專利名稱：：糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種農(nóng)業(yè)
技術(shù)領(lǐng)域：
的檢測方法，具體是一種農(nóng)產(chǎn)品中吡蚜酮殘留量的檢測方法。吡蚜酮(pymetrozine)是一種新型的吡啶類殺蟲劑，作用方式獨特，無擊倒活性，具有"口針穿透阻塞效應(yīng)"?？捎糜诜乐未蟛糠滞崮亢οx，尤其是蚜蟲科、粉虱科、葉蟬科及飛虱科害蟲，適用于蔬菜、水稻、棉花、果樹等多種大田作物，持效期可達20天以上。吡蚜酮獨特的毒理學特性以及優(yōu)異的防治效果已經(jīng)引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。美國環(huán)保局已將吡蚜酮視為有機磷農(nóng)藥的替代品。然而，最近一些吡蚜酮對小鼠的研究結(jié)果顯示吡蚜酮可導致小鼠產(chǎn)生腫瘤，美國環(huán)保局將其歸為人類的可能致癌物。吡蚜酮的化學結(jié)構(gòu)式為化學名稱為(E)_4,5—二氫一6—甲基一4一(3—吡啶亞甲基胺)一l，2，4一三嗪一3(2H)_酮。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前有關(guān)吡蚜酮殘留量測定方法的文獻報道較少，Lehotay等在《JournalofAOACInternational(美國國際分析化學協(xié)會雜志，2005年第88期第595-614頁)上發(fā)表的"ValidationofaFastandEasyMethodfortheDeterminationofResiduesfrom229PesticidesinFruitsandVegetablesUsingGasandLiquidChromatographyandMassSpectrometricDetection"(—種用于果蔬中229種農(nóng)藥的氣質(zhì)和液質(zhì)快速檢測方法)，文獻中采用酶免疫分析法、氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用等方法測定了植物中吡蚜酮的殘留量，但這些方法都存在著一定的局限性，如測定方法的回收率低、使用儀器昂貴、容易受吡釾酮代謝物干擾等。目前有關(guān)糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法還未背景技見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，使其具有簡便、準確、快速、可靠的特點，對控制糧食和蔬菜中吡蚜酮的殘留具有重要的價值。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，包括以下步驟第一步，取樣取谷類、豆類和或蔬菜樣品，谷類和豆類樣品粉碎過篩；蔬菜取可食部分，輕輕擦去樣品表面的附著物，采用四分法，將其切碎，充分混勻，制成樣品，放入分裝容器中備用。所述取谷類、豆類或蔬菜樣品，所取重量等于或者大于1Kg。所述過篩是指過420um標準網(wǎng)篩。第二步，提取準確稱取上述樣品置于錐形瓶中，加入有機溶劑，經(jīng)震蕩、過濾、濃縮，凈化后備測。所述樣品置于錐形瓶，是指將10g20g樣品置于250mL錐形瓶。所述有機溶劑，是指乙腈、二氯甲垸、乙酸乙酯、甲苯、乙醇、辛醇、丙酮的一種或幾種混合液體。所述濃縮，是指用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將樣品在40°C—5(TC的范圍內(nèi)濃縮，濃縮近干，或者lmL2mL都可。第三步，標準溶液的配制稱取吡蚜酮標準品，用有機溶劑溶解定容，制成10mg/L的儲備液。將吡蚜酮標準儲備液稀釋，配置成5mg/L、lmg/L、0.5mg/L、0.lmg/L、0.05mg/L、0.01mg/L的標準工作液。待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，用系列標準溶液進樣，保留時間定性，以峰面積或峰高和標樣濃度制作標準曲線，然后對第二步收集的凈化樣品進行檢測，外標法定量。所述有機溶劑，是指乙腈、甲醇、正己烷、異丙醇、丙酮、四氯化碳的一種或幾種混合液體。所述儲備液，具體為稱取吡蚜酮標準品0.0100g，用有機溶劑溶解定容至100mL，制成10mg/L的儲備液。第四步，在第三步的基礎(chǔ)上進行液相色譜分析檢測。所述液相色譜分析檢測，其條件為色譜柱島津Shim-packVP-0DS色譜柱(貨號VP-0DS柱)，長150咖X內(nèi)徑4.6mm;流動相V(乙腈)V(水)二9585:5~15;流速0.6或1.0mL/min;檢測器波長299nm;柱溫40或20。C;進樣量20或10nL。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明用有機溶劑與水的混合液作為流動相，使用長150mmX內(nèi)徑4.6mm的VP-ODS液相色譜柱，采用紫外檢測器，對吡蚜酮進行液相色譜分析，能方便、快捷、準確地檢測出糧食和蔬菜中吡蚜酮的含量，其最小檢出量為1.OX10—1Qg，最低檢出濃度為0.005mg/kg。圖1為實施例一吡蚜酮標準色譜圖圖2為實施例二吡蚜酮標準色譜圖圖3為吡蚜酮在實施例一甘藍樣品中的色譜圖圖4為吡蚜酮在實施例二西蘭花樣品中的色譜圖圖5為本發(fā)明實施例一甘藍樣品空白色譜圖圖6為本發(fā)明實施例二西蘭花樣品空白色譜圖具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。本發(fā)明實施例實施的條件為儀器SCL-10AVP型液相色譜儀(配有SPD-10AVPUV檢測器，日本島津公司)，VP-0DS色譜柱(150ramX4.6mm，150L，日本島津公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52)。試劑吡蚜酮標準品(99.9%，德國Dr公司提供)，乙腈、二氯甲垸、乙酸乙酯(均為分析純)，無水硫酸鈉(用前40(TC烘4h)，弗羅里硅土(用前650。C活化3.5h，再加5%的去活水)，粉末活性炭(用前l(fā)l(TC烘lh，用酸浸泡，再用蒸餾水清洗直至pH達到67)。以下為實施例的具體實施過程實施例一甘藍中吡岈酮殘留量的HPLC檢測1.標準溶液的配制1.1標準儲備液的配制稱取吡蚜酮標準品O.OlOOg，用乙腈溶解定容至100mL，制成10mg/L的儲備液。1.2標準工作液的配制將吡岈酮標準儲備液稀釋，配置成5，1，0.5，0.1，0.05，0.01mg/L的標準工作液。2.樣品提取和凈化2.1提取四分法稱取甘藍樣品10g置于250mL錐形瓶中，加入100mL乙腈，震蕩10min，將震蕩后的甘藍殘渣和溶液一起用玻璃漏斗(底部塞脫脂棉，上面依次添加少量無水硫酸鈉和活性炭)過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(水浴溫度50°C)蒸發(fā)濃縮。將濃縮液移入加有NaOH的分液漏斗中，用二氯甲垸萃取，每次50mL，分4次進行，合并二氯甲烷萃取液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40。C濃縮近干。2.2凈化在玻璃層析柱(柱內(nèi)徑1.5cm，長20cm)最底層鋪入少量玻璃纖維，再自下而上依次填裝2cm厚無水硫酸鈉，10g弗羅里硅土，3cm厚無水硫酸鈉。先用乙酸乙酯淋洗液預淋洗層析柱，棄去前10mL淋出液，收集之后的凈化液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀4(TC濃縮近干，并用乙腈定容至5mL，搖勻，過0.45nm微孔濾膜，備測。3.色譜條件色譜柱島津Shim-packVP-ODS色譜柱，長150mmX內(nèi)徑4.6mm;流動相V(乙腈)V(水)=95:5;流速0.6mL/min;UV檢測器波長299nra;柱溫40°C;進樣量20uL。在上述條件下所得的標準色譜圖見圖1。據(jù)圖可知在上述檢測條件下吡蚜酮的保留時間為6.731min，峰形明顯，可據(jù)此來進行面積定量。4.標準曲線的建立采用面積定量，將吡蚜酮標準溶液濃度5rag/L，lmg/L，0.5mg/L，0.lmg/L，頁0.05mg/L，0.01mg/L作為橫坐標，峰面積為縱坐標，所得標準曲線回歸方程為y=241.31x+669478(R2=0.9989)，計算得出在上述條件下吡蚜酮的最小檢出量為1.OXl(Tg，最低檢出濃度為0.005mg/kg。5.計算方法I—CixlOOO一MxlOOO式中X為樣品中農(nóng)藥殘留量(mg/kg)C為被測樣品的濃度(ng/uL)V為試樣最后定容體積(mL)M為樣品質(zhì)量(g)6.回收率試驗對甘藍樣品進行吡蚜酮標準添加回收率試驗。結(jié)果見表l，0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg三個濃度的吡蚜酮平均添加回收率分別為95.09%，90.62%和91.01%，變異系數(shù)分別為0.38，L70和4.82。說明該方法的準確度和精密度符合殘留試驗準則要求。吡蚜酮在甘藍樣品中的色譜圖見圖3，目標檢測峰與臨近的干擾峰獲得了接近基線的分離，即可用峰面積法進行精確定量。圖5為未添加吡蚜酮的空白樣品對照圖，圖中可知樣品中吡蚜酮本底值為O，對本實驗無干擾。表l吡魅酮在甘藍中添加回收率的實驗結(jié)果添加水平回收率(％)變異系數(shù)(mg/kg)IIIIII平均值CV(%)0.0194.8595.5194.9195.090.380.189.3390.2092.3290.621.70186.3591.6395.0691.014.82實施例二西蘭花中吡蚜酮殘留量的HPLC檢測1.標準溶液的配制1.1標準儲備液的配制稱取吡蚜酮標準品O.OlOOg，用乙腈溶解定容至100mL，制成10mg/L的儲備液。1.2標準工作液的配制將吡蚜酮標準儲備液稀釋，配置成5，1，0.5，0.1，0.05，0.01mg/L的標準工作液。2.樣品提取和凈化4分法稱取西蘭花樣品10g置于250mL錐形瓶中，加入lOOmL乙腈，震蕩10min，將震蕩后的殘渣和溶液一起用玻璃漏斗(底部塞脫脂棉，上面依次添加少量無水硫酸鈉和活性炭)過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(水浴溫度5(TC)蒸發(fā)濃縮。將濃縮液移入加有NaOH的分液漏斗中，用二氯甲垸萃取，每次50mL，分4次進行，合并二氯甲垸萃取液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上4(TC濃縮近干后進行柱層析。層析柱長20cm，內(nèi)徑1.5cm，最底層鋪入少量玻璃纖維，再自下而上依次填裝2cm厚無水硫酸鈉，10g弗羅里硅土，3cm厚無水硫酸鈉。先用乙酸乙酯淋洗液預淋層析柱，棄去前10mL淋出液，然后倒入樣品濃縮液，收集凈化液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40。C濃縮近干，并用乙腈定容至5mL，搖勻，過0.45um微孔濾膜，待測。3.色譜條件色譜柱島津Shim-packVP-ODS色譜柱，長150mmX內(nèi)徑4.6;流動相V(乙腈)V(水)=85:15;流速1.OmL/min;UV檢測器波長299nm;柱溫2(TC;進樣量10nL。在上述條件下所得的標準色譜圖見圖2。由圖可知，在上述檢測條件下吡岈酮的保留時間為1.943min，峰形明顯。4.標準曲線的建立采用峰高定量，將吡岈酮標準溶液濃度5mg/L，lmg/L，0.5mg/L，0.lmg/L，0.05mg/L，0.01mg/L作為橫坐標，峰高為縱坐標，所得標準曲線回歸方程為y=17382x+411.4(R2=0.9999)，計算得出在上述條件下吡蚜酮的最小檢出量為1.0X10—ieg，最低檢出濃度為0.005mg/kg。5.計算方法I_C.FxlOOO—MxlOOO式中X為樣品中農(nóng)藥殘留量(mg/kg)C為被測樣品的濃度(ng/uL)V為試樣最后定容體積(mL)M為樣品質(zhì)量(g)6.回收率試驗對西蘭花樣品進行吡蚜酮標準添加回收率試驗。結(jié)果見表2，0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg三個濃度的吡蚜酮平均添加回收率分別為87.29%，93.60%和91.57%，變異系數(shù)分別為0.78，1.93和3.14。說明該方法的準確度和精密度符合殘留試驗準則要求。吡蚜酮在西蘭花樣品中的色譜圖見圖4，圖中可見，上述條件下，可采用峰高定量法。圖6為未添加吡蚜酮的空白樣品對照圖，圖中可見，樣品中吡蚜酮本底值為O，對本實驗無干擾。表2吡蚜酮在西蘭花中添加回收率的實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例三稻谷中吡蚜酮殘留量的HPLC檢測1.標準溶液的配制1.1標準儲備液的配制稱取吡蚜酮標準品O.OlOOg，用乙腈溶解定容至lOOmL，制成10mg/L的儲備液。1.2標準工作液的配制將吡蚜酮標準儲備液稀釋，配置成5，1，0.5，0.1，0.05，0.Olmg/L的標準工作液。2.樣品提取和凈化準確稱取10g粉碎后且過420um標準網(wǎng)篩的稻谷風干樣品于錐形瓶中，加入20mL蒸餾水充分潤濕稻谷樣品，再加入lOOmL乙腈后，放入勻漿機中勻漿2min，之后離心，保留上清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(水浴溫度5(TC)蒸發(fā)濃縮。將濃縮液移入加有NaOH的分液漏斗中，用二氯甲垸萃取，每次50mL，分4次進行，合并二氯甲烷萃取液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40。C濃縮近干后進行柱層析。層析柱長20cm，內(nèi)徑1.5cm，最底層鋪入少量玻璃纖維，再自下而上依次填裝2cm厚無水硫酸鈉，10g弗羅里硅土，3cm厚無水硫酸鈉。先用乙酸乙酯淋洗液預淋層析柱，棄去前10mL淋出液，然后倒入樣品濃縮液，收集凈化液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀4(TC濃縮近干，并用乙腈定容至5mL，搖勻，過0.45nm微孔濾膜，待測。3.色譜條件色譜柱島津Shim-packVP-0DS色譜柱，長150腿X內(nèi)徑4.6腿；流動相V(乙腈)V(水)=90:10;流速1.OmL/min;UV檢測器波長299nm;柱溫20。C;進樣量20uL。4.標準曲線的建立采用面積定量，將吡蚜酮標準溶液濃度5mg/L，lmg/L，0.5mg/L，0.lmg/L，0.05mg/L，0.Olmg/L作為橫坐標，峰高為縱坐標，所得標準曲線線性回歸方程為y=268312x+28589(R2=0.9995)，計算得出在上述條件下吡蚜酮的最小檢出量為1.OX1010g，最低檢出濃度為0.005mg/kg。5.計算方法I—C-KxlOOO—MxlOOO式中X為樣品中農(nóng)藥殘留量(mg/kg)C為被測樣品的濃度(ng/pL)V為試樣最后定容體積(mL)M為樣品質(zhì)量(g)6.回收率試驗對稻谷樣品進行吡蚜酮標準添加回收率試驗。結(jié)果見表3，0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg三個濃度的吡蚜酮平均添加回收率分別為91.71%，86.76%和95.65%，變異系數(shù)分別為1.69，1.55和0.76。說明該方法的準確度和精密度符合殘留試驗準則要求。表3吡蚜酮在稻谷中添加回收率的實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>吡蚜酮在稻谷中添加回收率的實驗結(jié)果權(quán)利要求1、一種糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，取樣取谷類、豆類或蔬菜樣品，谷類和豆類樣品粉碎過篩，蔬菜取可食部分，擦去樣品表面的附著物，采用四分法，將其切碎，充分混勻，制成樣品，放入分裝容器中備用；第二步，提取稱取上述樣品置于錐形瓶中，加入有機溶劑，經(jīng)震蕩、過濾、濃縮，凈化后備測；第三步，標準溶液的配制稱取吡蚜酮標準品，用有機溶劑溶解定容，制成10mg/L的儲備液，將吡蚜酮標準儲備液稀釋，配置成5mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L、0.05mg/L、0.01mg/L的標準工作液，待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，用系列標準溶液進樣，保留時間定性，以峰面積和標樣濃度制作標準曲線，然后對第二步收集的凈化樣品進行檢測，外標法定量；第四步，在第三步的基礎(chǔ)上進行液相色譜分析檢測。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，其特征是，第一步中，所述取谷類、豆類或蔬菜樣品，所取重量等于或者大于1Kg。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，其特征是，第一步中，所述過篩是指過420um標準網(wǎng)篩。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食和蔬菜中吡岈酮殘留量的檢測方法，其特征是，第二步中，所述樣品置于錐形瓶，是指將10g20g樣品置于250mL錐形瓶。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，其特征是，第二步中，所述有機溶劑，是指乙腈、二氯甲垸、乙酸乙酯、甲苯、乙醇、辛醇、丙酮的一種或幾種混合液體。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，其特征是，第二步中，所述濃縮，是指用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將樣品在40。C一5(TC的范圍內(nèi)濃縮，濃縮近干，或者濃縮到lmL2mL。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，其特征是，第三步中，所述有機溶劑，是指乙腈、甲醇、正己垸、異丙醇、丙酮、四氯化碳的一種或幾種混合液體。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，其特征是，第三步中，所述儲備液，具體為稱取吡蚜酮標準品0.0100g，用有機溶劑溶解定容至100mL，制成10mg/L的儲備液。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食和蔬菜中吡蚜酮殘留量的檢測方法，其特征是，第四步中，所述的液相色譜分析檢測，其條件為色譜柱島津Shim-packVP-ODS色譜柱，長150mmX內(nèi)徑4.6mm，流動相乙腈水體積比=9585:515，流速0.6mL/min或1.OmL/min，檢測器波長299nm，柱溫4(TC或20。C，進樣量20uL或lOyL。全文摘要本發(fā)明涉及一種農(nóng)業(yè)
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的農(nóng)產(chǎn)品中吡蚜酮殘留量的檢測方法，步驟為取樣、提取、凈化、對凈化樣品進行液相色譜分析檢測，外標法定量。本發(fā)明用有機溶劑與水的混合液作為流動相，使用長150mm×內(nèi)徑4.6mm的VP-ODS液相色譜柱，采用紫外檢測器，對吡蚜酮進行液相色譜分析檢測。其標準曲線制作方法為，稱取吡蚜酮標準品，用有機溶劑溶解定容，制成10mg/L的儲備液，將吡蚜酮標準儲備液稀釋，配置成5mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L、0.05mg/L、0.01mg/L的標準工作液，待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，用系列標準溶液進樣，保留時間定性，以峰面積或蜂高和標樣濃度制作標準曲線。文檔編號G01N30/00GK101231272SQ20081003222公開日2008年7月30日申請日期2008年1月3日優(yōu)先權(quán)日2008年1月3日發(fā)明者姚來峰,燕張,沈國清,璇胡申請人:上海交通大學