專利名稱：1bl/1rs易位系的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明1BL/1RS易位系的鑒定方法，屬于細胞生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黑麥(Secale cereale L)是小麥的重要近緣植物之一，具有多花、多粉、廣適等 特點(吳金華，麥類作物學(xué)報，2005，25(1) :115-119)。黑麥1RS片段上攜帶有抗葉銹、稈 銹、條銹和白粉病的抗性基因Lr26、 Sr31、 Yr9、 Pro8，及抗飛虱基因Gb2和大量抗逆基因， 1BL/1RS易位小麥面粉的可溶性纖維含量高于一般小麥，對人體有益(尚海英，西南農(nóng)業(yè) 學(xué)報，2004，17(3) :273-277)。 1RS上還存在增加小穗數(shù)的QTL位點和提高產(chǎn)量性狀、增 加蛋白質(zhì)含量等多種優(yōu)良性狀相關(guān)基因(侯永翠，西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，16(4) :14-19)。 Melz、 Schlegel和Thiele(1992)通過對附加系、端體系和小麥的phl6系分析，發(fā)現(xiàn)1RS、 1RL、2RL、3RS和5RS與對應(yīng)的小麥染色體臂間有部分同源關(guān)系，因而可產(chǎn)生小麥_黑麥的 異附加系、代換系和易位系。由于1RS在遺傳上能夠很好的補償1BS缺失引起的負效應(yīng) (Lukasz-ewski， Genome， 2004， 47 (1) :36)，所以小麥1B/1R易位系可以直接應(yīng)用于小麥育 種(王靜，作物學(xué)報，2006， 32(1) :30-33， 131-117)。 雖然普遍認為1RS上有編碼黑麥堿的Sec — 1位點，而1RS代替了 IBS造成了 IBS 上重要基因位點Glu — 3、 Gli — 1的丟失，造成1BL/1RS易位小麥面粉的烘烤加工品質(zhì)較 差(任燕，麥類作物學(xué)報，2006，26(3) :152-158)。但短時間內(nèi)很難育出新的品種來取代所 有的1BL/1RS易位品種。所以利用不含黑麥堿的改良1BL/1RS新易位來替換中國小麥品種 中普遍存在的1BL/1RS易位，既可保持1BL/1RS易位系的優(yōu)點又能改善其烘烤加工品質(zhì)。
目前對1BL/1RS易位系進行鑒定主要應(yīng)用細胞學(xué)，生化和分子標記等技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
1、1BL/1RS易位系的細胞遺傳學(xué)鑒定方法
(1)有絲分裂和減數(shù)分裂的染色體分析 1RS上的隨體或次縊痕在小麥背景中表現(xiàn)不出來，普通小麥中期I細胞中通常有 四條染色體(1B、6B)短臂上有明顯的隨體，若1RS取代了 1BS，則1BL/1RS易位系的染色 體中就只有兩條染色體帶有隨體，據(jù)此能夠快速判斷1RS的存在，不過只適用于1RS取代 IBS的情況，在取代1AS或IDS時不適用(William, Euphytica， 1998， 108 :1-19) 。 Mettin、 Zeller和Berzonsky等通過對有絲分裂中期細胞中含隨體的染色體進行計數(shù)鑒定出 1BL/1RS易位系。 另外，利用染色體同源性，用待測的材料與普通小麥的1B雙單體或1B/1R易位系 配雜交組合，從F1的中期I的花粉母細胞的構(gòu)型中判斷是否為1BL/1RS易位系(Cuadrado M C， Genome， 1988,30 :793-796)。 Mettin等利用待測材料和整倍體小麥、已知1BL/1RS易 位系雜交，觀察Fl的中期I的花粉母細胞的構(gòu)型鑒定出待測品種1BL/1RS易位系。 [ooog] (2)染色體分帶技術(shù)
染色體分帶技術(shù)是經(jīng)過酸堿處理后染色體上顯示著色深淺不一的帶紋的技術(shù)，具 體的顯帶機理說法各異，目前比較一致的看法是帶區(qū)的染色質(zhì)更能抵抗分帶過程中的各 種處理。染色體分帶技術(shù)主要有C-帶、N-帶，根據(jù)黑麥染色體的端體上含有不同于小麥的 特異帶紋，可鑒定1BL/1RS易位系、1R代換系和1R附加系。Rayburn等用N-帶從普通小麥 群體中鑒定出1BL/1RS易位系。(鐘少斌等，作物學(xué)報，1991，17(5) :321-325)利用C帶和 N帶技術(shù)對普通小麥選系"840-59-4-2"進行分析，確定其為1BL/1RS易位系。但是分帶技 術(shù)一般不能用來鑒定小片段的易位系。
(3)原位雜交 原位雜交是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸序列的 方法。它在操作程序上比分帶技術(shù)要復(fù)雜，但鑒定結(jié)果更精確，能夠鑒定小片段的易位系， Islam等曾預(yù)言在鑒定黑麥小片段上原位雜交將比生化或分帶技術(shù)更有利用價值。原位雜 結(jié)合分帶技術(shù)能夠鑒定1AL/1RS、 1DL/1RS和1BL/1RS，且能夠確定易位點丄即itan和Jiang 用FISH鑒定出Amigo為1BL/1RS整臂易位系。
4、小結(jié) (1)細胞遺傳學(xué)方法的比較 通過1RS和1BS上特異的C-帶、1BS隨體的缺失以及黑麥的基因組原位雜交 (GISH)和熒光原位雜交(FISH)可以鑒定1BL/lRS易位系，除C-分帶法外，其他方法只能區(qū) 分1RS是否完整進入小麥染色體組，但不能可靠地區(qū)分是1BL/1RS還是1AL/1RS或1DL/1RS 易位。 (2)生化技術(shù)的比較 生化標記的檢測相對較為簡便和快速，所需費用也并不太高。幾種方法分別是從 植物的胚乳、面粉和葉片中取樣，均不破壞胚，均可快速簡單地檢測大量樣品，除HPLC外， 均能有效的鑒定1AL/1RS、1BL/1RS和1DL/1RS易位系，凝膠電泳可以區(qū)別不同來源的1RS， 而且，適當結(jié)合同工酶標記、單克隆抗體、凝膠電泳和Elisa能夠鑒定1RS易位系和1R代換 系。 (3)分子標記技術(shù)的比較 SSR標記優(yōu)點在于數(shù)量豐富、帶型簡單、標記呈共顯性；但其前期工作量較大，涉 及到大量DNA序列分析及引物合成，工作量大、費用高。RAPD標記由于重復(fù)性差，還存在共 遷移的問題，使其在應(yīng)用上受到一定的限制。盡管RFLP技術(shù)已在許多領(lǐng)域取得了令人矚目 的研究成果，但RFLP對DNA多態(tài)性檢測的靈敏度不高，RFLP連鎖圖上還有較大的空間區(qū)； 同時，RFLP還存有操作復(fù)雜、成本高、費時等不足。因此，RFLP應(yīng)用和推廣受到一定限制。
不同分子標記各有優(yōu)缺點，應(yīng)針對不同對象和研究目的選擇合適的分子標記。同 時，分子標記的選擇還應(yīng)考慮到DNA用量的多少、標記(探針、引物)獲得的難易、技術(shù)掌握 的程度以及實驗費用等。另外，分子標記必須與其它實驗手段(如細胞學(xué)、生化、原位雜交 等)相結(jié)合，以便在外源種質(zhì)鑒定中發(fā)揮最大的功效。
(4)幾種方法的綜合比較 Javornik等對鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體的N-帶技術(shù)和3種蛋白質(zhì)電 泳方法間進行比較研究，認為蛋白質(zhì)電泳技術(shù)是最為簡便有效的方法，魏育明等(2001)對 生化和分子標記方法，包括蛋白質(zhì)電泳技術(shù)(A-PAGE)、熒光原位雜交(FISH) 、RFLP、RAPD和特異性PCR標記進行比較研究，結(jié)果表明，RAPD標記難以鑒定1BL/1RS易位染色體，其余均 能對1BL/1RS易位染色體進行有效鑒定，F(xiàn)ISH和RFLP方法比較費時費力且花費昂貴，而特 異性PCR標記又在一定程度上受模板DNA濃度的影響。所以，蛋白質(zhì)APAGE方法是一種簡 單、快速、經(jīng)濟有效的方法，最易于在小麥育種選擇中應(yīng)用。 但是，在外源種質(zhì)鑒定中，單憑一種技術(shù)很難作出完全正確的判斷，需要利用多種 技術(shù)相互補充、相互印證。所以目前外源種質(zhì)的鑒定已成為一個多技術(shù)的綜合利用。
權(quán)利要求
1BL/1RS易位系的鑒定方法其特征在于(1)細胞遺傳學(xué)方法的比較通過1RS和1BS上特異的C-帶、1BS隨體的缺失以及黑麥的基因組原位雜交(GISH)和熒光原位雜交(FISH)可以鑒定1BL/1RS易位系，除C-分帶法外，其他方法只能區(qū)分1RS是否完整進入小麥染色體組，但不能可靠地區(qū)分是1BL/1RS還是1AL/1RS或1DL/1RS易位；(2)生化技術(shù)的比較生化標記的檢測相對較為簡便和快速，所需費用也并不太高。幾種方法分別是從植物的胚乳、面粉和葉片中取樣，均不破壞胚，均可快速簡單地檢測大量樣品，除HPLC外，均能有效的鑒定1AL/1RS、1BL/1RS和1DL/1RS易位系，凝膠電泳可以區(qū)別不同來源的1RS，而且，適當結(jié)合同工酶標記、單克隆抗體、凝膠電泳和Elisa能夠鑒定1RS易位系和1R代換系；(3)分子標記技術(shù)的比較SSR標記優(yōu)點在于數(shù)量豐富、帶型簡單、標記呈共顯性；但其前期工作量較大，涉及到大量DNA序列分析及引物合成，工作量大、費用高；RAPD標記由于重復(fù)性差，還存在共遷移的問題，使其在應(yīng)用上受到一定的限制。盡管RFLP技術(shù)已在許多領(lǐng)域取得了令人矚目的研究成果，但RFLP對DNA多態(tài)性檢測的靈敏度不高，RFLP連鎖圖上還有較大的空間區(qū)；同時，RFLP還存有操作復(fù)雜、成本高、費時等不足；因此，RFLP應(yīng)用和推廣受到一定限制；不同分子標記各有優(yōu)缺點，應(yīng)針對不同對象和研究目的選擇合適的分子標記，同時，分子標記的選擇還應(yīng)考慮到DNA用量的多少、標記(探針、引物)獲得的難易、技術(shù)掌握的程度以及實驗費用等，另外，分子標記必須與其它實驗手段(如細胞學(xué)、生化、原位雜交等)相結(jié)合，以便在外源種質(zhì)鑒定中發(fā)揮最大的功效；(4)幾種方法的綜合比較Javornik等對鑒定小麥背景中1BL/1RS易位染色體的N-帶技術(shù)和3種蛋白質(zhì)電泳方法間進行比較研究，認為蛋白質(zhì)電泳技術(shù)是最為簡便有效的方法，魏育明等(2001)對生化和分子標記方法，包括蛋白質(zhì)電泳技術(shù)(A-PAGE)、熒光原位雜交(FISH)、RFLP、RAPD和特異性PCR標記進行比較研究，結(jié)果表明，RAPD標記難以鑒定1BL/1RS易位染色體，其余均能對1BL/1RS易位染色體進行有效鑒定，F(xiàn)ISH和RFLP方法比較費時費力且花費昂貴，而特異性PCR標記又在一定程度上受模板DNA濃度的影響，所以，蛋白質(zhì)APAGE方法是一種簡單、快速、經(jīng)濟有效的方法，最易于在小麥育種選擇中應(yīng)用；但是，在外源種質(zhì)鑒定中，單憑一種技術(shù)很難作出完全正確的判斷，需要利用多種技術(shù)相互補充、相互印證，所以目前外源種質(zhì)的鑒定已成為一個多技術(shù)的綜合利用。
全文摘要
黑麥(Secale cereale L)是小麥的重要近緣植物之一，具有多花、多粉、廣適等特點，黑麥1RS片段上攜帶有抗葉銹、稈銹、條銹和白粉病的抗性基因Lr26、Sr31、Yr9、Pro8，及抗飛虱基因Gb2和大量抗逆基因，1BL/1RS易位小麥面粉的可溶性纖維含量高于一般小麥，對人體有益。1RS上還存在增加小穗數(shù)的QTL位點和提高產(chǎn)量性狀、增加蛋白質(zhì)含量等多種優(yōu)良性狀相關(guān)基因。Melz、Schlegel和Thiele通過對附加系、端體系和小麥的ph16系分析，發(fā)現(xiàn)1RS、1RL、2RL、3RS和5RS與對應(yīng)的小麥染色體臂間有部分同源關(guān)系，因而可產(chǎn)生小麥-黑麥的異附加系、代換系和易位系。由于1RS在遺傳上能夠很好的補償1BS缺失引起的負效應(yīng)，所以小麥1B/1R易位系可以直接應(yīng)用于小麥育種，本研究就是基于此進行的。
文檔編號G01N27/26GK101760534SQ20081023799
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者曹淑蘭 申請人:曹淑蘭