專利名稱：新的鎘離子人工抗原螯合劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的雙功能螯合劑，尤其是鎘離子人工抗原 的新螯合劑的制備方法。
背景技術(shù)：
在重金屬免疫分析技術(shù)中需進行人工抗原的合成，合成重金 屬人工抗原是利用雙功能螯合劑先與重金屬形成穩(wěn)定的螯合物 <^^^^t，:再與載體蛋由質(zhì)偶聯(lián)形成重金屬-螯合劑 -載體蛋 白質(zhì)人工抗原，相對于重金屬鎘而言，目前已有的化合物中^J^ 找到合適的雙功能螯合劑，有的結(jié)構(gòu)不太適合，有的價格過于昂 貴，不易大量應(yīng)用，阻礙了重金屬鎘人工抗原的有效合成。如
CN10106337 "重金屬鎘單克隆抗體的制備方法"中采用日本進口 的1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N， ，N，-四乙酸作為鎘離 子的雙功能螯合劑，售價高達300元/mg，推廣與應(yīng)用受到限制， 故尋找具肴自主產(chǎn)權(quán)的用于鎘人工抗原合成的雙功能螯合劑，并 進而制備相應(yīng)的單克隆抗體，進行重金屬鎘殘留污染的快速檢測 具有十分重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種針對重金屬鎘的雙功能螯合劑6-溴乙酰氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的制 備方法，并公開基于此雙功能螯合劑的人工抗原合成和單克隆抗 體的制備方法和檢測結(jié)果，以進一步驗證本螯合劑在人工抗原合 成中的應(yīng)用效果。
本發(fā)明的目的通過如下措施實現(xiàn) 新螯合劑BATDQ的制備方法包括如下步驟
1) 6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉的合成
將2 g 4-硝基鄰苯二胺和1.13 g 丁二酮;^ 250 mL單口燒 瓶中，以50 mL無水乙醇為溶劑，加熱回流2 h，冷卻至室溫后 抽濾，加30mL無水乙醇結(jié)晶提純，所得產(chǎn)物即為6-硝基-2， 3-
二甲基喹喔啉；
2) 6-硝基-2， 3-二溴甲基會喔啉的合成
取0. 5 g第一步產(chǎn)物6-硝基-2， 3-二甲基會喔啉、0. 202 g 偶氮二異丁腈與1. 14 g N-溴代琥珀酰亞胺置于干燥的250 mL單 口圓底燒瓶中，再取40 mL CCh加入燒瓶中，裝上回流冷凝管， 抽真空并用氬氣保護，將燒瓶置于事先加熱到80X:的油浴中，強 力攪拌，并用火焰槍輔助加熱使之快速回流，待反應(yīng)完畢后，將 混合物冷卻至室溫再過濾，取濾液iO^水浴鍋中蒸餾、冷卻，得 6-硝基-2， 3-二溴曱基喹喔啉；
3) 6-硝基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的 合成
在裝有機械攪拌、回流冷凝管和恒壓漏斗的三口燒瓶中，加入1.99 mL亞氨基二乙酸二乙酯、10 mL干燥的乙腈和2. 63 g無 水碳酸鉀粉末，攪拌下向反應(yīng)混合液中滴加溶有1. 805 g 6-硝基 -2， 3-二溴甲基喹喔啉的lOmL干燥的乙腈，回流8-10h，冷卻， 濾去碳酸鉀，濾液減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得淡黃色油狀液體， 往上述油狀液中加入含3. 48g Ba(OH)2 8H20的飽和溶液，室溫 下充分攪拌至油狀液均轉(zhuǎn)化為白色沉淀，抽濾鋇鹽并用蒸餾水充 分浸泡、洗滌。然后將此鋇鹽轉(zhuǎn)移到15mL水中，將混合物加熱 煮沸，加入石危酸至清液中不再出現(xiàn)混濁，過濾除去石克酸鋇，再用 沸水煮洗硫酸鋇殘渣3次，將濾液和洗滌液合并，冰箱中冷卻8-10 h得到6-硝基-2， 3-(N， N，N', N'-四乙酸)二曱胺基喹喔啉；
4 ) 6-氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的 合成
將100mL乙醇和2. 025g6-硝基-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酌 二曱胺基喹喔啉加入到250 mL裝有溫度計、機械攪拌器的三口 瓶中，攪拌加入1. 2 g把碳催化劑和5. 29 g 7jC合肼在80-85X:條 件下反應(yīng)4 h后，趁熱過濾，濾液經(jīng)減壓蒸去乙醇，冷卻后所得 固體用50mL苯重結(jié)晶，得到6-氨基-2，3-(N， N， N'， N'-四乙 酸)二甲i基會喔啉；
5) 6-溴乙酰^t^-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基會 鬼啉的合成
取5. 05 g溴乙酰溴溶于30 mL三氯化碳中，2.105 g碳酸氫 鈉溶于100 mL水中，水浴中將碳酸氬鈉溶液緩慢滴入到溴乙酰溴溶液中，取18.722 g 6-氨基-2，3-(N， N， N、 N'-四乙酸)二 甲胺基喹喔啉^v三口燒瓶中，溫度保持在50-60。C,快速攪拌 的同時把溴乙酰溴和碳酸氫鈉混合液緩慢地滴入6-^J^-2， 3- (N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氫氧化鈉溶液控制 反應(yīng)體系的pH為l2. 0，滴加完畢，升溫到90。C，攪拌，將溶劑 全部蒸出，加入50mL濃鹽酸，過濾分離出NaCl，然后往鹽酸提 取液中加入150 mL無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，4"存放8-10 h, 用50%的乙醇水溶液重結(jié)晶，得6-溴乙酰#^-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酌二甲胺基會喔啉(6-bromine acetamido-2， 3-(N， N， N'， N'-tetraacethyl ) dimethylamino-quinoxaline， 簡稱 BATDQ)，即為本發(fā)明的新螯合劑。
本發(fā)明的有益效果是應(yīng)用本雙功能螯合劑偶聯(lián)率通過原子 吸收分光光度法檢測達到11-15: 1,符合要求，原料和人工等成 本價格為30元/mg，成本低；合成人工抗原免疫原性強，穩(wěn)定性 好，所制備的抗血清效價達到3xl05;獲得的單克隆抗^出限 低為lpbb、特異性強，制備過程簡單。
具體實施例方式
本發(fā)明下面用結(jié)構(gòu)式表示各原料合成新螯合劑的反應(yīng)路線；<formula>formula see original document page 8</formula>
本螯合劑的合成以4-硝基鄰苯二胺為核心原料，經(jīng)過縮合、 溴化、消除、還原、?；幌盗蟹磻?yīng)化學合成了 6-溴乙酰^J^-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基會喔啉化合物， 一方面它具 有的四乙酸結(jié)構(gòu)能與鎘離子形成穩(wěn)定的螯合物，另一方面溴乙酰 氨基團上的溴在弱堿性條件下極易與蛋白分子上的氨基發(fā)生縮 合反應(yīng)，形成了鎘離子-螯合劑-載體蛋白質(zhì)復合物，從而實現(xiàn)了 重金屬鎘離子人工抗原的合成。
這種新型螯合劑的成功合成為重金屬鎘人工抗原合成提供 了較為簡便的手段，為重金屬鎘的酶免疫分析技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。 同時，將新合成的人工抗原通過小鼠免疫、細胞融合等生物學技 術(shù)最后獲得高效價、高靈敏度的單克隆抗體，進而建立起一^4h 對重金屬鎘的可靠免疫學速測技術(shù)。
本申^"是對傳統(tǒng)的重金屬鎘離子檢測技術(shù)的有益補充，為重 金屬鎘污染殘留的在線速測方法提供了新途徑，以快速、靈敏、 成本低、便于對多個樣品進行在線操作等優(yōu)點決定了能更好的適 應(yīng)重金屬鎘分析任務(wù)重、要求高的特點，其技術(shù)特點適合重金屬 鎘快速檢測的發(fā)展方向。經(jīng)文獻檢索和市場調(diào)查，6-溴乙酰M -2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基會喔啉的合成及基于此螯合劑的重金屬鎘單克隆抗體在國內(nèi)外尚未見報道和應(yīng)用。
因合成鎘單克隆抗體所需BATDQ螯合劑的量不多，所以均以 實驗室設(shè)備制備，反應(yīng)中涉及的用量以克、毫克、毫升計量，如 需大批量推廣，再折算成千克、升計量，并用工業(yè)化手段采用反 應(yīng)釜等相應(yīng)設(shè)備生產(chǎn)，這是同行技術(shù)人員易于掌握的。又因權(quán)利 要求書中的各原料、加入量、反應(yīng)M都給出了單個數(shù)值，不是 區(qū)間值，屬最佳方案，所以下面只給出一個最佳實施例。
最佳實施例
本新螯合劑的合成方法包括下列步驟
1) 6-硝基-2， 3-二甲基會喔啉的合成
將2 g 4-硝基鄰苯二胺和1, 13 g丁二酮i^ 250 mL單口燒 瓶中，以50 mL無水乙醇為溶劑，加熱回流2 h，冷卻至室溫后 抽濾，加30mL無水乙醇結(jié)晶提純，所得產(chǎn)物即為6-硝基-2， 3-二曱基喹喔啉；
2) 6-賄基-2， 3-二溴甲基會喔啉的合成
取O. 5 g第一步產(chǎn)物6-硝基-2， 3-二甲基全鬼啉、0.202 g 偶氮二異丁腈與1.14 g N-溴代琥珀酰亞胺置于干燥的250 mL單 口圓底燒瓶中，再取40 mL CCl4加入燒瓶中，裝上回流冷凝管， 抽真空并用氬氣保護，將燒瓶置于事先加熱到801C的油浴中，強 力攪拌，并用火焰槍輔助加熱使之快速回流，待反應(yīng)完畢后，將 混合物冷卻至室溫再過濾，取濾液放入水浴鍋中蒸餾、冷卻，得 6-硝基-2， 3-二溴甲基喹喔啉；
3) 6-硝基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙紛二甲胺基全喔啉的 合成
在裝有機械攪拌、回流冷凝管和恒壓漏斗的主口燒瓶中，加 入1.99 mL亞氣基二乙酸二乙酯、10 mL干燥的乙腈和2. 63 g無 !|<^酸鉀粉末，攪拌下向反應(yīng)混合液中滴加溶有1. 805 g 6-硝基 -2， 3-二溴甲基喹喔啉的lOmL干燥的乙腈，回流8-10h，冷卻， 濾去碳酸鉀，濾液減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得淡黃色油狀液體， 往上述油狀液中加入含3. 48 g Ba(OH)2 . 8H20的飽和溶液，室溫
下充分攪拌至油狀液均轉(zhuǎn)化為白色沉淀，抽濾鋇鹽并用蒸餾水充 分浸泡、洗滌。然后將此鋇鹽轉(zhuǎn)移到15 mL水中，將混合物加熱 煮沸，加入硫酸至清液中不再出現(xiàn)混濁，過濾除去石危酸鋇，再用 沸水煮洗硫酸鋇殘渣3次，將濾液和洗滌液合并,冰箱中冷卻8-10 h得到6-硝基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
4 ) 6-氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基會喔啉的 合成
將100 mL乙醇和2. 025 g 6-硝基-2,3-(N， N， N'， N'-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉加入到250 mL裝有溫度計、；Wfe攪拌器的三 口瓶中，攪拌加入1.2 g M催化劑和5.29 g水合肼在80-85 n條件下反應(yīng)4 h后，趁熱過濾，濾液經(jīng)減壓蒸去乙醇，冷卻后 所得固體用50 mL苯重結(jié)晶，得到6-JL^-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹鬼啉；
5) 6-溴乙酰絲-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基喹 喔啉的合成
取5. 05 g溴乙酰溴溶于30 mL三氯化碳中，2.105 g碳酸氫 鈉溶于100 mL水中，水浴中將碳酸氬鈉溶液緩慢滴入到溴乙酰 溴溶液中，取18. 722 g 6-絲-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二 甲胺基喹喔啉裝入三口燒瓶中，溫度保持在50-60lC，快速攪拌 的同時把溴乙酰溴和碳酸氫鈉混合液緩慢地滴入6-#J^-2， 3- (N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氫氧化鈉溶液控制 反應(yīng)體系的pH為12.0。滴加完畢，升溫到901C，攪拌，將溶劑
10全部蒸出，加入50mL濃鹽酸，過濾分離出NaCl，然后往鹽酸提 取液中加入150 mL無水乙醇，產(chǎn)生白色; 冗淀，41C存放8-10 h， 用50%的乙醇水溶液重結(jié)晶，得6-溴乙酰M-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酌二甲胺基喹喔啉，簡稱為BATDQ。
用本新螯合劑合成重金屬鎘人工抗原的方法按如下步驟進
行
1) 人工抗原的合成
取BATDQ 0. 8 mg，用pH為7. 5， 0. 1 mol L—'的磷酸鹽緩沖 液定容至2mL，加入0. 4 mg的CdCl2，攪拌使其混合均勻，反應(yīng) 30min，將5 mg牛血清白蛋白(BSA)用磷酸鹽緩沖液定容至2 mL， 室溫下，將其緩慢加入BATDQ和CdCl2的混合溶液中，并用KOH 調(diào)節(jié)pH到9.5，室溫下攪拌反應(yīng)20 min，存放于41C冰箱反應(yīng) 8-10 h。
將充分反應(yīng)的混合液在使用前用10 mmol L—1的EDTA和去離 子水沖洗過的截留分子量為30KD的超濾管，在3000 rpm/min的 條件下離心10 min，用pH為7.4， 0.1 mol . L_1Tris-HC1不斷 沖洗，直至保留液中不再含游離的小分子物質(zhì)為止，用Tris-HCl 稀釋至5 mL， -20X:冰箱保存，待用；
2) 包被原的合成
用新合成的雙功能螯合劑BATDQ先與重金屬鎘離子螯合形成 Cd-BATDQ《螯合物，再以人血清白蛋白(HSA)為載體，合成 Cd-BATDQ-HSA包凈皮抗原；
3) 原子吸收法對偶聯(lián)結(jié)果的鑒定
分別配制鎘標液(O. 1、 0.3、 0.5、 0.7、 0. 9mg.L—"，做 標準曲線，將偶聯(lián)產(chǎn)物取1 mL稀釋20倍用原子吸收法檢測鎘的 含量。經(jīng)原子吸收分光光度法檢測人工抗原Cd-BATDQ-BSA、Cd-BATDQ-HSA中鎘離子的含量分別為20. 0 mg 'L_1、 26. 0 mg 'L一1， 經(jīng)計算兩種人工抗原的偶聯(lián)率分別為11-12:1、 14-15:1，偶聯(lián)比 率符合制備抗體要求。
4 ) SDS-PAGE法對偶聯(lián)結(jié)果的鑒定
采用SDS-PAGE不連續(xù)電泳，以Tris-HCl作為緩沖體系，10% 分離膠，5%濃縮膠。樣品在濃縮膠上電泳時以恒定電流(20 mA) 電泳，待其轉(zhuǎn)入分離膠后恒定電流(30 mA)，電泳至溴酚藍距分 離膠底邊1 cm左右停止。卸開電泳槽，取出膠板，固定液固定 40min，敏化30 min，水洗4次，銀染，最后顯色呈像。電泳結(jié) 果顯示，人工抗原Cd-BATDQ-BSA、 Cd-BATDQ-HSA在電泳中的泳
動速度明顯落后于其相應(yīng)的栽體蛋白，且偶聯(lián)后的人工抗原與原 載體蛋白相比增加的分子量在6000 D左右。
用人工抗原制備重金屬鎘單克隆抗體的方法包括如下步驟
1)小鼠免疫及抗血清制備
選用6周齡雌性BALB/c小鼠8只，將人工抗原與佐劑(完 全或不完全)按l:l比例混合，注射器雙推法使其混合均勻，初 次免疫將人工抗原與完全佐劑乳化，腹腔、皮下、頸部每只小鼠 注射O. 2mL， 一免3周后進行二免，劑量和途徑同第一次，從二 免開始佐劑換用不完全佐劑，每隔兩周分別進行三免、四免，四 免后采血清，檢測效價，取效價高的繼續(xù)加強免疫，加強免疫時 抗原不加任何佐劑；
加強免疫3天后，摘眼^^小鼠血液于滅菌的康氏管內(nèi)，室 溫放置lh，在超凈工作臺用無菌管把血塊和管壁剝離，371C恒溫 2 h后，41C水箱中反應(yīng)8-10 h，使血清充分析出，收集血清， 將血清1000 rpm/min離心10 min,收集上清，將血清分裝，-202) 抗血清效價檢測
用pH為9. 6， 0. 05 mol . L—碳酸鹽包被緩沖液將包被抗原 Cd-BATDQ-HSA稀釋為2 ng'mL—、 100 pL/孔，包被到酶標板 上，4C反應(yīng)8-10 h;
傾去板孔液，用pH為7.4, 0.15 mol L—1碳酸鹽洗滌液洗 滌3次，3 min/次，4白干；
加入10%小牛血清作為封閉液，200 pL/孔，371C孵育3h， 同前洗滌；
加入用抗血清稀釋液按400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800、 25600、 51200倍稀釋的抗血清，設(shè)置空白對照，并用正常小鼠血 清作為陰性對照，371C孵育1 h,洗滌；
加入l:5000稀釋的羊抗小鼠酶標IgG-HRP， 100 pL/孔，37 x:孵育1 h，同前洗滌；
加入鄰苯二胺底物顯色，100 pL/孔，37r顯色15 min;
加入2 mol L —化S04終止顯色反應(yīng)，50 pL/孔，終止反應(yīng) 5 minj
于492 nm波段處測吸光值，以樣品孔的OD值大于陰性孔的 OD值的2倍為陽性，經(jīng)間接ELISA法檢測抗血清的效價達到1 x 105'
3) 細胞融合
(1)在無菌條件下，制備飼養(yǎng)細胞，取效價高的BALB/c小 鼠，最后加強免疫三天后，制備免疫脾細胞，并準備對數(shù)生長期 的Sp2/0瘤細胞；
(2 )取1. 0 x 108個脾細胞，2. 0-5. 0 x 107個Sp2/0細胞按 1:1-IO的比列加入到50mL融合管中,輕輕搖勻；
(3 ) 1000 r/min離心10 min，棄上清液；
13(4) 將融合管置于掌心輕輕摩擦，以防止細胞沉淀，使細胞
木>*均勻成糊狀；
(5) 將融合管置于371C水浴中，吸取l mL 371C預(yù)熱的聚乙 二醇4000，緩慢加入融合管中，邊加邊輕輕搖勻，60S內(nèi)加完；
(6 )在90 S內(nèi)緩慢滴加無血清的DMEM( Dulbecco' s Modified Eagle Media)培養(yǎng)基30-40 mL，終止融合；
(7) 37"C靜止10 min后，1000 r/min，離心10 min，棄上
清液；
(8 )將融合管置于手掌，摩擦使4^Ht，加入60-80 mL HAT 培養(yǎng)基使細胞懸浮，混勻，分裝于帶有伺養(yǎng)細胞的96孔細胞培 養(yǎng)板里，100 iLiL/孔，37X:、 5% 002培養(yǎng)。
4) 陽性孔的篩選及克隆細胞融合后12-16 d篩選，采用有限稀釋法
(1) 制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，細胞計數(shù)，用含12%血 清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含5、 10和15個細胞3種不同的稀
釋度；
(2) 每種雜交瘤細胞分裝于培養(yǎng)有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培 養(yǎng)板中，每個稀釋度分裝32孔，每孔量為0.1 mL，每孔的雜交 瘤細胞數(shù)分別為0.5、 1和1.5;
(3) 371C、 5%(:02濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即 用間接EI/ISA法檢測抗體效價；
(4) 取抗體檢測陽性孔的細胞繼續(xù)擴大培養(yǎng)并凍存。
5) 腹7jc型單抗的制備
(1)腹腔注射液體石蠟，每只小鼠0. 3-0. 5 mL; (2 ) 7-10天用無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞腹腔接種，每 只小鼠注射5><105個細胞；(3) 間隔5天后，觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大， 以手觸摸時，皮膚有緊張感，即用16號針頭采集腹水，連續(xù)采 2-3次，每只小鼠采5-10 mL腹水;
(4) 將腹水在2000 rmp/min條件下離心5 min，除去細胞成 分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-8010凍 存，或凍干保存。
6)腹水型單抗的純化
(1)用微孔濾膜過濾腹水，除去較大的凝塊及脂肪滴，在4 1C， 10000rmp/min的條件下離心15 min，除去細胞殘渣及小顆
粒物質(zhì)；
(2 )飽和硫酸銨法進行粗提；
(3 ) DEAE離子交換層析法對單抗進行純化
至此，本發(fā)明對新螯合劑的制備方法、基于本螯合劑的人工 抗原的合成及對應(yīng)鎘螯合物單克隆抗體的制備，都作了完整而清 楚的介紹，穿插介紹了人工抗原偶聯(lián)結(jié)果的兩種鑒定方法，抗血 清效價的檢測方法，進行驗證。
為更進一步說明本發(fā)明，下面再介紹抗體效價的檢測，鎘標 準曲線的建立、抑制率的計算，并以水果中重金屬鎘離子的含量 為例介紹快速檢測法，便于公眾全面了解本發(fā)明。
為檢測抗體效價的需要，介紹包被抗原的合成方法
取BA1DQ 0. 8 mg，用pH為7. 5， 0.1 mol . 1^的磷酸鹽緩沖 液定容至2mL，加入0. 4 mg的CdCl2，攪拌使其混合均勻，反應(yīng) 30 min，將5 mg Ajk清白蛋白用磷酸鹽緩沖液定容至2 mL，室 溫下，將其緩慢加入BATDQ和CdCl2的混合溶液中，并用KOH調(diào) 節(jié)pH到9. 5，室溫下攪拌反應(yīng)20 min，存放于41C水箱反應(yīng)8-10 h。將充分反應(yīng)的混合液用使用前用10 mmo 1 L_1的EDTA和去離 子水沖洗過的截留分子量為30KD的超濾管在3000 rpm/min的條 件下離心10 min，用pH為7.4， 0.1 mol . L_1Tris-HCl不斷沖 洗，直至保留液中不再含游離的小分子物質(zhì)為止，用Tris-HCl 稀釋至5 mL， -20"C水箱保存，待用。
為檢測抗體的檢測限，下面介紹重金屬鎘標準曲線的建立
1、 包被以最佳包被抗原濃度(2 jug'mL—D包被酶標板， 100 juL /孔，4"C冰箱過夜，洗滌液洗板5次；
2、 封閉10%的小牛血清，200 pL/孔，37"C反應(yīng)3h，洗滌 液洗板5次；
3、 加樣取系列濃度(O、 10、 50、 100、 250、 500、 1 000和 5000 ng ml/1)的金屬鎘標液加入適宜濃度的EDTA中，按1:1 的體積比加入最佳稀釋濃度的抗血清，室溫下反應(yīng)30min, 100 p L/孔，37"C反應(yīng)lh，洗滌液洗板5次；
4、 加酶標二抗要求稀釋肌P標記的羊抗鼠抗體IgG-HRP， 將稀釋后的IgG-HRP按IOO [iL /孔加入酶標板，37C反應(yīng)1 h, 洗滌液洗板5次；
5、 顯色配好的OPD顯色液顯色10 min， 100 pL/孔；
6、 終止加2 mol L—i的硫酸，50 ^L/孔；
7、 讀數(shù)在酶標儀上測420 nm處的吸光度，并計算抑制率；
8、 抑制率的計算
她制啦^T。/、零標準吸光度值-樣卩^或標準夜吸光iS值1nno/
抑制夠命零標準吸光雌-空白對照吸光度值x100%
然后以1%為縱坐標，以標樣的自然對數(shù)濃度值為橫坐標， 做標準曲線。下面以水體中重金屬鎘含量的快速檢測為例加以說明 水體樣品的前處理取水樣1000 jLiL，用0.45 pm的微孔濾膜 過濾出去雜質(zhì)，加入IOOO pg ml^的鎘標液5pL，配置成5 p g . ml/的液體樣品。
1、 包被以最佳包被抗原濃度(4 pg/mL)包被酶標板，100 pL /孔，41C水箱反應(yīng)8-10 h，洗滌液洗板5次；
2、 封閉10%的小牛血清，200 pL/孔，37*C反應(yīng)3 h，洗 滌液洗板5次；
3、 加樣將樣品和最佳稀釋濃度的抗血清按l:l的體積，充 分混合，室溫下反應(yīng)30 min， 100卩L /孔，37"C反應(yīng)1 h，洗 滌液洗板5次；
4、 加酶標二抗將按要求稀釋后的HRP標記的羊抗鼠抗體， 100 juL /孔加入酶標板，37"C >^應(yīng)1 h，洗滌液^U15次；
5、 顯色加入配好的OPD顯色液H吏用前配制)顯色10min， 100 pL /孔；
6、 終止加2 mol . L—的石危酸，50 jliL /孔，終止5 min;
7、 讀數(shù)在酶標儀上測420 nm處的吸光度；
8、 數(shù)據(jù)處理根據(jù)每個樣品的1%值就可根據(jù)標準曲線求出相 對應(yīng)樣品的濃度。
本發(fā)日月中使用的許多化學原料如DMEM、 HAT、 HT、 Tris-HCl、 EDTA等都可以從市售獲得，相應(yīng)的使用方法在該產(chǎn)品的說明書中 有明示，不細述。
權(quán)利要求
1、一種新的鎘離子人工抗原螯合劑制備方法，其特征在于包括下列步驟1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成將2g4-硝基鄰苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL單口燒瓶中，以50mL無水乙醇為溶劑，加熱回流2h，冷卻至室溫后抽濾，加30mL無水乙醇結(jié)晶提純，所得產(chǎn)物即為6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉；2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成取0. 5g第一步產(chǎn)物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二異丁腈與1.14g N-溴代琥珀酰亞胺置于干燥的250mL單口圓底燒瓶中，再取40mL CCl4加入燒瓶中，裝上回流冷凝管，抽真空并用氬氣保護，將燒瓶置于事先加熱到80℃的油浴中，強力攪拌，并用火焰槍輔助加熱使之快速回流，待反應(yīng)完畢后，將混合物冷卻至室溫再過濾，取濾液放入水浴鍋中蒸餾、冷卻，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成在裝有機械攪拌、回流冷凝管和恒壓漏斗的三口燒瓶中，加入1.99mL亞氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g無水碳酸鉀粉末，攪拌下向反應(yīng)混合液中滴加溶有1.805g6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥的乙腈，回流8-10h，冷卻，濾去碳酸鉀，濾液減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得淡黃色油狀液體，往上述油狀液中加入含3.48g Ba(OH)2·8H2O的飽和溶液，室溫下充分攪拌至油狀液均轉(zhuǎn)化為白色沉淀，抽濾鋇鹽并用蒸餾水充分浸泡、洗滌。然后將此鋇鹽轉(zhuǎn)移到15mL水中，將混合物加熱煮沸，加入硫酸至清液中不再出現(xiàn)混濁，過濾除去硫酸鋇，再用沸水煮洗硫酸鋇殘渣3次，將濾液和洗滌液合并，冰箱中冷卻8-10h得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成將100mL乙醇和2. 025g6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL裝有溫度計、機械攪拌器的三口瓶中，攪拌加入1.2g鈀碳催化劑和5.29g水合肼在80-85℃條件下反應(yīng)4h后，趁熱過濾，濾液經(jīng)減壓蒸去乙醇，冷卻后所得固體用50mL苯重結(jié)晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成取5. 05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氫鈉溶于100mL水中，冰浴中將碳酸氫鈉溶液緩慢滴入到溴乙酰溴溶液中，取18.722g6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉裝入三口燒瓶中，溫度保持在50-60℃，快速攪拌的同時把溴乙酰溴和碳酸氫鈉混合液緩慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氫氧化鈉溶液控制反應(yīng)體系的pH為12.0，滴加完畢，升溫到90℃，攪拌，將溶劑全部蒸出，加入50mL濃鹽酸，過濾分離出NaCl，然后往鹽酸提取液中加入150mL無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重結(jié)晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉，簡稱BATDQ，即為本發(fā)明的新螯合劑。
全文摘要
一種新的鎘離子人工抗原螯合劑制備方法，以4-硝基鄰苯二胺為原料經(jīng)過縮合、溴化、消除等一系列反應(yīng)化學合成了6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉，簡稱BATDQ，以該新螯合劑先與鎘離子螯合形成Cd-BATDQ，再與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)合成人工抗原Cd-BATDQ-BSA，通過免疫BALB/c小鼠，然后通過雜交瘤制備技術(shù)獲得針對重金屬鎘螯合物的單克隆抗體，用于檢測環(huán)境、食品、水體中重金屬鎘的殘留。本發(fā)明具有快速、靈敏、成本低、特別適合大批量樣品現(xiàn)場快速檢測的特點，尤其是本新螯合劑的成功合成，為鎘離子人工抗原的合成提供了全新的、低成本的、穩(wěn)定而靈敏的核心原料，應(yīng)用推廣前景廣闊。
文檔編號G01N33/536GK101429167SQ20081016218
公開日2009年5月13日 申請日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者孔新剛, 龐鑠權(quán), 明 郭 申請人:浙江林學院