīng)用最廣泛的化學(xué)發(fā)光試劑之一。魯米諾分子 本身并不適合直接作為免疫分析的探針，因?yàn)槔闷浞枷惆坊鶊F(tuán)標(biāo)記抗原或抗體分子后， 空間位阻增大，發(fā)光效率降低。但魯米諾常作為發(fā)光底物，應(yīng)用于酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光酶免疫 分析中。最近，文獻(xiàn)報(bào)道可將魯米諾通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到納米金的表面形成魯米諾鍵合 的納米金(Cui，H. ；Wang，W. ；Duan, C. F. ；Dong, Y. P. ；Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007，13， 6975 ；Roux, S. ；Garcia, B. ；Bridot, J. L. ；Salom, Marquette, C. Langmuir. 2005,21, 2526)，并發(fā)現(xiàn)這些魯米諾鍵合的納米金具有電致化學(xué)發(fā)光活性，但其在生物分析中的應(yīng)用 尚T^ff 胃。2005 ￥， Roux ^A (Roux, S. ；Garcia, B. ；Bridot, J. L. ；Salom, Marquette, C. Langmuir. 2005，21，2526)用二氫硫辛酸作為保護(hù)試劑，硼氫化鈉(NaBH4)還原氯金酸 (HAuCl4. 3H20)合成了二氫硫辛酸保護(hù)的納米金。利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳 化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化納米金表面的二氫硫辛酸的羧基，然后通 過(guò)魯米諾的-NH2和二氫硫辛酸的-COOH進(jìn)行縮合反應(yīng)將魯米諾嫁接到納米金的表面。這 個(gè)過(guò)程需要多步反應(yīng)、沉淀洗滌、減壓蒸餾、過(guò)濾、分散等多個(gè)步驟才能完成，非常麻煩、耗 時(shí)。研究結(jié)果表明通過(guò)二氫硫辛酸鍵合到納米金表面的魯米諾仍具有較好電致化學(xué)發(fā)光活 性。但是其是否能連接到生物分子上如蛋白質(zhì)和DNA分子，以及連接生物分子后其復(fù)合物 的化學(xué)發(fā)光與電致化學(xué)發(fā)光活性尚未進(jìn)行研究。用該方法所得到的魯米諾鍵合的納米金， 其表面大部分被二氫硫辛酸分子和魯米諾分子所覆蓋，我們推測(cè)通過(guò)納米金表面和魯米諾 分子直接連接蛋白質(zhì)和DNA分子將是困難的。而通過(guò)二氫硫辛酸連接蛋白質(zhì)和DNA分子 的量將是非常有限的。因?yàn)榇蟛糠侄淞蛐了峄钚晕稽c(diǎn)已被魯米諾和納米金占據(jù)，而且連 接后很難保證魯米諾仍有高的發(fā)光活性。2007年，本課題組直接利用魯米諾還原氯金酸一 步合成得到了魯米諾直接鍵合的納米金(Cui, H. ；Wang，W. ；Duan, C. F. ；Dong, Y. P. ；Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007，13，6975)，表征的結(jié)果顯示魯米諾以弱的Au-N鍵直接連接到納米 金的表面。通過(guò)半胱氨酸橋聯(lián)分子的靜電相互作用，將該魯米諾直接鍵合的納米金組裝到 金電極的表面，發(fā)現(xiàn)該修飾電極在堿性溶液中具有電致化學(xué)發(fā)光活性且強(qiáng)度隨H2O2濃度的 增加而增強(qiáng)，就此發(fā)展了一個(gè)H2O2電致化學(xué)發(fā)光傳感器。但是測(cè)定H2O2的靈敏度較低，其檢 測(cè)限僅為lX10_7mol/L H202。此外該分析方法的穩(wěn)定性也不理想，難以用于實(shí)際樣品的測(cè) 定。在上述工作中，魯米諾直接鍵合的納米金在生物分析如免疫分析中的應(yīng)用沒(méi)有進(jìn)行研 允。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用魯米諾直接還原氯金酸一步合成的魯米諾直接鍵合的 納米金可有效地與蛋白質(zhì)分子連接，且其復(fù)合物具有良好的發(fā)光活性和穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ) 上本發(fā)明提供魯米諾直接鍵合的納米金的以下三個(gè)新用途。第一個(gè)新用途是提供一種魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針。所述免疫分析探針具體可為魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的抗體(如多克隆抗 體或單克隆抗體)或抗原或蛋白質(zhì)。所述魯米諾直接鍵合的納米金是利用魯米諾還原氯金酸一步合成法得到的。進(jìn)一步地，所述免疫分析探針為化學(xué)發(fā)光免疫分析探針，特別是電致化學(xué)發(fā)光免 疫分析探針。第二個(gè)新用途是提供一種基于上述任一種魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探 針的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，可包括如下步驟A、合成上述的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針；B、孵育捕獲探針與固相載體，使捕獲探針連接到固相載體上，形成捕獲探針/固 相載體復(fù)合物；C、孵育步驟B所得到的捕獲探針/固相載體復(fù)合物與目標(biāo)分析物，使捕獲探針/ 固相載體復(fù)合物與目標(biāo)分析物結(jié)合，形成目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體復(fù)合物；D、孵育步驟C所得到的目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體復(fù)合物與步驟A所得到 的免疫分析探針，形成如圖1所示的免疫分析探針/目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體夾 心式免疫復(fù)合物；E、將步驟D得到的所述免疫分析探針/目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體夾心式 免疫復(fù)合物放入化學(xué)發(fā)光池中，加入底液，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。上述化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中，所述的捕獲探針可為抗體或連接有橋連分子的抗 體；所述橋連分子可為生物素。上述化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中的所述固相載體可為磁微珠、微孔板、尼龍、玻璃和 電極之一。上述磁微珠可為常規(guī)磁微珠或納米金修飾的磁微珠。其中，所述常規(guī)磁微珠可為 聚苯乙烯包裹的四氧化三鐵的磁性納米顆粒。上述微孔板可為常規(guī)微孔板或納米金修飾的 微孔板。其中，所述常規(guī)微孔板可為聚苯乙烯微孔板。上述尼龍可為常規(guī)尼龍或納米金修 飾的尼龍。其中，所述常規(guī)尼龍可為聚酰胺類的尼龍。上述玻璃可為常規(guī)玻璃或納米金修 飾的玻璃。其中，所述常規(guī)玻璃可為醛基化玻璃、氨基化玻璃或巰基化的玻璃。所述納米金 修飾的玻璃中的玻璃可為鍍有金或銀的玻璃。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述化學(xué)發(fā)光免疫分析方法為電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。此 時(shí)，所述固相載體為電極。進(jìn)一步地，所述電極可為納米金修飾的電極。所述納米金修飾的電極可為納米金 修飾的金電極、納米金修飾的鉬電極、納米金修飾的玻碳電極、納米金修飾的石墨電極、納 米金修飾的石墨充蠟電極和納米金修飾的氧化銦錫電極之一。所述納米金修飾的金電極選用的橋連分子可為雙巰基化合物和同時(shí)具有氨基和 巰基的化合物之一；所述的雙巰基化合物可為1，3'-丙二硫醇。
所述固相載體上的所述納米金可連接有鏈霉親和素。所述納米金的粒徑為 10-38nm，優(yōu)選為 16nm。上述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法為電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法時(shí)，其中，步驟E中 所述化學(xué)發(fā)光池為電致化學(xué)發(fā)光池，在加入底液和施加電壓的條件下，可以使得所述夾心 式免疫復(fù)合物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。所述底液可為含有過(guò)氧化氫的碳酸鹽緩沖液。所述施加的工作電壓可為脈沖電壓、循環(huán)伏安或線性伏安。其中，所述脈沖電壓可 為雙階脈沖電壓。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，上述電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中所述固相載體也可以為連接磁 微珠的電極。上述化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中，所述目標(biāo)分析物可為抗體、抗原或蛋白質(zhì)。所述目 標(biāo)分析物的樣品可為臨床樣品、藥物、水樣品、生物樣品、空氣樣品、食品樣品或飲料樣品之
ο第三個(gè)新用途是提供實(shí)施上述化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的試劑盒，所述試劑盒包 括a、上述任一種魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針；b、捕獲探針；C、固相載體；d、底液；e、洗液。所述魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針為魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的 抗體。所述分析探針中的納米金粒徑可為14-25皿，優(yōu)選為25nm。所述捕獲探針可為生物素標(biāo)記的抗體。所述固相載體可為納米金修飾的金電極。所述納米金修飾的金電極是通過(guò)1， 3'-丙二硫醇將納米金組裝在金電極表面。所述納米金可為連接有鏈霉親和素的納米金。 所述納米金的粒徑可為10-38nm，優(yōu)選為16nm。所述底液包括能與魯米諾發(fā)生反應(yīng)的任何試劑緩沖溶液和任何能增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光 的物質(zhì)。所述底液具體可為含有過(guò)氧化氫的碳酸鹽緩沖液，其中碳酸鹽是由碳酸鈉和碳酸 氫鈉所組成。所述過(guò)氧化氫濃度為lmmol/L。所述碳酸鈉和碳酸氫鈉濃度均為0. 02mol/L。所述洗液為磷酸鹽緩沖液，其組成為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉和氯化鉀。 所述磷酸鹽緩沖液濃度為0. 02mol/L，其中磷酸二氫鉀濃度為0. 2g/L、磷酸氫二鈉濃度為 2. 9g/L、氯化納濃度為0. 8g/L、氯化鉀濃度為0. 2g/L。本發(fā)明的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針、分析方法和試劑盒可用于各種 樣品中的多種分析物的測(cè)定，適用于臨床分析、藥物分析、食品安全檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。 所述的分析物包括但不限于微生物(如病毒、細(xì)菌、真菌)、蛋白質(zhì)、抗體、抗原、生物毒素、 化學(xué)毒素等。所述的樣品包括但不限于臨床樣品、藥物、水樣品、生物樣品、空氣樣品、食品 樣品和飲料樣品等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)(1)首次將魯米諾直接鍵合的納米金用作免疫分析的探針，提出了新一代免疫分析標(biāo)記技術(shù)。(2)利用魯米諾還原氯金酸一步合成就能得到魯米諾直接鍵合的納米金，將其作 為發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記抗體制備分析探針的方法簡(jiǎn)單、快捷、操作簡(jiǎn)便、成本低廉，克服了現(xiàn)有 以發(fā)光試劑為標(biāo)記物的標(biāo)記技術(shù)麻煩、費(fèi)時(shí)、成本高的重要缺陷。(3)由于納米金具有良好的生物兼容性，利用納米金標(biāo)記抗體，最大程度上保持了 抗體的活性。(4)魯米諾分子本身并不適合直接作為免疫分析的探針，因?yàn)槔闷浞枷惆坊鶊F(tuán) 標(biāo)記抗原或抗體分子后，空間位阻增大，發(fā)光效率降低。本發(fā)明顯示當(dāng)魯米諾鍵合到納米金 表面可以直接標(biāo)記抗原或抗體構(gòu)建免疫分析探針，且其具有較高和穩(wěn)定的發(fā)光效率。由于 魯米諾比常用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑4-氨基丁基乙基異魯米諾(ABEI)、吖啶酯和聯(lián)吡啶釕 等便宜許多，且標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、易行，因此本發(fā)明的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針 具有重要的商業(yè)價(jià)值。(5)基于魯米諾直接鍵合的納米金分析探針?biāo)l(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，通 過(guò)雙層納米金的放大作用使得目標(biāo)分析物的檢測(cè)限低，方法的靈敏度高。實(shí)驗(yàn)證明，測(cè)定人 體IgG的檢測(cè)限可達(dá)到1. Opg/mL。其檢測(cè)限比現(xiàn)行以納米金和以發(fā)光試劑為標(biāo)記物、采用 雙抗夾心模式的化學(xué)發(fā)光免疫分析低約1-5個(gè)數(shù)量級(jí)，且方法簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、成本低廉。


圖1為本發(fā)明所提供的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法涉及的連接在固相載體上的捕獲 探針與目標(biāo)分析物和分析探針形成的夾心式免疫復(fù)合物示意圖；圖2為本發(fā)明所提供的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法涉及的修飾電極制備過(guò)程示 意圖；圖3為裸金電極、1，3'-丙二硫醇修飾的金電極、鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙 二硫醇修飾的金電極和魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗/抗原/一抗/生物素/鏈霉 親和素/納米金Λ，3'-丙二硫醇修飾的金電極的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)對(duì)比。圖中標(biāo)號(hào)含義如下a.裸金電極；b. 1,3'-丙二硫醇修飾的金電極；c.鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極；d.實(shí)施例2制備的魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗/抗原/ 一抗/生物素/ 鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極。圖4為實(shí)施例3中的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測(cè)定人體IgG濃度的工作曲線， 圖4中的插圖表示不同人體IgG的濃度對(duì)應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式下面分別闡述魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針和含有魯米諾直接鍵合的 納米金免疫分析探針的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法、相應(yīng)試劑盒及其應(yīng)用。1. 一種魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針。所述免疫分析探針是將魯米諾直 接鍵合的納米金標(biāo)記抗體或抗原，如標(biāo)記多克隆抗體或單克隆抗體或其它蛋白質(zhì)。所述的魯米諾直接鍵合的納米金是用魯米諾還原氯金酸一步合成得到的。所述免疫分析探針為化 學(xué)發(fā)光免疫分析探針，如電致化學(xué)發(fā)光免疫分析探針。本發(fā)明的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針的制備方法包括以下步驟(1)將IOOmL 0.01% (w/w)的HAuCl4溶液加熱至沸，在冷凝回流并充分?jǐn)嚢璧臈l 件下，加入1. 5-2. OmL含有0. Olmol/L魯米諾和0. Olmol/L氫氧化鈉的溶液，保持沸騰并繼 續(xù)攪拌回流反應(yīng)30min，然后除去加熱源繼續(xù)攪拌15min以上，得到顆粒直徑為14-25nm的 納米金溶液；(2)將合成的納米金溶液在常溫下滲析2天，每8小時(shí)換一次超純水滲析液，即得 到魯米諾直接鍵合的納米金；(3)將0. 5mL的1. Omg/mL抗體加到用0. lmol/L的氫氧化鈉將pH調(diào)至8. 0的上述 步驟(2)中滲析過(guò)的金膠溶液中去，在室溫培育30分鐘后，再把5% (w/w)的牛血清白蛋白 加到溶液中不斷攪拌5分鐘，使其最終濃度為1%，最后在17120*g下離心45分鐘，以除去 未反應(yīng)試劑和納米金表面弱結(jié)合的魯米諾分子，然后將沉淀用含有(w/w)牛血清白蛋 白的0. lmol/L pH = 7. 4磷酸鹽緩沖液溶解，即得到魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探 針。2.本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法包括如下步驟A、合成所述的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針；B、孵育捕獲探針與固相載體，使捕獲探針連接到固相載體上，形成捕獲探針/固 相載體復(fù)合物；C、孵育步驟B所得到的捕獲探針/固相載體復(fù)合物與目標(biāo)分析物，使捕獲探針/ 固相載體復(fù)合物與目標(biāo)分析物結(jié)合，形成目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體復(fù)合物；D、孵育步驟C所得到的目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體復(fù)合物與步驟A所得到 的免疫分析探針，形成如圖1所示的免疫分析探針/目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體夾 心式免疫復(fù)合物；E、將步驟D得到的所述免疫分析探針/目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體夾心式 免疫復(fù)合物放入化學(xué)發(fā)光池中，加入底液，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。這里所述的捕獲探針為抗體或連接有橋連分子的抗體，所述抗體可通過(guò)任何現(xiàn)有 方法連接到固相載體上。這些固相載體包括但不限于電極材料、磁微珠、微孔板、尼龍、玻璃 等。這些現(xiàn)有方法包括但不限于下面例舉的文獻(xiàn)報(bào)道Yin，X. B. ；Qi, B. ；Sun ；X. P. ；Yang ； X. R. ；Wang ；E. K. Anal. Chem. 2004, 77, 3525 ；Wang, Ζ. P. ；Hu, J. Q. Jin, Y. ；Yao, X. ；Li, J. H. Clin. Chem. 2006, 52,1958 ;Jie, G. F. ；Liu, B. ；Pan, H. C. ；Zhu, J. J. ；Chen, G. N. Anal. Chem. 2007, 79, 5574 ；Zhan, W. ；Bard, A. J. Anal. Chem. 2007, 79,459 ；Yang, Z. J. ；Xie,Z. Y.； Liu, H. ；Yan, F. ;Ju, H. X. Adv. Funct. Mater. 2008,18, 3991 ；Miao, W. J. ；Bard, A. J. Anal. Chem. 2003，75，5825。所述固相載體本發(fā)明優(yōu)選為納米金修飾的固相載體。所述捕獲探針通過(guò)任 何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與納米金的方法連接到固相載體上。這些現(xiàn)有方法包括但不限 于下面例舉的文獻(xiàn)報(bào)道:Yin, X. B. ；Qi, B. ；Sun ；X. P. ；Yang ；X. R. ；Wang ；E. K. Anal. Chem. 2004,77,3525 ；Wang, Ζ. P. ；Hu, J. Q. Jin, Y. ；Yao, X. ；Li, J. H. Clin. Chem. 2006, 52,1958 ；Gonzalez—Garcia, Μ. B. ；Fernandez—Sanchez, C. ；Costa—Garcia, A.Biosens.Bioelectron. 2000,15,315o本發(fā)明優(yōu)選為鏈霉親和素和生物素。鏈霉親和素與納米金結(jié) 合、生物素與抗體結(jié)合，通過(guò)鏈霉親和素與生物素的特異性相互作用將抗體嫁接在納米金 修飾的固相載體上。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述化學(xué)發(fā)光免疫分析方法為電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。此 時(shí)，所述固相載體為電極。本發(fā)明優(yōu)選為納米金修飾的電極，所述納米金修飾的電極可為 納米金修飾的金電極、納米金修飾的鉬電極、納米金修飾的玻碳電極、納米金修飾的石墨電 極、納米金修飾的石墨充蠟電極和納米金修飾的氧化銦錫電極之一。本發(fā)明優(yōu)選為納米金 修飾的金電極，納米金修飾金電極可選用的橋連分子包括但不限于雙巰基化合物、同時(shí)具 有氨基和巰基的化合物等。這里所述的納米金修飾的金電極，其中納米金為連接鏈霉親和素的納米金?？梢?從任何商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)或用文獻(xiàn)方法合成。所述納米金為檸檬酸鹽保護(hù)的納米金，其粒徑為 10-38nm，本發(fā)明優(yōu)選為16nm。本發(fā)明所述的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，包括以下步驟a、合成上述任一種魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針；b、在潔凈的純金電極上組裝連接有鏈霉親和素的納米金，得到鏈霉親和素/納米 金修飾的金電極；C、孵育含有生物素的捕獲探針與步驟b得到鏈霉親和素/納米金修飾的金電極， 使捕獲探針連接到納米金修飾的電極上，得到捕獲探針/生物素/鏈霉親和素/納米金修 飾的金電極；d、孵育含有目標(biāo)分析物的樣品與步驟c所得到的捕獲探針/生物素/鏈霉親和素 /納米金修飾的金電極，使目標(biāo)分析物連接到捕獲探針上，得到目標(biāo)分析物/捕獲探針/生 物素/鏈霉親和素/納米金修飾的金電極；e、孵育步驟a所得到的免疫分析探針與步驟d所得到的目標(biāo)分析物/捕獲探針/ 生物素/鏈霉親和素/納米金修飾的金電極，使免疫分析探針連接到目標(biāo)分析物上，得到如 圖2所示的免疫分析探針/目標(biāo)分析物/捕獲探針/生物素/鏈霉親和素/納米金修飾的 金電極；f、將步驟e所得到的免疫分析探針/目標(biāo)分析物/捕獲探針/生物素/鏈霉親和 素/納米金修飾的金電極放入電致化學(xué)發(fā)光池中，加入底液，施加電壓，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用 發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。所述步驟b是通過(guò)雙巰基化合物將連接有鏈霉親和素的納米金修飾在金電極的 表面。所述的雙巰基化合物優(yōu)選為1，3'-丙二硫醇。所述步驟f中的底液可為含有過(guò)氧化氫的碳酸鹽緩沖液。所述步驟f中所施加的工作電壓可為脈沖電壓、循環(huán)伏安或線性伏安。本發(fā)明優(yōu) 選為脈沖電壓，所述脈沖電壓可為雙階脈沖電壓。下面以連接鏈霉親和素的納米金修飾的金電極為固相載體、連接有生物素的抗體 為捕獲探針、以電化學(xué)方法誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光為例，具體說(shuō)明本發(fā)明的可用于多種分析物測(cè)定 的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。(1)制備魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針；a-Ι.將IOOmL 0. 01% (w/w)的撤11(14溶液加熱至沸，在冷凝回流并充分?jǐn)嚢璧臈l件下，加入1. 5-2. OmL含有0. Olmol/L魯米諾和0. Olmol/L氫氧化鈉的溶液，保持沸騰并繼 續(xù)攪拌回流反應(yīng)30min，然后除去加熱源繼續(xù)攪拌15min以上，得到顆粒直徑為14-25nm的 納米金溶液；b-Ι.將合成的納米金溶液在常溫下滲析2天，每8小時(shí)換一次超純水滲析液，得到 魯米諾直接鍵合的納米金；C-1.將0. 5mL的1. Omg/mL抗體(二抗)加到用0. lmol/L的氫氧化鈉將pH調(diào)至 8.0的上述步驟b-Ι中滲析過(guò)的金膠溶液中去，在室溫培育30分鐘后，再把5% (w/w)的牛 血清白蛋白加到溶液中不斷攪拌5分鐘，使其最終濃度為1 %，最后在17120*g下離心45分 鐘，然后將沉淀用含有(w/w)牛血清白蛋白的0. lmol/L pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液溶 解。即得到魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針；(2)納米金修飾電極的制備a-2.將打磨好的裸金電極放入2mmol/L的1，3'-丙二硫醇中，在常溫下浸泡20 小時(shí)，取出后用乙醇和超純水清洗，獲得1，3'-丙二硫醇修飾的金電極；b-2.將連接鏈霉親和素的納米金滴在步驟a_2制得的1，3'-丙二硫醇修飾電極 上，在4°C暗處中放4小時(shí)，取出后用超純水清洗，得到鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙二 硫醇修飾的金電極；(3)夾心復(fù)合物在納米金修飾電極上的固載a-3.將生物素標(biāo)記的一抗滴加到步驟(2)得到的鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙 二硫醇修飾的金電極，在37°C下作用60分鐘后，用0. 02mol/L pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液 清洗，得到一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金Λ，3'-丙二硫醇修飾的金電極；然后將 1% (w/w)的牛血清白蛋白滴在一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修 飾的金電極，在37°C下作用40分鐘，再用0. 02mol/L pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液清洗；b-3.將抗原作為目標(biāo)分析物滴加到步驟a_3得到的一抗/生物素/鏈霉親和素/ 納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極上面，在37°C下作用60分鐘，再用0.02mol/L pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液清洗，得到抗原/ 一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金/1，3 ‘-丙 二硫醇修飾的金電極；c-3.將步驟(1)得到的魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗即分析探針滴加在 步驟b-3得到的抗原/ 一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金 電極上，用0. 02mol/L pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液清洗，在37°C下作用60分鐘后，獲得魯 米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗和待測(cè)抗原進(jìn)行特異性結(jié)合的修飾電極，即如圖2所示 的魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗/抗原/ 一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金/1， 3'-丙二硫醇修飾的金電極；(4)電致化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定將(3)制備的魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗/抗原/ 一抗/生物素/鏈霉 親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極放入電致化學(xué)發(fā)光池中，加入含有l(wèi)mmol/ L過(guò)氧化氫的0. 02mol/L pH = 9. 95的碳酸鹽底液，施加脈沖電壓為0. 8V、脈沖周期為30s、 脈沖時(shí)間為0. Is、起始電壓為OV的雙階脈沖電壓，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。所述步驟(3)a-3中所述生物素標(biāo)記的一抗具體可為生物素標(biāo)記的羊抗人IgG。所述步驟(3) b-3中，所述抗原具體可為人IgG.
所述步驟(3) c-3中所述魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗具體可為魯米諾直 接鍵合的納米金標(biāo)記的羊抗人IgG。3.本發(fā)明還涉及2所述化學(xué)發(fā)光免疫分析方法對(duì)應(yīng)的試劑盒。所述試劑盒包括A'、上述任一種魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針；B'、捕獲探針；C'、固相載體；D'、底液；E'、洗液。所述魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針可為魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記 的抗體。所述免疫分析探針中的納米金粒徑可為14-25nm，優(yōu)選為25nm。所述捕獲探針可為生物素標(biāo)記的抗體。所述固相載體可為納米金修飾的金電極。所述納米金修飾的金電極是通過(guò)1， 3'-丙二硫醇將納米金組裝在金電極表面。所述納米金可為連接有鏈霉親和素的納米金。 所述納米金的粒徑可為10-38nm，優(yōu)選為16nm。所述底液包括能與魯米諾發(fā)生反應(yīng)的任何試劑緩沖溶液和任何能增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光 的物質(zhì)。所述底液具體可為含有過(guò)氧化氫的碳酸鹽緩沖液，其中碳酸鹽是由碳酸鈉和碳酸 氫鈉所組成。所述過(guò)氧化氫濃度為lmmol/L。所述碳酸鈉和碳酸氫鈉濃度均為0. 02mol/L。所述洗液為磷酸鹽緩沖液，其組成為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉和氯化鉀。 所述磷酸鹽緩沖液濃度為0. 02mol/L，其中磷酸二氫鉀濃度為0. 2g/L、磷酸氫二鈉濃度為 2. 9g/L、氯化納濃度為0. 8g/L、氯化鉀濃度為0. 2g/L。本發(fā)明的分析方法和試劑盒可用于各種樣品中的多種分析物的測(cè)定，適用于臨床 分析、藥物分析、食品安全檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。所述的分析物包括但不限于微生物(如病毒、細(xì)菌、真菌)、蛋白質(zhì)、抗體、抗原、生
物毒素、化學(xué)毒素等。所述的樣品包括但不限于臨床樣品、藥物、水樣品、生物樣品、空氣樣品、食品樣品 和飲料樣品等。下面實(shí)施例1 4以連接鏈霉親和素的納米金修飾的金電極為固相載體、連接有 生物素的抗體為捕獲探針、電致化學(xué)發(fā)光為檢測(cè)手段測(cè)定人IgG為例，闡明本發(fā)明的魯米 諾直接鍵合的納米金免疫分析探針和化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的檢測(cè)效果。實(shí)施例1.本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫探針的制備(1)將IOOmL 0. 01% (w/w)的HAuCl4溶液加熱至沸，在冷凝回流并充分?jǐn)嚢璧臈l 件下，快速加入1. 5ml含有0. Olmol/L魯米諾和0. Olmol/L氫氧化鈉的溶液，保持沸騰并繼 續(xù)攪拌回流反應(yīng)30min，然后除去加熱源繼續(xù)攪拌15min以上，得到粒徑為25nm的納米金溶 液，冷卻到室溫，避光保存在4°C下；(2)將步驟(1)合成的納米金溶液在常溫下滲析2天，每8小時(shí)換一次超純水滲析 液，通過(guò)滲析操作可以充分去除游離的魯米諾及其氧化產(chǎn)物，這樣在納米金中的魯米諾分 子只以和納米金表面鍵合的形式存在，即得到魯米諾直接鍵合的納米金；(3)將0. 5mL的1. 0mg/mL 二抗(羊抗人IgG)加到用0. lmol/L的氫氧化鈉將pH 調(diào)至8.0的上述步驟(2)中滲析過(guò)的金膠溶液中去，在室溫培育30分鐘后，再把5% (w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不斷攪拌5分鐘，使其最終濃度為(w/w) 0最后在17120*g 下離心45分鐘，以除去未反應(yīng)試劑和納米金表面弱結(jié)合的魯米諾分子，然后將沉淀用含有 1% (w/w)的牛血清白蛋白的0. 111101/14)!1=7.4磷酸鹽緩沖液溶解，即得到魯米諾直接鍵 合的納米金免疫分析探針(魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的抗體)。實(shí)施例2.夾心式免疫復(fù)合物在納米金修飾電極上的固載如圖2所示，本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法涉及的夾心式免疫復(fù)合物在納米金 修飾電極上的固載包括以下步驟(1)納米金修飾電極的制備A.將打磨好的裸金電極放入2mmol/L的1，3'-丙二硫醇中，在常溫下浸泡20小 時(shí)，取出后用乙醇和超純水清洗，獲得1，3'-丙二硫醇修飾的金電極；B.將60yL連接鏈霉親和素的納米金滴在步驟A制得的1，3'-丙二硫醇修飾電 極上，在4°C暗處中放入4小時(shí)，取出后用超純水清洗，得到鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙 二硫醇修飾的金電極；(2)雙抗夾心復(fù)合物在納米金修飾電極上的固載a.將生物素標(biāo)記的一抗(羊抗人IgG)滴加到步驟(1)得到的鏈霉親和素/納米 金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極，在37°C下作用60分鐘后，用0.02mol/L pH = 7. 4的 磷酸鹽緩沖溶液清洗，得到一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金Λ，3'-丙二硫醇修飾的 金電極；然后將60 μ 11% (w/w)的牛血清白蛋白滴在一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金 /1,3'-丙二硫醇修飾的金電極，在37°C下作用40分鐘，再用0.02mol/L pH = 7. 4的磷酸 鹽緩沖溶液清洗。b.將 60μ 1 濃度分別為 7. 5、10、20、30、40、50、70、90、100pg/ml 的抗原(人 IgG) 滴加到步驟a得到的一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電 極上面，在37°C下作用60分鐘，再用0. 02mol/L pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液清洗，得到不 同濃度的人IgG和一抗進(jìn)行特異性結(jié)合的修飾電極，即抗原/ 一抗/生物素/鏈霉親和素 /納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極；c.將60 μ 1實(shí)施例1制備的魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗，即分析探針，滴 加在步驟b得到的抗原/ 一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金/1，3 ‘-丙二硫醇修飾的金 電極上，用0. 02mol/L pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液清洗，在37°C下作用60分鐘后，獲得魯 米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的抗體和待測(cè)抗原(人IgG)進(jìn)行特異性結(jié)合的修飾電極，即如 圖2所示的魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗/抗原/一抗/生物素/鏈霉親和素/納 米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極。實(shí)施例3.電致化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定將實(shí)施例2得到的夾心式免疫復(fù)合物連接的納米金修飾電極，即魯米諾直接鍵合 的納米金標(biāo)記的二抗/抗原/ 一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金Λ，3'-丙二硫醇修 飾的金電極，放入電致化學(xué)發(fā)光池中，加入含有l(wèi)mmol/L過(guò)氧化氫的0. 02mol/L pH = 9. 95 的碳酸鹽底液，施加脈沖電壓為0. 8V、脈沖周期為30s、脈沖時(shí)間為0. Is、起始電壓為OV的 雙階脈沖電壓，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。圖3是分別在裸金電極、1，3'-丙二硫醇修飾的金電極、鏈 霉親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極、魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的二抗 /抗原/ 一抗/生物素/鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的金電極上施加雙階
14脈沖電壓得到的化學(xué)發(fā)光隨時(shí)間變化的曲線，其中待測(cè)抗原濃度為100pg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明只有含有魯米諾直接鍵合的納米金分析探針的修飾電極才會(huì)產(chǎn)生電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)，而 裸金電極、1，3'-丙二硫醇修飾的金電極、鏈霉親和素/納米金/1，3'-丙二硫醇修飾的 金電極無(wú)信號(hào)產(chǎn)生。圖4為本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測(cè)定人IgG的工作曲線，結(jié)果表明測(cè) 定人IgG的線性范圍是7. 5-100pg/mL，檢測(cè)限為1. Opg/mL。分別對(duì)濃度為30pg/mL，50pg/ mL和70pg/mL的人IgG進(jìn)行9次平行測(cè)定，得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4. 38%, 2. 13%和 2. 60%。實(shí)施例4.電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測(cè)定實(shí)際人血清樣品中的IgG將本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法用于實(shí)際人血清樣品中的IgG的測(cè)定，結(jié) 果如表1所示。其回收率在106% -118. 6%之間，表明該分析方法可用于人血清樣品的測(cè) 定。表2比較了本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法與臨床所用的濁度法對(duì)人血清樣品中IgG 的測(cè)定結(jié)果，其相對(duì)偏差小于11.2%，顯示了本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的測(cè)定 結(jié)果是可靠的。
表1本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測(cè)定實(shí)際人血清樣品中IgG的回收率
回收率=(總IgG濃度-樣品中IgG濃度)/加入IgG濃度χ 100 %. 起始點(diǎn)壓，O V;脈沖周期,30 s;脈沖時(shí)間，0.1 s; 脈沖電壓,0.8 V; 電解液組成H2O2, 1.0 mM； CBS, 0.02 mM (pH 9.95)。表2本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法與臨床方法對(duì)實(shí)際人血清樣品中的 _IgG測(cè)定結(jié)果的比較_
起始點(diǎn)壓,0V;脈沖周期,30 s;脈沖時(shí)間，0.1 s; 脈沖電壓，0.8 V; 底液組成H2O2, 1.0 mM; CBS5 0.02 mM (pH 9.95);臨床方法為濁度法。實(shí)施例5.以磁微珠為固相載體的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法也可以用磁微珠為固相載體，常規(guī)的磁微珠主要 為聚苯乙烯包裹的四氧化三鐵的磁納米顆粒。捕獲探針可以通過(guò)任何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與 磁微珠的方法結(jié)合到磁微珠上。這些現(xiàn)有方法包括但不限于下面例舉的文獻(xiàn)報(bào)道Zhan， W. ；Bard, A. J. Anal. Chem. 2007，79，459 ；Miao, W. J. ；Bard, A. J. Anal. Chem. 2004，76，7109 ； Yang, S. Y. ；Lien, K. Y. ；Huang, K. J. Biosens. Bioelectron. 2008,24,855 ；Selvaraju, T.； Das, J. ；Han, S. W. Biosens. Bioelectron. 2008, 23,932 ；Zhang, R. Q. ；Hirakama, K. ；Seto, D. Talanta. 2005，68，231。例如，蛋白質(zhì)可以直接和磁微珠結(jié)合，也可以通過(guò)鏈霉親和素和 生物素結(jié)合到磁微珠上。因此捕獲探針可以直接或通過(guò)鏈霉親和素和生物素結(jié)合到磁微珠 上，結(jié)合有捕獲探針的磁微珠再進(jìn)一步與目標(biāo)分析物和分析探針結(jié)合形成夾心式免疫復(fù)合 物，用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。也可以用納米金修飾的磁微珠為固相載體。首先可在磁微珠表面修飾氨基 (ffeizmann, Y. ；Patolsky, F. ；Katz, E. ；Willner，I. J. Am. Chem. Soc. 2003，125，3452)，通過(guò) 氨基可以和納米金形成弱的共價(jià)鍵方式，將納米金結(jié)合到磁微珠表面。納米金與捕獲探針 可通過(guò)任何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與納米金的方法進(jìn)行連接(Yin，X.B. ；Qi,B. ；Sun ；X. P. ；Yang ； X. R. ；Wang ；E.K.Anal. Chem. 2004, 77, 3525 ；Gonzalez-Garcia, Μ. B. ；Fernandez-Sanchez, C. ；Costa-Garcia, A. Biosens. Bioelectron. 2000，15，315)，如鏈霉親和素和生物素，然后 進(jìn)一步與目標(biāo)分析物和分析探針結(jié)合形成夾心式免疫復(fù)合物，用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例6.以微孔板為固相載體的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法也可用微孔板為固相載體，常規(guī)的微孔板主 要為聚苯乙烯材料。捕獲探針可以通過(guò)任何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與微孔板的方法結(jié)合到微孔板上。這些現(xiàn)有方法包括但不限于下面例舉的文獻(xiàn)報(bào)道Duan，C. F. ；Yu, Y. Q. ；Cui, H. Analyst. 2008, 133, 1250 ；Piermarini, S. ；Micheli, L. ；Ammida, N. H. S. Biosens. Bioelectron. 2007, 22,1434 ；Kiening, M. ；Niessner, E. R. ；ffeller, M. G. Analyst. 2005, 130,1580 ；R, M. ；Cervino,C. ；Sauceda,J. C. ；Niessner,R. ；Knopp,D.Anal. Chem. 2009,81, 2373。例如，蛋白質(zhì)可以直接和微孔板結(jié)合，也可以通過(guò)鏈霉親和素和生物素結(jié)合到微孔板 上。因此捕獲探針可以直接或通過(guò)鏈霉親和素和生物素結(jié)合到微孔板上，連接有捕獲探針 的微孔板再進(jìn)一步與目標(biāo)分析物和分析探針結(jié)合形成夾心式免疫復(fù)合物，用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行 檢測(cè)。也可以用納米金修飾的微孔板為固相載體。在微孔板表面先吸附一層蛋白質(zhì)如 牛血清白蛋白(BSA)，通過(guò)納米金可以和蛋白質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)，將納米金結(jié)合到微孔板上。 納米金與捕獲探針可通過(guò)任何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與納米金的方法進(jìn)行連接(Yin，X. B. ；Qi, B. ；Sun ；X. P. ；Yang ；X. R. ；Wang ；E. K. Anal. Chem. 2004，77，3525 ；Gonzalez-Garcia，Μ. B.； Fernandez-Sanchez, C. ；Costa-Garcia，A. Biosens. Bioelectron. 2000，15，315)，如鏈霉親 和素和生物素，然后進(jìn)一步與目標(biāo)分析物和分析探針結(jié)合形成夾心式免疫復(fù)合物，用化學(xué) 發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例7.以尼龍為固相載體的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法也可以用尼龍為固相載體，常規(guī)的尼龍主要為聚 酰胺類的尼龍。捕獲探針可以通過(guò)任何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與尼龍的方法結(jié)合到尼龍上。這 些現(xiàn)有方法包括但不限于下面例舉的文獻(xiàn)報(bào)道Rubtsova，Μ. Y. ；Kovba, G. V. ；Egorov, Α. Μ. Biosens. Bioelectron. 1998,13,715 ；Zhang, F. H. ；Yang, S. H. ；Kang, Τ. Y. ；Cha, G. S.； Nam, H. ；Meyehoff, Μ.Ε. Biosens. Bioelectron. 2007,22, 1419 ；Shah, J. ；Chemburu, S.； ffilkins, Ε. ；Abdel-Hamin，I. Electroanalysis. 2003，15，1809。例如，蛋白質(zhì)可以直接和 尼龍結(jié)合，也可以通過(guò)鏈霉親和素和生物素結(jié)合到尼龍上。因此捕獲探針可以直接或通過(guò) 鏈霉親和素和生物素結(jié)合到尼龍上，結(jié)合有捕獲探針的尼龍?jiān)龠M(jìn)一步與目標(biāo)分析物和分析 探針結(jié)合形成夾心式免疫復(fù)合物，用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。也可以用納米金修飾的尼龍為固相載體。首先使尼龍氨基功能化(Nan，C. F.； Zhang，Y. ；Zhang，G. Μ. ；Dong，C. ；Shuang, S. Μ. ；Choi，Μ. M-F. Enz. Microb. Technol. 2009， 44，249)，通過(guò)氨基可以和納米金形成弱的共價(jià)鍵方式，將納米金結(jié)合到尼龍表面。納米 金與捕獲探針可通過(guò)任何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與納米金的方法進(jìn)行連接(Yin，X. B. ；Qi, B.； Sun ；X. P. ；Yang ；X. R. ；Wang ；E. K. Anal. Chem. 2004，77，3525 ；Gonzalez-Garcia, M. B.； Fernandez-Sanchez, C. ；Costa-Garcia, A. Biosens. Bioelectron. 2000，15，315)，如鏈霉親 和素和生物素，然后進(jìn)一步與目標(biāo)分析物和分析探針結(jié)合形成夾心式免疫復(fù)合物，用化學(xué) 發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例8.以玻璃為固相載體的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法也可以用玻璃為固相載體，常規(guī)的玻璃主要為表 面醛基化、氨基化和巰基化的玻璃。捕獲探針可以通過(guò)任何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與玻璃的方法 結(jié)合到玻璃上。這些現(xiàn)有方法包括但不限于下面例舉的文獻(xiàn)報(bào)道Yang，Z.J. ；Xie, Ζ. Y.； Liu, H. ；Yan, F. ;Ju, H. X. Adv. Funct-Mater0例如，蛋白質(zhì)可以通過(guò)鏈霉親和素和生物素 結(jié)合到聚合物修飾的玻璃上。因此捕獲探針可以直接或通過(guò)鏈霉親和素和生物素結(jié)合到玻
17璃上，結(jié)合有捕獲探針的玻璃再進(jìn)一步與目標(biāo)分析物和分析探針結(jié)合形成夾心式免疫復(fù)合 物，用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。也可以用納米金修飾的玻璃為固相載體。首先可在鍍有金膜的玻璃表面修飾 一層雙巰基化合物(Wang, Ζ. P. ；Hu, J. Q. Jin, Y. ；Yao, X. ；Li, J. H. Clin. Chem. 2006, 52，1958 ；)，通過(guò)巰基可以和納米金形成共價(jià)鍵方式，將納米金結(jié)合到玻璃表面。納米金 與捕獲探針可通過(guò)任何現(xiàn)有連接蛋白質(zhì)與納米金的方法進(jìn)行連接(Yin，X. B. ；Qi, B.； Sun ；X. P. ；Yang ；X. R. ；Wang ；E. K. Anal. Chem. 2004，77，3525 ；Gonzalez-Garcia，Μ. B.； Fernandez-Sanchez, C. ；Costa-Garcia，A. Biosens. Bioelectron. 2000，15，315)，如鏈霉親 和素和生物素，然后進(jìn)一步與目標(biāo)分析物和分析探針結(jié)合形成夾心式免疫復(fù)合物，用化學(xué) 發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明專利并不局限于上述的具體實(shí)施方式
，此種原理可用于多種分析物的測(cè) 定。任何以魯米諾直接鍵合的納米金作為發(fā)光標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍，比如改變目標(biāo)分析物的連接方式、更換納米金粒徑和形狀、改變電極材料、 更換分析物、更換抗體、將固相載體變換為磁珠或微孔板等均屬于對(duì)本專利實(shí)質(zhì)相同的變 通或替換。
權(quán)利要求
一種魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針，其特征在于，所述 免疫分析探針為魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的抗體或抗原或蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針，其特征在于，所 述魯米諾直接鍵合的納米金是利用魯米諾還原氯金酸一步合成法得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針，其 特征在于，所述免疫分析探針為化學(xué)發(fā)光免疫分析探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針，其特征在于，所述 化學(xué)發(fā)光免疫分析探針為電致化學(xué)發(fā)光免疫分析探針。
6.一種化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，包括如下步驟A、合成如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針；B、孵育捕獲探針與固相載體，使捕獲探針連接到固相載體上，形成捕獲探針/固相載 體復(fù)合物；C、孵育步驟B所得到的捕獲探針/固相載體復(fù)合物與目標(biāo)分析物，使捕獲探針/固相 載體復(fù)合物與目標(biāo)分析物結(jié)合，形成目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體復(fù)合物；D、孵育步驟C所得到的目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體復(fù)合物與步驟A所得到的免 疫分析探針，形成免疫分析探針/目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體夾心式免疫復(fù)合物；E、將步驟D得到的所述免疫分析探針/目標(biāo)分析物/捕獲探針/固相載體夾心式免疫 復(fù)合物放入化學(xué)發(fā)光池中，加入底液，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求6所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述的化學(xué)發(fā)光免疫分 析方法為電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述的捕獲探針為 抗體或連接有橋連分子的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述橋連分子為生物ο
10.如權(quán)利要求6或7所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述固相載體為電 極、磁微珠、微孔板、尼龍或玻璃之一。
11.如權(quán)利要求10所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述電極為納米金修 飾的電極。<
12.如權(quán)利要求11所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述納米金修飾的電 極為納米金修飾的金電極、納米金修飾的鉬電極、納米金修飾的玻碳電極、納米金修飾的石 墨電極、納米金修飾的石墨充蠟電極或納米金修飾的氧化銦錫電極之一。
13.如權(quán)利要求12所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述納米金修飾的金 電極選用的橋連分子為雙巰基化合物和同時(shí)具有氨基和巰基的化合物之一；所述雙巰基化 合物優(yōu)選為1，3'-丙二硫醇。
14.如權(quán)利要求11至13中任意一項(xiàng)所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述 納米金連接有鏈霉親和素。
15.如權(quán)利要求11至13中任意一項(xiàng)所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述 納米金的粒徑為10-38nm ；優(yōu)選為16nm。
16.根據(jù)權(quán)利要求6或7中所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其中，步驟E中所述化學(xué)發(fā) 光池為電致化學(xué)發(fā)光池，在加入底液和施加電壓的條件下，可以使得所述夾心式免疫復(fù)合 物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述步驟E中的底液 為含有過(guò)氧化氫的碳酸鹽緩沖液。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述步驟E中所述施 加電壓為脈沖電壓、循環(huán)伏安或線性伏安。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其中所述脈沖電壓為雙階脈沖電壓。
20.如權(quán)利要求6或7所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，所述目標(biāo)分析物為 抗體、抗原或蛋白質(zhì)；所述目標(biāo)分析物的樣品來(lái)自臨床樣品、藥物、水樣品、生物樣品、空氣 樣品、食品樣品和飲料樣品之一。
21.一種實(shí)施權(quán)利要求6-20所述的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的試劑盒，包括a、權(quán)利要求1-5任一所述的免疫分析探針；b、捕獲探針； C、固相載體；d、底液；e、洗液。
22.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述免疫分析探針為魯米諾直接鍵合 的納米金標(biāo)記的抗體。
23.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其特征在于，所述納米金粒徑為14-25nm;優(yōu)選為 25nm。
24.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述捕獲探針為生物素標(biāo)記的抗體。
25.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為納米金修飾的金電極。
26.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其特征在于，所述納米金修飾的金電極是通過(guò)1， 3'-丙二硫醇將納米金組裝在金電極表面。
27.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其征在于，所述納米金為連接有鏈霉親和素的納米^^ ο
28.如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其特征在于，所述納米金的粒徑為10-38nm;優(yōu)選為 16nm。
29.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述底液為含有過(guò)氧化氫的碳酸鹽緩 沖液；其中碳酸鹽是由碳酸鈉和碳酸氫鈉所組成。
30.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其特征在于，所述過(guò)氧化氫濃度為lmmol/L。
31.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其特征在于，所述碳酸鈉和碳酸氫鈉濃度均為 0.02mol/L。
32.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述洗液為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽 緩沖液的組成為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉和氯化鉀。
33.如權(quán)利要求32所述的試劑盒，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液濃度為0.02mol/L, 其中磷酸二氫鉀濃度為0. 2g/L、磷酸氫二鈉濃度為2. 9g/L、氯化鈉濃度為0. 8g/L、氯化鉀濃度為0. 2g/L。
34.魯米諾直接鍵合的納米金在制備免疫分析探針中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了魯米諾直接鍵合的納米金在免疫分析中的應(yīng)用。其一是魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針，該分析探針由魯米諾直接鍵合的納米金標(biāo)記的抗體所組成。其中，魯米諾直接鍵合的納米金是由魯米諾一步還原氯金酸得到的。其二是基于該魯米諾直接鍵合的納米金免疫分析探針的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。其三是實(shí)施該分析方法的試劑盒。本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法具有靈敏度高(如測(cè)定人IgG的檢測(cè)限可達(dá)1.0pg/mL)、線性范圍寬、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可用于各種樣品中的多種分析物的測(cè)定。在臨床診斷與治療、藥物分析、食品安全檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/552GK101900723SQ20091008565
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者崔華, 田大勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)