專利名稱：單細(xì)胞連續(xù)流毛細(xì)管電泳雙波長檢測細(xì)胞活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為單細(xì)胞連續(xù)流毛細(xì)管電泳雙波長檢測細(xì)胞活性的方法，屬于 細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞活性檢測和細(xì)胞濃度測定在細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞毒理學(xué)，藥物篩選 及研制等領(lǐng)域是應(yīng)用非常廣泛的重要的技術(shù)和手段，具有重要的應(yīng)用價值。
常規(guī)細(xì)胞活性檢測主要有染色法和MTT法。染色法是根據(jù)染料進(jìn)入細(xì) 胞內(nèi)的量來表征細(xì)胞膜通透性進(jìn)而反應(yīng)細(xì)胞的活性強(qiáng)弱。染色法通常是采 用臺盼藍(lán)或PI等染料對細(xì)胞染色后通過顯微鏡肉眼觀察和人工統(tǒng)計一定體 積細(xì)胞溶液中細(xì)胞的數(shù)目和細(xì)胞染色程度從而給出細(xì)胞活性的定性和半定 量結(jié)論，這種肉眼觀察染色深淺所致的人為誤差很大，且不能提供每個細(xì) 胞的染色程度的量值。而且人工統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目的方法也存在較大的人為誤 差。MTT法是根據(jù)活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可將MTT (四甲基偶氮唑鹽) 試劑由黃色還原為紫色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中的原理，通過比色法檢測群體 細(xì)胞產(chǎn)生紫色結(jié)晶的量來反映細(xì)胞溶液中所有細(xì)胞的平均活性。特別強(qiáng)調(diào) 的是，MTT法僅能檢測整個細(xì)胞群體的平均活性，而無法判斷個體細(xì)胞的 活性。
細(xì)胞計數(shù)是細(xì)胞生物學(xué)，微生物學(xué)，.分子生物學(xué)以及毒理學(xué)等研究領(lǐng) 域極其重要的和必不可少的細(xì)胞'7量"的統(tǒng)計和表征方法。常規(guī)的細(xì)胞計 數(shù)方法是使用細(xì)胞計數(shù)器和顯微鏡。其基本方法是制備細(xì)胞懸液，滴在 計數(shù)板(特制厚玻片，其上有計數(shù)池，池底有直線條將計數(shù)池分成許多小 方格)上，蓋上蓋玻片，然后:在顯微鏡下用肉眼直接計數(shù)若千小方格(已 知體積)內(nèi)的一種或多種細(xì)胞，這樣就可估算單位體積細(xì)胞懸液內(nèi)這些細(xì) 胞的數(shù)量或數(shù)量比。為了估算準(zhǔn)確，需計數(shù)不少于100個細(xì)胞為止。計算計 數(shù)板四大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，在對格內(nèi)細(xì)胞壓線進(jìn)行統(tǒng)計處理，如壓線細(xì)胞 只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算細(xì)胞數(shù)/ml二 (4x大格細(xì)胞總數(shù)/4)xl0000。這種計數(shù)方法需要繁瑣的計數(shù)前準(zhǔn)備工作和小心翼翼的手工計
數(shù)，人為誤差很大，工作效率低。目前的商品化的自動細(xì)胞計數(shù)器主要是 用于血液分析的血細(xì)胞計數(shù)裝置，其原理是將細(xì)胞溶液懸浮于含電解質(zhì)的 溶液中。在電壓作用下，懸浮細(xì)胞顆粒在電場中會隨機(jī)通過溶液池內(nèi)特定 小孔，并引起小孔檢測處的電阻或光散射變化。通過測量小孔處的電阻或 光散射變化，進(jìn)行溶液池內(nèi)的細(xì)胞計數(shù)。該方法不適合細(xì)胞濃度較低時的 計數(shù)，且商用儀器價格較貴。
現(xiàn)代的細(xì)胞定量分析檢測手段有70年代出現(xiàn)的流式細(xì)胞儀。它集 電子、計算機(jī)、激光、流體技術(shù)為一體，是當(dāng)今功能最強(qiáng)，最先進(jìn)的細(xì) 胞定量分析儀。全球約有6家儀器生產(chǎn)廠商。流式細(xì)胞儀可高速分析上 萬個細(xì)胞，并具有強(qiáng)大的分析功能，可同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)， 目前已有約20 30種應(yīng)用功能的報道，其中也包括細(xì)胞活性和細(xì)胞計 數(shù)的檢測。但是由于流式細(xì)胞儀價格昂貴，實驗成本高，操作技術(shù)要求高。 其儀器購買和使用非一般從事生物學(xué)研究的科研和醫(yī)療單位所能夠負(fù)擔(dān)。 因此，針對細(xì)胞的常規(guī)檢測指標(biāo)一細(xì)胞活性分析、細(xì)胞計數(shù)和濃度計算， 需要提供一種簡單、廉價、準(zhǔn)確和實用的分析方法。
毛細(xì)管電泳是現(xiàn)代微量分析技術(shù)。其具有高效，快速，儀器成本和實 驗費用低等明顯優(yōu)勢，本發(fā)明建立了細(xì)胞活性檢測和細(xì)胞濃度計算的毛細(xì) 管電泳分析方法。所建立的雙波長細(xì)胞活性分析方法使其在細(xì)胞活性準(zhǔn)確 判斷方面優(yōu)于常規(guī)染色法，通過對細(xì)胞逐個進(jìn)行活性檢測則優(yōu)于MTT法的 群體細(xì)胞活性分析。毛細(xì)管電泳細(xì)胞濃度測定使細(xì)胞計數(shù)準(zhǔn)備，可量值化， 并減少了人為誤差。所建立的毛細(xì)管電泳細(xì)胞活性檢測和細(xì)胞濃度計算方 法在儀器成本，實驗成本和操作技術(shù)要求方面更優(yōu)于流式細(xì)胞儀。此外， 由于細(xì)胞的活性變化，常規(guī)細(xì)胞分析受制于細(xì)胞保存時間和分析時間限制， 而本發(fā)明中細(xì)胞樣品經(jīng)固定化處理后，性質(zhì)穩(wěn)定，不受樣品保存時間和分 析時間的影響，因此大大方便了細(xì)胞活性分析，為大批量樣品分析提供了 可靠的方法。
近年來已有報道將毛細(xì)管電泳應(yīng)用于細(xì)胞凋亡狀態(tài)的檢測。例如1) 直接對完整細(xì)胞進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳。由于正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞具有不同的荷質(zhì)比，因而在電泳過程中能相互分離，出現(xiàn)兩個細(xì)胞峰就能判斷細(xì)胞
凋亡現(xiàn)象，通過兩個峰的面積比可以判斷細(xì)胞的凋亡程度；2)通過提取細(xì) 胞內(nèi)的DNA后，再采用毛細(xì)管電泳對DNA片段進(jìn)行電泳分析，借此判斷細(xì) 胞是否發(fā)生凋亡；3)通過檢測細(xì)胞內(nèi)的caspase-3蛋白的活性來表示細(xì)胞凋 亡的程度。以上方法l是以微量細(xì)胞溶液作為樣品，根據(jù)不同狀態(tài)細(xì)胞出 峰位置不同，進(jìn)行細(xì)胞凋亡與否的鑒定。方法2和3則都是根據(jù)不同細(xì)胞狀 態(tài)時，細(xì)胞內(nèi)的大分子如核酸或特定蛋白質(zhì)的性質(zhì)變化進(jìn)行細(xì)胞凋亡與否 的鑒定。
目前，將毛細(xì)管電泳用于細(xì)胞的活性定量檢測和細(xì)胞濃度計算均尚未 見報道。本發(fā)明利用毛細(xì)管電泳技術(shù)，結(jié)合細(xì)胞臺盼藍(lán)染色方法，以單細(xì) 胞連續(xù)進(jìn)樣的方式，使溶液中細(xì)胞在電滲流驅(qū)動下通過毛細(xì)管并在紫外/可 見雙波長下逐個檢測細(xì)胞的吸光值，通過雙波長比值實現(xiàn)正常細(xì)胞，死亡 細(xì)胞和藥物處理后細(xì)胞的活性定量分析，建立了細(xì)胞死亡率的計算方法。 本發(fā)明利用毛細(xì)管電泳技術(shù)，以單細(xì)胞連續(xù)進(jìn)樣的方式，使溶液中細(xì)胞在 電滲流驅(qū)動下通過毛細(xì)管并在紫外波長下逐個檢測細(xì)胞，檢測到的細(xì)胞 峰數(shù)表示細(xì)胞數(shù)，建立了細(xì)胞濃度的定量計算方法，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種單細(xì)胞連續(xù)流毛細(xì)管電泳雙波長檢測 細(xì)胞活性的方法，解決常規(guī)測量細(xì)胞活性的方法中存在人為誤差、以及不 能進(jìn)行單細(xì)胞定量檢測和細(xì)胞活性定量分析以及流式細(xì)胞儀成本高等問 題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
1)將待測細(xì)胞染色，禽心，移去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清 洗細(xì)胞。重復(fù)離心，清洗細(xì)胞3次以上，將細(xì)胞外的殘留的染料洗去。在 清洗后的細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞固定液，進(jìn)行細(xì)胞固定化，固定時間1小時 以上；細(xì)胞固定化后，再用PBS清洗細(xì)胞兩次以上，除去剩余的固定液， 得到固定化的細(xì)胞。通過對固定化后的細(xì)胞進(jìn)行超聲處理5秒 10秒，可破 壞細(xì)胞聚集現(xiàn)象。其中染色劑為細(xì)胞活性檢測用的染色劑；細(xì)胞固定液可為質(zhì)量百分 比在10%以上的甲醛溶液或質(zhì)量百分比在4%以上的多聚甲醛溶液；細(xì)胞沉 淀體積與固定液的體積比為1: 10~1: 20。
2)將固定化的細(xì)胞用20~100mM電解質(zhì)緩沖液配置為103 104個/ml 濃度范圍的細(xì)胞溶液，置于配備了二極管陣列檢測器的毛細(xì)管電泳儀正極 端進(jìn)行電泳；同時在紫外和可見雙波長下分別檢測每個細(xì)胞的光吸收值。 因不同狀態(tài)細(xì)胞均在紫外光下存在吸收，而經(jīng)過臺盼藍(lán)染色后的細(xì)胞還在 可見光下存在較強(qiáng)吸收，故以紫外/可見雙波長吸收值比值表示該細(xì)胞的活 性。
其中緩沖液為硼砂，磷酸鹽，醋酸銨中的任意一種；毛細(xì)管電泳儀 采用的毛細(xì)管長度為30~60cm，內(nèi)徑10 100um;電泳電壓為10 20kV，檢 測時采用的紫外光波長范圍為200 300nrn，可見光波長范圍為570 590nm， 每次檢測的細(xì)胞數(shù)范圍100 200個。
有益效果
1) 將細(xì)胞染色后人工判斷活性的傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)方法與現(xiàn)代微量分析 技術(shù)毛細(xì)管電泳結(jié)合，使傳統(tǒng)的細(xì)胞活性人工觀察判斷獲得量值標(biāo)準(zhǔn)，實 現(xiàn)了細(xì)胞活性的定量分析。
2) 通過測定每個細(xì)胞活性的信息，可獲得群體細(xì)胞的活性信息。克服 了 MTT法測定群體細(xì)胞活性信息時，不考慮個體細(xì)胞活性信息的不足。
3) 建立了細(xì)胞計數(shù)即細(xì)胞濃度測定的毛細(xì)管電泳方法。
4) 針對細(xì)胞常規(guī)檢測^H斤，毛細(xì)管電泳儀與流式細(xì)胞儀相比，在儀器 成本，實驗成本，操作技術(shù)要求和實驗過程簡單等方面具有極其顯著的優(yōu) 勢。
5) 細(xì)胞樣品因固定化處理后，樣品性質(zhì)穩(wěn)定，不受樣品保存時間和分 析時間的影響，因此大大方便了細(xì)胞活牲分析，并有利于大批細(xì)胞樣品的 活性檢測。由于細(xì)胞的臺盼藍(lán)染色和其它染色法能適用于各類細(xì)胞，因此 細(xì)胞活性分析方法具有很好的通用性。細(xì)胞計數(shù)方法也對于各種細(xì)胞分析 具有通用性。


圖1為毛細(xì)管電泳用于細(xì)胞活性檢測示意圖，其中1-電極處的電泳緩 沖液，2-正負(fù)電極，3-毛細(xì)管，4-二極管陣列檢測器，5-通過毛細(xì)管的細(xì)胞， EOF為毛細(xì)管電泳中產(chǎn)生的電滲流；
圖2為正常細(xì)胞單細(xì)胞連續(xù)毛細(xì)管電泳214nm和570nm雙波長檢測的 結(jié)果；
具體實施方式
實施例l
培養(yǎng)8瓶Hela細(xì)胞作為樣品(約106個/瓶Hela細(xì)胞)。 一瓶用作正常 細(xì)胞、 一瓶用于56i:處理15分鐘處理的，得到死亡細(xì)胞、其余6瓶細(xì)胞分 別用藥物濃度為40， 50， 60， 70， 80和90iig/ml的姜黃素進(jìn)行處理，得到 藥物處理的待測細(xì)胞。對正常細(xì)胞，死亡細(xì)胞和藥物處理待測細(xì)胞，分別 用質(zhì)量百分比為0.4%臺盼藍(lán)染色3min后用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，將細(xì)胞 外的殘留的臺盼藍(lán)染料洗去。具體方法是對細(xì)胞溶液經(jīng)過離心機(jī)1000轉(zhuǎn) /min離心，移去上清液，保留細(xì)胞。再加磷酸鹽緩沖液，離心，重復(fù)3次 清洗。在清洗后的細(xì)胞溶液中加入200jil的質(zhì)量百分比為10%甲醛溶液， 進(jìn)行細(xì)胞固定化，固定時間12小時。細(xì)胞固定化后，再離心、用磷酸鹽緩 沖液(PBS)清洗細(xì)胞兩次以上，除去剩余的甲醛。將細(xì)胞以103~104個/1111 的濃度配制在50mM硼砂溶液中，置于正極處電泳。電泳條件是50mM 硼砂為電解質(zhì)溶液，i2kV電壓，毛細(xì)管長30cm。電泳時，細(xì)胞在電滲流 的作用下以單細(xì)胞的狀態(tài)向負(fù)極遷移，并在毛細(xì)管末端經(jīng)過二極管陣列檢 測器。記錄100個細(xì)胞的214nm和570nm波長的吸收值。首先求出正常細(xì) 胞的570nm/214nm吸收值平均值(m。為0.02，其次求出經(jīng)56*€處理15分鐘 處理所得的死亡細(xì)胞樣品(md)的570nm/214nm吸收值平均值為0.21，再對 40， 50， 60， 70， 80和90U g/ml藥物處理的待測細(xì)胞樣品求出570nm/214nm 吸收值平均值(nit)，其值分別為0.029， 0.034， 0.034， Q.072, 0.132， 0.191。
權(quán)利要求
1、一種單細(xì)胞連續(xù)流毛細(xì)管電泳雙波長檢測細(xì)胞活性的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下1)將待測細(xì)胞染色，離心，移去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，重復(fù)離心，清洗細(xì)胞3次以上，將細(xì)胞外的殘留的染料洗去；在清洗后的細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞固定液，進(jìn)行細(xì)胞固定化，固定時間1小時以上；細(xì)胞固定化后，再用PBS清洗細(xì)胞兩次以上，除去剩余的固定液，得到固定化的細(xì)胞；2)將固定化的細(xì)胞用20～100mM電解質(zhì)緩沖液配置為103～104個/ml濃度范圍的細(xì)胞溶液，置于配備了二極管陣列檢測器的毛細(xì)管電泳儀正極端進(jìn)行電泳，同時在紫外和可見雙波長下分別檢測每個細(xì)胞的光吸收值，以紫外/可見雙波長吸收值比值表示該細(xì)胞的活性。
2、 如權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞連續(xù)流毛細(xì)管電泳雙波長檢測細(xì)胞 活性的方法，其特征在于通過對固定化后的細(xì)胞進(jìn)行超聲處理5秒~10 秒，可破壞細(xì)胞聚集現(xiàn)象。
3、 如權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞連續(xù)流毛細(xì)管電泳雙波長檢測細(xì)胞 活性的方法，其特征在于細(xì)胞固定液可為質(zhì)量百分比在10%以上的甲醛 溶液或質(zhì)量百分比在4%以上的多聚甲醛溶液；細(xì)胞沉淀體積與固定液的體 積比為1: 10~1: 20。
4、 如權(quán)利要求1所述的一種單細(xì)胞連續(xù)流毛細(xì)管電泳雙波長檢測細(xì)胞 活性的方法，其特征在于電解質(zhì)緩沖液為硼砂，磷酸鹽，醋酸銨中的任意一種；毛細(xì)管電泳儀采用的毛細(xì)管長度為3C^60cm,內(nèi)徑10~i00um;電 泳電壓為10~20kV，檢測時采用的紫外光波長范圍為200~300nm，可見光 波長范圍為570~590nm，每次檢測的細(xì)胞數(shù)范圍100 200個。全文摘要
本發(fā)明涉及單細(xì)胞連續(xù)流毛細(xì)管電泳雙波長檢測細(xì)胞活性的方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。該方法是將待測細(xì)胞經(jīng)染色后固定，將固定化的細(xì)胞用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行雙波長檢測，在紫外和可見波長分別檢測每個細(xì)胞的光吸收值，以紫外/可見雙波長吸收值比值表示該細(xì)胞的活性。本發(fā)明具有快速、簡便，低成本和定量檢測細(xì)胞活性的優(yōu)點，可用于細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞毒理學(xué)及藥物篩選及研制等相關(guān)的細(xì)胞活性檢測。
文檔編號G01N21/31GK101498645SQ20091007932
公開日2009年8月5日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者任肖敏, 鋒 屈 申請人:北京理工大學(xué)