專利名稱：運(yùn)用重組多表位肽蛋白進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫檢測學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及一種運(yùn)用重組多表位 肽蛋白進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢測的方法。
背景技術(shù)：
鉤端螺旋體病是一種由鉤端螺旋體菌感染而產(chǎn)生的動(dòng)物傳染性疾病通過 接觸家養(yǎng)或野生的動(dòng)物宿主或被它們尿液所污染的環(huán)境而傳播給人。鉤端螺旋 體由8種致病的遺傳相異類型和4種非致病的腐生種類組成。鉤端螺旋體還按
血清型情況進(jìn)行了分類，目前已鑒定出了 230多個(gè)致病血清變型。
鉤端螺旋體病廣泛分布于世界各地。由于大范圍的動(dòng)物物種可作為其宿主， 所以該病被認(rèn)為是最普遍的人畜共患疾病。該病的早期特征為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭 痛和嚴(yán)重的肌肉痛，由于癥狀與出血熱、感冒等相似而常被誤診。在臨床感染 中有5-15%的病人病情發(fā)展至產(chǎn)生諸如黃疸、腎機(jī)能不全和肺出血等嚴(yán)重的多 系統(tǒng)并發(fā)癥。嚴(yán)重的鉤端螺旋體病死亡率為5-50%。
最近幾年該病已出現(xiàn)了新的傳播模式，突出顯示了鉤端螺旋體病正成為公 共健康問題的嚴(yán)重性。在發(fā)達(dá)國家，鉤體病成為消遣性活動(dòng)和體育運(yùn)動(dòng)相關(guān)性 疾病發(fā)作的原因。在發(fā)展中國家，貧困狀況已造成了高死亡率鉤體病在城市或 鄉(xiāng)村的廣泛傳播。不僅如此，鉤體病還造成牛、豬、羊、馬和狗等牲畜和家養(yǎng) 動(dòng)物的流產(chǎn)、死產(chǎn)、不育、不生長、產(chǎn)奶量低甚至死亡。
目前適當(dāng)檢測工具的缺乏阻礙了對人和動(dòng)物鉤體病的控制。雖然經(jīng)過數(shù)十 年的努力，在鉤端螺旋體病的科研和防治方面己取得了一定的成就，但目前鉤 體檢測方法主要有直接暗視野顯微鏡檢查法、改良鍍銀染色法、凝集試驗(yàn)及凝 集素吸收試驗(yàn)等。但這些方法不適合急性病例的鑒別。新發(fā)展的基于全細(xì)胞鉤 端螺旋體抗原制品的酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)和其它快速血清學(xué)檢測仍需 要進(jìn)行MAT以確認(rèn)病例。鉤端螺旋體病的發(fā)病機(jī)理依賴于感染早期病原體在宿 主體內(nèi)廣泛散布的能力。鉤體外膜蛋白被認(rèn)為介導(dǎo)了使其能穿過并散布于宿主組織間的相互作用。此外，外膜蛋白在宿主感染期間可引發(fā)免疫反應(yīng)，因此構(gòu) 成了通過抗體依賴型吞噬作用和補(bǔ)體介導(dǎo)型致死作用等機(jī)制而進(jìn)行免疫保護(hù)的 耙分子。最近有利用重組外膜蛋白作為鉤端螺旋體病的血清學(xué)檢測的方法，但 由于鉤端螺旋體的抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血清型眾多，用常規(guī)的以多抗血清為基礎(chǔ)的 血清學(xué)方法不利于該病的早期快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種運(yùn)用重組多表位肽蛋白 進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種運(yùn)用重組多表位肽蛋白 進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢測的方法，采用鉤端螺旋體外膜蛋白優(yōu)勢抗原決定簇的 重組多表位肽為檢測抗原構(gòu)建試劑盒或試紙條，檢測鉤端螺旋體抗體IgM或IgG。
進(jìn)一步地，它包括以下步驟-
(1) 篩選鉤端螺旋體外膜蛋白OmpLl、 LipL21和LipL32的優(yōu)勢抗原表位；
(2) 根據(jù)篩選的表位序列及表達(dá)系統(tǒng)的偏愛性，人工合成DNA序列并采用基因 工程手段獲得目的蛋白的編碼基因；
(3) 將合成的基因片段克隆到表達(dá)載體中并構(gòu)建表達(dá)該目的蛋白的表達(dá)系統(tǒng)；
(4) 根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)選用一定的純化方法提純目的蛋白并獲得高純度的
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(5) 對所述步驟(4)獲得的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定具有22 kD分 子量的特定蛋白存在；對目標(biāo)蛋白進(jìn)行Western Blot分析，確定所獲得 蛋白的免疫反應(yīng)性。
(6) 以獲得的重組蛋白為抗原，構(gòu)建ELISA檢測試劑盒或試紙條，檢測目標(biāo)樣 品中抗鉤體IgG或IgM的存在情況而實(shí)現(xiàn)對鉤體病人的檢測。
進(jìn)"步地所述的目標(biāo)樣品為人或動(dòng)物的血清、腦脊液等所有已經(jīng)脫離人體 或動(dòng)物體的體液樣品；所述的用于鉤端螺旋體感染檢測的方法是在體外進(jìn)行的。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明用多表位串連表達(dá)蛋白作為抗原進(jìn)行鉤體病 血清學(xué)檢測具有特異、快速、方便、靈敏正確、結(jié)果可肉眼觀察等特點(diǎn)，且該 檢測方法沒有鉤體不同血清型的限制，有利于其推廣應(yīng)用。


4圖1為重組質(zhì)粒的酶切圖譜，圖中，Ml， 50 bp DNA marker; 1， pBacPAK8/BamHI+EcoRI; 2， pBacPAK8-Imp/ BamHI+EcoRI; 3， pBacPAK8-21mp/ BaraHI+EcoRI; 4， pET28a/BamHI+EcoRI; 5， pET28a-21mp/BamHI+EcoRI; M2， 1 kb DNA marker。
圖2為目的蛋白的SDS-PAGE分析圖，圖中，M， protein ladder: 1， pET28a; 2-3， pET28a-21mp超聲波破碎上清；4-5， pET28a-21mp超聲波破碎沉淀；6-7， 2 Imp純化。
圖3 Western Blot分析結(jié)果圖，圖中，1， 2， 3，分別為pET28a， pET28a-21mp， 21mp purification與抗體的雜交條帶。 圖4檢測試紙條的設(shè)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過基因工程手段，將鉤端螺旋體外膜蛋白0mpLl、 LipL21、 LipL32 的優(yōu)勢抗原表位進(jìn)行串連，通過表達(dá)系統(tǒng)在體外進(jìn)行表達(dá)、純化、并制備鉤端 螺旋體菌的抗體檢測試劑盒。該試劑盒能特異性地檢測鉤端螺旋體菌的抗體， 能檢測不同血清型鉤體感染后造成的感染，可用于鉤端螺旋體病的臨床血清學(xué) 檢測及環(huán)境鉤端螺旋體菌的監(jiān)測。
本發(fā)明的方法包括以下步驟
1. 篩選鉤端螺旋體外膜蛋白0mpLl、 LipL21和LipL32的優(yōu)勢抗原表位；
2. 根據(jù)篩選的表位序列及表達(dá)系統(tǒng)的偏愛性，人工合成DNA序列并采用基因工 程手段獲得目的蛋白的編碼基因；
3. 將合成的基因片段克隆到表達(dá)載體中并構(gòu)建表達(dá)該目的蛋白的表達(dá)系統(tǒng)；
4. 根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)選用一定的純化方法提純目的蛋白并獲得高純度的產(chǎn)
n
5. 對上述(4)所獲得的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定具有22 kD分子量的特 定蛋白存在；對目標(biāo)蛋白進(jìn)行Western Blot分析，確定所獲得蛋白的免疫反應(yīng)性。
6. 以獲得的重組蛋白為抗原，構(gòu)建ELISA檢測試劑盒或試紙條，檢測目標(biāo)樣品 中抗鉤體IgG或IgM的存在情況而實(shí)現(xiàn)對鉤體病人的檢測。
其中，目標(biāo)樣品為人或動(dòng)物的血清、腦脊液等所有已經(jīng)脫離人體或動(dòng)物體 的體液樣品；該方法在體外進(jìn)行。實(shí)施例1. T細(xì)胞和B細(xì)胞優(yōu)勢抗原決定簇的篩選
通過 Propred HLA-DR 結(jié)合肽預(yù)測工具 ProPred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred/) 以及 EMBOSS 軟件包 (http:〃bioinfo. hku. hk/EMB0SS/)分別預(yù)測了鉤端螺旋體外膜蛋白OmpLl、 LipL21和LipL32的主要T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位。將預(yù)測的表位片段通過PCR 方法擴(kuò)增后插入到噬菌體M13KE中在PIII蛋白表面進(jìn)行展示，純化噬菌體蛋白 并對各篩選表位進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例2.包含多表位肽載體的構(gòu)建
根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏愛性，人工合成了各表位片段串連基因lmp，其中各 表位之間通過柔性肽段進(jìn)行連接，在合成基因的兩端分別含有BamHI、 BglII和 EcoRI位點(diǎn)，將合成的基因插入到pUC57載體中構(gòu)建p-l即載體，測序正確后通 過BamHI和EcoRI酶切分離Imp基因，并插入到BglII和EcoRI酶切的p-Imp 載體中構(gòu)建p-21mp載體，則各個(gè)表位在載體中重復(fù)兩次。通過BamHI和EcoRI 酶切分離21mp片斷插入到表達(dá)載體pET28a中，構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-21mp。 pET28a-21即重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后可產(chǎn)生大約5300 bp和600 bp 兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖l)，將酶切正確的陽性pET28a-21mp重組質(zhì)粒進(jìn)
行測序(表l)。
表l:合成基因的氨基酸序列
名稱核苷酸序列氨基酸序列
OTATATAGGAGTTGCTCCTAGAMAGCGATTCCTGCTYIGVAPRKAIPA
印ito pe2AGTTCTATCGTCATTCCTGCAGCCGTTGGTATCAAATT GAATGTTACTGAAGACGCTSSIVIPAAVGIKLNVTEDA
epito pe3GCATCTGATGTAGTGAAAAAAATGGTTGGGGAAACAGT AGAATCTGCAASD雨腿VGETVESA
epito pe4GATGCTCTCGTAGCAAAAGCTCAAGAGGTTTCCDALVAKAQEVS
epito pe5AAAAAACTTTTAGTAAGAGGTCTTTACAGAATTTCTTT CACTACCTACMACCAKKLLVRGLYRISFTTYKP
實(shí)施例3.工程菌pET28a-21mp/BL21的誘導(dǎo)表達(dá)將pET28a-21mp轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)中進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。 具體為挑取pET28a-21mp的單克隆接種到3ml的LB培養(yǎng)基中，37 °C， 220 rpm 震蕩過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)的菌液以1:100的比例重新接種到3 ml LB培養(yǎng)基中， 37 °C， 220 rpm震蕩培養(yǎng)3 h，加入終濃度為1 mM的IPTG， 37 °C ， 220 rpm 誘導(dǎo)4h，離心收集菌體沉淀；將沉淀重懸于1XPBS緩沖液中，進(jìn)行超聲波破 碎，4 。C離心后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，在約22kD處出現(xiàn)特 異性表達(dá)帶，與預(yù)期分子量吻合，且目的蛋白主要以可溶性形式存在。(圖2)。
實(shí)施例4.重組多表位肽的純化
將重組多表位肽在優(yōu)化條件下進(jìn)行大量表達(dá)，即將表達(dá)2LMP較高的大腸桿 菌菌株接種到含100 " g/ml卡那霉素的20 ml LB新鮮培養(yǎng)基中，37 °C ， 220 rpm 震蕩過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)的菌液以1:100的比例重新接種到1000 ml LB培養(yǎng)基中， 37 °C， 220 rpm震蕩培養(yǎng)3 h，加入終濃度為1 mM的IPTG， 37 °C， 220 rpm 誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體沉淀；將沉淀重懸于20 ml的NTA-0 buffer (20 mM Tris-HC1 (pH 7.9)， 500 mM NaCl， 10% Glycerol)中，進(jìn)行超聲波破碎，然后 離心收集上清；將上清與4ml提前用NTA-0buffer平衡的Ni-NTA樹脂在4 °C 輕輕混勻，然后加入到層析柱中；分別用NTA-0、 NTA-20、 NTA-60、 NTA_100、 NTA-IOO。 buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,9)， 500 mM NaCl，咪唑的濃度分別 為20 mM、 60 mM、 100 mM、 1000 mM)沖洗樹脂并收集流出液體；對收集液體透 析后進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖2)，根據(jù)電泳結(jié)果透析高目的蛋白含量的液體然后 80 t:保存。
實(shí)施例5.純化后2LMP的免疫活性
將純化的2LMP與鉤端螺旋體免疫兔血清進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果顯 示重組多表位肽與鉤端螺旋體免疫兔血清在約23 kD處有一特異性反應(yīng)條帶(圖3)。
實(shí)施例6. ELISA間接法檢測鉤端螺旋體菌IgM抗體
取待檢血清樣品1 1，加入已包被有融合多表位肽抗原的酶標(biāo)板中，37 °C 孵育30-60 miri，每塊板設(shè)三孔陰性對照，二孔陽性對照， 一孔空白對照。孵育 結(jié)束后，棄去板孔中的液體，用洗滌液洗板3-5次，扣干。加入抗人IgM酶標(biāo) 抗體，充分混勻，37 'C孵育30-60 min。同上洗板后，加入顯色液O. lml，輕拍混勻，37 。C避光顯色5-15min。每孔加入終止液一滴，輕拍混勻，用450 nm
波長酶標(biāo)儀測讀OD值，判定結(jié)果，見表2。
表2: 利用ELISA方法檢測鉤體病人血清中IgG和IgM抗體。
血清群樣品IgM (+/ -)IgG(+/-)
黃疸出血群5454/054/0
秋季群88/08/0
流感傷寒群2222/022/0
澳洲群18簡18/0
七日熱群1515/015/0
波摩那群2828/028/0
犬群1111/011/0
當(dāng)450nm波長測得的吸光值大于對照吸光值兩倍時(shí)，認(rèn)為該樣品為陽性(+ )。
實(shí)施例7. ELISA間接法檢測鉤端螺旋體菌IgG抗體
取待檢血清樣品1 ix 1，加入已包被有融合多表位肽抗原的酶標(biāo)板中，37 °C 孵育30-60 min，每塊板設(shè)三孔陰性對照，二孔陽性對照， 一孔空白對照。孵育 結(jié)束后，棄去板孔中的液體，用洗滌液洗板3-5次，扣干。加入抗人IgG酶標(biāo) 抗體，充分混勻，37 。C孵育30-60 min。同上洗板后，加入顯色液O. lml，輕 拍混勻，37 。C避光顯色5-15min。每孔加入終止液一滴，輕拍混勻，用450 nm 波長酶標(biāo)儀測讀OD值，判定結(jié)果，見表2。
實(shí)施例8:利用多表位肽抗原快速檢測抗鉤體抗體試紙條的設(shè)計(jì)
如圖4 (a)所示該試紙條包括一固定在塑料支架上的纖維素膜。頂端的陰 影部分為吸收墊，檢測條帶T (用實(shí)線表示)表示重組多表位抗原肽被固定的位 置，對照條帶C (用虛線表示)表示兔抗重組多表位肽血清(用V表示)。條帶下 方為混有金標(biāo)重組多表位肽(用星狀圖表示)的檢測血清，如果抗鉤體IgM抗 體(用^表示)存在的情況下，則與金標(biāo)重組多表位肽形成復(fù)合物使膠體金顆粒 顏色變化便可直接判斷檢測結(jié)果。左側(cè)的虛線箭頭表示檢測過程中樣本進(jìn)入的方向。
圖4 (b)為實(shí)際檢測效果圖。左側(cè)為沒有抗鉤體IgM抗體的檢測結(jié)果；右 側(cè)為有抗鉤體IgM抗體的檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1. 一種運(yùn)用重組多表位肽蛋白進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢測的方法。其特征在于，采用鉤端螺旋體外膜蛋白優(yōu)勢抗原決定簇的重組多表位肽為檢測抗原構(gòu)建試劑盒或試紙條，檢測鉤端螺旋體抗體IgM或IgG。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用重組多表位肽蛋白進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢測的方法，其特征在于，它包括以下步驟(1) 篩選鉤端螺旋體外膜蛋白OmpLl、 LipL21和LipL32的優(yōu)勢抗原表位；(2) 根據(jù)篩選的表位序列及表達(dá)系統(tǒng)的偏愛性，人工合成DNA序列并采用基因 工程手段獲得目的蛋白的編碼基因；(3) 將合成的基因片段克隆到表達(dá)載體中并構(gòu)建表達(dá)該目的蛋白的表達(dá)系統(tǒng)；(4) 根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)選用一定的純化方法提純目的蛋白并獲得高純度的# 口 廣叩？(5) 對所述步驟(4)獲得的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定具有22kD分 子量的特定蛋白存在；對目標(biāo)蛋白進(jìn)行Western Blot分析，確定所獲得 蛋白的免疫反應(yīng)性。(6) 以獲得的重組蛋白為抗原，構(gòu)建ELISA檢測試劑盒或試紙條，檢測目標(biāo)樣 品中抗鉤體IgG或IgM的存在情況而實(shí)現(xiàn)對鉤體病人的檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用重組多表位肽蛋白進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢 測的方法，其特征在于，所述的目標(biāo)樣品為人或動(dòng)物的血清、腦脊液等所有 已經(jīng)脫離人體或動(dòng)物體的體液樣品。
4. 權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用重組多表位肽蛋白進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢測的方 法，其特征在于，所述的用于鉤端螺旋體感染檢測的方法是在體外進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種運(yùn)用重組多表位肽蛋白進(jìn)行鉤端螺旋體感染檢測的方法，是將鉤端螺旋體主要外膜蛋白OmpL1、LipL21和LipL32的優(yōu)勢T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位串連后，亞克隆到表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)，表達(dá)菌的超聲裂解上清純化后包被微孔板，構(gòu)建抗體檢測ELISA試劑盒，同樣地將上述純化的重組抗原點(diǎn)樣NC膜上，構(gòu)建膠體金檢測試紙條。檢測抗體是鉤體病人血清中的IgG或IgM。本發(fā)明可用于檢測能在人類和其它動(dòng)物體內(nèi)引起疾病的鉤端螺旋體感染，包括具有獸醫(yī)學(xué)重要性的那些鉤端螺旋體的感染。
文檔編號G01N33/569GK101419236SQ200810120368
公開日2009年4月29日 申請日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者杰 嚴(yán), 林旭璦, 寅 陳 申請人:浙江大學(xué)