專利名稱：一種采用高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及啤酒技術(shù)領(lǐng)域，確切的說是采用高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛含 量的方法。
背景技術(shù)：
2-糠醛是體現(xiàn)啤酒老化程度的標(biāo)志性物質(zhì)，2-糠醛含量越高，啤酒老化程度越嚴(yán) 重，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)一直是啤酒生產(chǎn)企業(yè)的迫切需要。2-糠醛在新鮮啤酒中的含量 通常小于50ug/L，所以必須將其富集、濃縮甚至衍生化。 水蒸氣蒸餾和液液萃取是最早采用的富集凈化手段。液液萃取的回收率很低，還 要接觸大量有毒有機(jī)溶劑，無法應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè)。而啤酒在水蒸氣蒸餾后，餾出液還需加入 有毒的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行衍生以產(chǎn)生熒光吸收，這同樣不利于方法的普及和應(yīng)用。
近年來，固相萃取技術(shù)逐漸取代了傳統(tǒng)的液液萃取方法。固相萃取(Solid Phase Extraction,簡(jiǎn)稱SPE)是從八十年代中期開始發(fā)展起來的一項(xiàng)待測(cè)啤酒前處理技術(shù)。由液 固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來。主要通過固相填料對(duì)待測(cè)啤酒組分的選擇性吸附 及解吸過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)啤酒的分離，純化和富集。主要目的在于降低待測(cè)啤酒基質(zhì)的干 擾，提高檢測(cè)靈敏度。 最常用的是C18固相萃取小柱，由于其對(duì)于啤酒中2_糠醛的保留很弱，90%的 2_糠醛會(huì)直接流出小柱，僅有10%的2-糠醛被保留，無法滿足富集的作用，也就無法成功 檢測(cè)啤酒中的2-糠醛。 梯度洗脫程序是指流動(dòng)相由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動(dòng)相中各溶劑 組成的比例改變流動(dòng)相的極性，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子k'，并使待測(cè)啤酒 種的所有組分可在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳分離。對(duì)于組分復(fù)雜的待測(cè)啤酒，采用一種色譜體 系，很難得到理想的分離結(jié)果。要么分離時(shí)間太長，要么分離度太差。梯度洗脫作為一種 色譜分離的手段，雖然在液相分析方法也會(huì)經(jīng)常采用，但在檢驗(yàn)啤酒2_糠醛的方法中從未 有人采用過。這是因?yàn)槟軌蚓_控制流動(dòng)相梯度洗脫程序的液相色譜儀是最近10多年才 開始出現(xiàn)并逐漸推廣使用的。以往檢測(cè)2-糠醛的方法受到儀器的局限采用的都是等度洗 脫的方法。液相色譜中采用梯度洗脫的目的在于縮短分析時(shí)間，提高分離效果。啤酒中的 含有成千上萬種化學(xué)成分，組成非常復(fù)雜，組分之間的極性差別很大。為了能夠節(jié)約分析時(shí) 間，提高分離效率并且在每次分析結(jié)束時(shí)有效地清潔色譜柱，使色譜柱始終保持最佳狀態(tài)， 非常有必要進(jìn)行梯度洗脫。啤酒中眾多復(fù)雜干擾成分是其檢測(cè)的難點(diǎn)，必須針對(duì)被測(cè)組分 和干擾組分通過不斷試驗(yàn)，尋找合適的色譜柱，合適的流動(dòng)相組成以及合適的梯度變化程 序，最終用盡可能短的時(shí)間將2-糠醛與其它干擾組分分離、徹底清洗色譜柱并重新回到平 衡狀態(tài)以進(jìn)行下一個(gè)樣品的檢測(cè)。所以，在其他領(lǐng)域由于樣品的基質(zhì)和組成不同，其他的梯 度方法不可能直接拿來使用。在檢驗(yàn)啤酒2-糠醛的方法中梯度洗脫程序中流動(dòng)相的組成， 色譜柱及其柱溫的選擇相當(dāng)關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服啤酒中2-糠醛含量過低且常用富集方法效率較低的缺 點(diǎn)，提供一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)啤酒中2-糠醛的高效液相色譜(HighPerformance Liquid Chromatography,簡(jiǎn)稱HPLC)方法，對(duì)啤酒的新鮮度評(píng)價(jià)很有意義。 本發(fā)明所述的一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)啤酒中2-糠醛的方法，包括(1)標(biāo)樣配置程序， 配置2-糠醛標(biāo)準(zhǔn)溶液；(2)待測(cè)啤酒的前處理程序，采用極性官能化高分子樹脂固相萃取 小柱——PEP-SPE小柱(Polar-EnhancedPolymer，簡(jiǎn)稱PEP，即極性官能化高分子樹脂，SPE 是Solid PhaseExtraction的英文縮寫，即固相萃取)對(duì)2-糠醛進(jìn)行吸附保留；(3)梯度 洗脫程序，以流動(dòng)相洗脫后用色譜柱分析；(4)待測(cè)啤酒和標(biāo)樣譜圖對(duì)比檢測(cè)程序，將待測(cè) 啤酒和標(biāo)樣經(jīng)過上述(2)、 (3)程序后的色譜圖對(duì)比，確定待測(cè)啤酒中2-糠醛含量。
具體地說，(1)標(biāo)樣配制程序中，最好采用99%的2-糠醛，用乙腈稀釋，得到2_糠 醛儲(chǔ)備液的濃度為990mg/L，在0-5t:避光儲(chǔ)存，穩(wěn)定期為3個(gè)月。之后再用乙腈稀釋，使 2-糠醛標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度在l-2mg/L之間，在0-5t:避光儲(chǔ)存，穩(wěn)定期為7天。
(2)待測(cè)啤酒前處理程序，PEP-SPE固相萃取小柱是以極性官能化高分子樹脂為 主體的新型反向固相萃取材料，以乙烯吡咯烷酮和二乙烯苯共聚得到的高分子聚合物。
該程序最好先用乙腈和超純水通過小柱，用以活化小柱。將待測(cè)啤酒液經(jīng)過預(yù)先 活化的PEP-SPE小柱，用乙腈洗脫小柱，再過濾。 注意麥汁待測(cè)啤酒不需除氣。待測(cè)啤酒液和發(fā)酵液充分震蕩除氣。 (3)梯度洗脫程序，所述的流動(dòng)相組成是以流動(dòng)相A:0.01X的三氟乙酸水溶液；
流動(dòng)相C :超純水；流動(dòng)相D :乙腈對(duì)待測(cè)啤酒進(jìn)行梯度洗脫。 在0-16分鐘，流動(dòng)相A的比例維持在95% ，流動(dòng)相D的比例維持在5% ;檢測(cè)2_糠 醛在15分鐘附近同待測(cè)啤酒中的其它組分分離；在16-16. 5分鐘，流動(dòng)相的組成轉(zhuǎn)換成 40 %的C和60%的D，持續(xù)這種比例3分鐘以徹底清洗色譜柱；在19. 5-20. 0分鐘，恢復(fù)至 95%的A，5X的D，持續(xù)8分鐘，在第28分鐘結(jié)束時(shí)完成一個(gè)待測(cè)啤酒的整個(gè)梯度運(yùn)行；每 個(gè)步驟流速都是1. 0m1/分鐘，流動(dòng)相比例的轉(zhuǎn)換以等度線性的方式進(jìn)行。
洗脫后采用Waters公司的Atlantis C18色譜柱分析，檢測(cè)波長為280nm。檢測(cè)時(shí) 色譜柱的溫度設(shè)定在30°C。 (4)待測(cè)啤酒和標(biāo)樣譜圖對(duì)比，以保留時(shí)間定性，色譜峰面積定量，計(jì)算公式如
下
式中C#——待測(cè)啤酒中2-糠醛的含量，單位mg/L ;
C標(biāo)——標(biāo)樣中2-糠醛的含量，單位mg/L ; A#——待測(cè)啤酒中2-糠醛的色譜峰面積； Afe——標(biāo)樣中2-糠醛色譜峰面積； f——待測(cè)啤酒的稀釋因子。 PEP-SPE小柱對(duì)于啤酒中 2-糠醛選擇吸附性很好，如圖1 :首先將濃度為 990mg/L的2-糠醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液34ul加入到5ml啤酒中，即啤酒中添加2-糠醛的濃度為6.8mg/L。由于加標(biāo)濃度足夠高，啤酒中的2-糠醛完全可以直接進(jìn)樣檢測(cè)，得到圖1的譜線 A。將5ml加標(biāo)啤酒分別通過活化好的PEP-SPE前處理小柱，收集流出液進(jìn)樣檢測(cè)，得到圖 1的譜線B。譜線B上，2-糠醛基本沒有相應(yīng)，說明流出液中沒有2-糠醛，被100X保留在 小柱上。再用5ml乙腈洗脫小柱，洗脫液進(jìn)樣檢測(cè)的圖1的譜線C，說明2-糠醛幾乎100% 被小柱保留并被乙腈洗脫。而常用的C18小柱對(duì)2-糠醛的保留很差，對(duì)比試驗(yàn)顯示90X的 2-糠醛會(huì)同啤酒的其他組分從小柱直接流出，僅有10%的2-糠醛被小柱所保留。
本發(fā)明采用的PEP-SPE固相萃取小柱由于含有吡咯烷酮極性官能團(tuán)的引入，這 類萃取柱對(duì)各類極性、非極性化合物具有均衡的吸附作用，對(duì)2-糠醛的保留性能好，極 大提高了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，方法加標(biāo)回收率為99.8% -100. 2%，重現(xiàn)性％ RSD(n = 6)《2. 2% ，最小檢出限為5ug/L，可以準(zhǔn)確、可靠的測(cè)定啤酒中2-糠醛的含量，具有很高的 靈敏度。從而克服了傳統(tǒng)C18柱對(duì)極性化合物的保留不足、對(duì)堿性化合物回收不足、小柱容 易跑干等缺點(diǎn)。


圖1是PEP-SPE小柱對(duì)啤酒中2-糠醛的保留性能譜圖。 其中A-啤酒加標(biāo)6. 8mgL直接進(jìn)樣 B-加標(biāo)啤酒經(jīng)小柱的流出液 C-5ml乙腈洗脫液進(jìn)樣檢測(cè) 圖2是標(biāo)樣和啤酒譜圖。 其中I-新鮮啤酒(fC存放) II-老化啤酒(35t:老化7天) III-2. 22mg/L 2-糠醛標(biāo)準(zhǔn) 圖3是Waters公司的Empower數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)于流動(dòng)相轉(zhuǎn)換方式的參數(shù)設(shè)定圖。
具體實(shí)施例方式(1)標(biāo)樣配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用天平準(zhǔn)確稱取100mg的2-糠醛(99% )，用乙腈定容到100ml，得 到2-糠醛儲(chǔ)備 液的濃度為990mg/L。此溶液在0-5。C避光儲(chǔ)存，穩(wěn)定期為3個(gè)月。 標(biāo)準(zhǔn)工作液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈稀釋到適當(dāng)?shù)谋壤?，?-糠醛標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃
度在l-2mg/L 之間。此溶液在0-5t:避光儲(chǔ)存，穩(wěn)定期為7天。
(2)待測(cè)啤酒前處理 先用5ml乙腈通過PEP-SPE小柱，Agela公司(艾杰爾)(中國)提供的待測(cè)啤酒 凈化和濃縮采用的PEP-SPE固相萃取小柱(500mg，6ml)，再以5ml超純水通過小柱，用以活 化小柱。 麥汁待測(cè)啤酒不需除氣。啤酒待測(cè)啤酒和發(fā)酵液充分震蕩除氣。 將30ml待測(cè)啤酒經(jīng)過預(yù)先活化的PEP-SPE小柱。流速控制在5_10ml/分鐘，結(jié)束
后用5ml超純水淋洗小柱，流出液棄去。最后分3次用lml乙腈洗脫小柱，洗脫液收集到玻璃管中，再經(jīng)0. 45 m針筒式過濾器過濾到小樣品瓶中，按照以下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。 [OO43] (3)梯度洗脫程序
3. 1選擇色譜柱 色譜柱采用Waters公司的Atlantis C18色譜柱(250mm*46mm)。這款色譜柱非 常適用于采用水相為主的流動(dòng)相的分析方法，對(duì)于極性較強(qiáng)在普通C18色譜柱上保留很弱 的組分有很好的保留和分離特性。檢測(cè)時(shí)色譜柱的溫度設(shè)定在3(TC，進(jìn)樣量為10ul。由于 2_糠醛的特征吸收波長為229. 7nm和278. Onm并在278. Onm有最大吸收，所以檢測(cè)波長選 擇280nm。 3. 2流動(dòng)相的配制 流動(dòng)相A :用移液槍取lOOul的三氟乙酸，加入超純水定容至1L，得到0. 01%的三
氟乙酸水溶液。 流動(dòng)相C :超純水 流動(dòng)相D :乙腈 所有流動(dòng)相均需經(jīng)0. 45 m濾膜抽濾，并用超純氦脫氣5分鐘后上機(jī)使用。
3. 3梯度洗脫 見表1 。在0-16分鐘，流動(dòng)相A的比例維持在95 % ，流動(dòng)相D的比例維持在5 % 。 檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)2-糠醛在15分鐘附近同待測(cè)啤酒中的其它組分分離，此時(shí)在色譜柱中還會(huì) 有一些極性弱于2-糠醛的組分，為了將這些物質(zhì)盡快洗出色譜柱，在16-16. 5分鐘，流動(dòng)相 的組成轉(zhuǎn)換成40%的C和60%的D，持續(xù)這種比例3分鐘以徹底清洗色譜柱。在19. 5-20. 0 分鐘，恢復(fù)至95%的A， 5%的D，持續(xù)8分鐘，在第28分鐘結(jié)束時(shí)完成一個(gè)待測(cè)啤酒的整個(gè) 梯度運(yùn)行。每個(gè)步驟流速都是1.0ml/分鐘。流動(dòng)相比例的轉(zhuǎn)換以等度線性方式進(jìn)行，即曲 線6的方式。曲線6是Waters公司的數(shù)據(jù)處理軟件Empower對(duì)流動(dòng)相換相的一種參數(shù)設(shè) 定。共有l(wèi)-ll條曲線可供選擇。而曲線6是其中最常用的一種形式。見圖3。
表1 :流動(dòng)相的梯度洗脫程序
步驟時(shí)間流量%A%C曲線
StepTimeFlowrat水(0. 01°/。三|l乙超純水乙腈Gurve
6酸)
10, 01. 095. 00. 05. 06
216. 01. 095. 00. 05. . 06
316. 51. 00. 04060. 06
419. 51. 00. 04060. 06
520. 01. 095. 00. 05. 066 28.0 1.0 95.0 0.0 5.0 6 4、啤酒和標(biāo)樣譜圖對(duì)比檢測(cè) 如圖2，配制濃度為2. 22mg/L的2_糠醛標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣檢測(cè)得到圖2的譜線 III。將同一批啤酒分別在35t:和fC保存7天，得到老化啤酒待測(cè)啤酒和對(duì)照的新鮮啤酒 待測(cè)啤酒。分別將除氣的老化啤酒和新鮮啤酒各30ml通過PEP-SPE前處理小柱，加5ml超 純水淋洗小柱后，分3次用lml乙腈洗脫小柱。洗脫液膜濾后，進(jìn)樣檢測(cè)。老化啤酒對(duì)應(yīng)圖 2的譜線II，新鮮啤酒對(duì)應(yīng)圖2的譜線I。同時(shí)對(duì)2-糠醛標(biāo)準(zhǔn)工作液直接進(jìn)樣檢測(cè)，見圖2 的譜線III。 待測(cè)啤酒和標(biāo)樣譜圖對(duì)比，以保留時(shí)間定性，色譜峰面積定量。計(jì)算公式如下
式中C#——待測(cè)啤酒中2-糠醛的含量，單位mg/L ;
C標(biāo)——標(biāo)樣中2-糠醛的含量，單位mg/L ; A#——待測(cè)啤酒中2-糠醛的色譜峰面積； Afe——標(biāo)樣中2-糠醛色譜峰面積； f——待測(cè)啤酒的稀釋因子；(如果富集30ml啤酒，用3m 1乙腈洗脫，則f
=0. 1) 本發(fā)明參照附圖和實(shí)施例進(jìn)行說明，但保護(hù)范圍不限于此，在本發(fā)明技術(shù)范圍內(nèi) 具有普通技術(shù)人員可以經(jīng)過簡(jiǎn)單的變換，而獲得本發(fā)明同樣的技術(shù)效果，同樣在本發(fā)明的 保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種采用高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法，包括標(biāo)樣配置、待測(cè)啤酒前處理程序、梯度洗脫程序和待測(cè)啤酒和標(biāo)樣譜圖對(duì)比檢測(cè)程序，其特征在于所述的待測(cè)啤酒前處理程序采用極性官能化高分子樹脂固相萃取小柱，即PEP-SPE小柱對(duì)啤酒2-糠醛進(jìn)行保留。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法，其特征在于所述 的PEP-SPE小柱是以極性官能化高分子樹脂為主體的反向固相萃取材料，以乙烯吡咯烷酮 和二乙烯苯共聚得到。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法，其特征在于待 測(cè)啤酒前處理程序先用乙腈和超純水通過PEP-SPE小柱進(jìn)行活化，然后將待測(cè)啤酒液經(jīng)過 預(yù)先活化的PEP-SPE小柱，用乙腈洗脫小柱，再過濾。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法，其特征在于所述梯度洗脫程序中流動(dòng)相的配置為流動(dòng)相A :0. 01%的三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相C :超純 水；流動(dòng)相D:乙腈。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法，其特征在于梯度 洗脫程序?yàn)樵?-16分鐘，流動(dòng)相A的比例維持在95 % ，流動(dòng)相D的比例維持在5 % ;在 16-16. 5分鐘，流動(dòng)相的組成轉(zhuǎn)換成40%的C和60%的D，持續(xù)這種比例3分鐘以徹底清洗 色譜柱；在19. 5-20. 0分鐘，恢復(fù)至95%的A， 5%的D，持續(xù)8分鐘，在第28分鐘結(jié)束時(shí)完 成一個(gè)待測(cè)啤酒的整個(gè)梯度運(yùn)行；每個(gè)步驟流速都是1. 0m1/分鐘，流動(dòng)相比例的轉(zhuǎn)換以等 度線性方式進(jìn)行。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法，其特征在于梯度洗 脫程序采用Waters公司的Atlantis C18色譜柱，檢測(cè)波長為280nm，檢測(cè)時(shí)色譜柱的溫度 設(shè)定在30°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法，其特征在于待 測(cè)啤酒和標(biāo)樣譜圖對(duì)比程序，以保留時(shí)間定性，色譜峰面積定量，計(jì)算公式如下式中C樣一待測(cè)啤酒中2_糠醛的含量，單位mg/L ; C標(biāo)一 標(biāo)樣中2-糠醛的含量，單位mg/L ; A^ —待測(cè)啤酒中2-糠醛的色譜峰面積； Ag—標(biāo)樣中2-糠醛色譜峰面積； f一待測(cè)啤酒的稀釋因子。
全文摘要
一種采用高效液相色譜測(cè)定啤酒中2-糠醛的方法，包括標(biāo)樣配制、待測(cè)啤酒前處理程序、梯度洗脫程序和啤酒和標(biāo)樣譜圖對(duì)比檢測(cè)程序，在待測(cè)啤酒前處理程序采用固相萃取小柱PEP-SPE對(duì)啤酒2-糠醛進(jìn)行保留。梯度洗脫程序中流動(dòng)相A0.01％的三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相C超純水；流動(dòng)相D乙腈，在0-16分鐘，流動(dòng)相A的比例維持在95％，流動(dòng)相D的比例維持在5％；在16-16.5分鐘，流動(dòng)相的組成轉(zhuǎn)換成40％的C和60％的D，持續(xù)這種比例3分鐘以徹底清洗色譜柱；在19.5-20.0分鐘，恢復(fù)至95％的A，5％的D，持續(xù)8分鐘，在第28分鐘結(jié)束時(shí)完成一個(gè)待測(cè)啤酒的整個(gè)梯度運(yùn)行；每個(gè)步驟流速都是1.0ml/分鐘，流動(dòng)相比例的轉(zhuǎn)換以等度線性方式進(jìn)行。本發(fā)明高效凈化啤酒待測(cè)啤酒并富集2-糠醛，在Waters AlantisC18(250mm*46mm)色譜柱上，0.01％三氟乙酸和乙腈梯度洗脫，在波長280nm下定量檢測(cè)啤酒中的2-糠醛。方法的加標(biāo)回收率99.8％-100.2％，重現(xiàn)性％RSD(n＝6)≤2.2％，最小檢出限5ug/L。
文檔編號(hào)G01N30/02GK101762647SQ20081018759
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者單連菊, 李梅, 楊朝霞, 楊梅, 董建軍, 郝俊光 申請(qǐng)人:青島啤酒股份有限公司