專利名稱：：葒草苷標準品的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種中藥提取物標準品的制備方法，特別是涉及葒草苷標準品的制備方法。
背景技術：
：本品葒草苷來源于毛茛科植物金蓮花，在竹葉、葒草等植物中均有分布。目前主要用于金蓮花、竹葉和葒草等藥材的質(zhì)量控制以及含有金蓮花、竹葉和葒草等藥材的中藥制劑的質(zhì)量控制。目前葒草苷標準品的制備方法存在收率低，成本高并且純度不夠等缺點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于公開葒草苷標準品的制備方法。本發(fā)明所述的葒草苷標準品是通過如下步驟制備的步驟I:金蓮花藥材，加相當于生藥重量6-10倍量的50-80%乙醇回流提取2-4次，每次1-3小時，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至浸膏；步驟II:浸膏用常規(guī)溶劑溶解，經(jīng)過硅膠柱層析，60-80:20-40:5-15的氯仿甲醇水的下層溶液洗脫，洗脫溶液采用薄層色譜檢測，合并含有葒草苷的洗脫液，得純度70-80%葒草苷粗品；步驟III:葒草苷粗品加70-100%甲醇溶解，經(jīng)羥丙基葡聚糖凝膠(S印hadexLH-20)柱層析，70-100%甲醇洗脫；步驟IV:洗脫液用HPLC檢測純度，合并純度大于98%的洗脫液，即得葒草苷。上述的葒草苷標準品制備中TLC系統(tǒng)檢測，展開溶劑為60-70:25-45:5-15的氯仿甲醇水的下層溶液展開。本發(fā)明所述的葒草苷標準品制備優(yōu)選如下方法步驟I:金蓮花藥材，加生藥按重量比計8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至浸膏；步驟II:浸膏用常規(guī)溶溶解劑，經(jīng)過硅膠柱層析，70:30:10的氯仿甲醇水的下層溶液洗脫，收集含有葒草苷的洗脫液，洗脫液采用薄層色譜檢測(TLC)檢測，展開溶劑為65:35:IO的氯仿甲醇水的下層溶液展開,合并含有葒草苷的洗脫液，得純度70-80%葒草苷粗品；步驟m:葒草苷粗品加80%甲醇溶解，S印hadexLH-20柱層析，80%甲醇洗脫；步驟IV:洗脫液用HPLC檢測純度，流動相為乙腈-0.1%磷酸水為12:88，檢測波長350nm，合并純度大于98%的洗脫液，即得葒草苷標準品。所述浸膏可以用現(xiàn)有技術中公開的溶劑溶解，如甲醇，然后干法上樣。本發(fā)明公開葒草苷標準品的制備方法具有如下特點(1)工藝簡單，成本低廉該標準品的制備首先采用50%80%濃度間的乙醇回流提取，溶劑經(jīng)減壓回收以后，得浸膏，上硅膠柱色譜層析，以不同比例的氯仿-甲醇-水下層溶劑系統(tǒng)為洗脫劑，并采用TLC檢測，合并含有葒草苷的洗脫液，得葒草苷粗品；經(jīng)反復試驗，選用硅膠柱色譜層析能夠很好的去除色素和其它雜質(zhì)，得到葒草苷粗品；在實驗過程中，如對比采用丙酮-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫劑，洗脫效果不好，洗脫流程長，且乙酸乙酯極性較小，不利于葒草苷的洗脫，且容易引進其它極性較小的雜質(zhì)；曾選用乙酸乙酯-甲醇(9:1)等為洗脫劑，洗脫流程長，得到的葒草苷粗品純度低(約6070%)且去除色素效果不好；選用氯仿-甲醇-水(60-80:20-40:5-15)下層溶劑為洗脫劑，洗脫流程短，去除色素和其它雜質(zhì)的效果好，葒草苷粗品的純度能達到7080%;葒草苷粗品的進一步純化；對硅膠柱色譜等進行考察，發(fā)現(xiàn)不但流程長，浪費試劑，且由于硅膠柱色譜的特性，吸附性較大，得到的收率低，同時去除色素效果不好，含有其它雜質(zhì)，葒草苷標準品的純度達不到98.0%;采用S印hadexLH-20柱色譜進行純化，由于以80%甲醇為洗脫劑，可回收利用且流程短，幾乎不產(chǎn)生吸附，收率較高，同時去除色素和其它雜質(zhì)的效果好，一般經(jīng)一次S印hadexLH-20柱色譜純化，能得到7585%的葒草苷標準品。(2)收率高本法制得的葒草苷標準品收率在0.050.1%之間，即平均1000g金蓮花藥材即可制得500mg葒草苷標準品，獲得很高的收率；(3)穩(wěn)定性好本法制得的葒草苷標準品的穩(wěn)定性很好，經(jīng)試驗，在粉末狀態(tài)，在兩年內(nèi)穩(wěn)定性良好；在溶液狀態(tài)，在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好；(4)標準品純度純度在98.0%以上；下述實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明；實驗例1S印hadexLH-20柱應用的實驗純化方法一般有硅膠柱層析純化法、S印hadexLH-20柱純化法和制備液相純化法等。曾采用過硅膠柱層析純化法，選用氯仿-甲醇-水(65:35:10)下層溶液為洗脫劑，由于硅膠柱吸附作用較強，葒草苷收率較低；且采用大量有機溶劑進行洗脫，不能回收使用，成本較高；另外純化得到的葒草苷純度有時不夠98.0%，需進行進一步純化。制備液相純化法費時且成本高，一般不適用于大量標準品的制備。S印hadexLH-20柱純化法，以80%甲醇為洗脫溶劑，洗脫溶劑可回收使用，洗脫流程很短，且沒有死吸附，收率較高，得到的葒草苷標準品的純度也較高，一般都能夠達到98.0%。結果見表l。表l項目硅膠柱層析制備液相S印hadexLH-20柱純化流程長長短成本高很高低收率(％)<0.050.05-0.10.05-0.1純度(％)<98.0》98.0采用S印hadexLH-20柱進行純化，曾采用氯仿-甲醇(1:1)系統(tǒng)進行洗脫，分離效果不好，葒草苷標準品純度不是很高，大于98.0%純度的洗脫液較少，并且成本較高，說明氯仿-甲醇系統(tǒng)不適用。還曾選擇40-60%甲醇為洗脫溶劑進行洗脫，雜質(zhì)與葒草苷的分離效果不好，有時交叉較嚴重，標準品的純度不高，還需進行純化。后以80%甲醇為洗脫溶劑進行洗脫，雜質(zhì)與葒草苷的分離效果很好，葒草苷純度較高，純度一般均大于98.0%,收率較高，成本很低。經(jīng)過篩選實驗，說明80%甲醇為洗脫溶劑效果很好，成本很低且流程短，目前還沒有應用S印hadexLH-20柱進行純化的文獻報道。實驗例2硅膠柱、S印hadexLH-20柱結合與硅膠柱、硅膠柱結合效果的對比實驗在葒草苷標準品的制備過程中，我們曾選用硅膠柱與硅膠柱結合的方法，結果實驗流程很長，成本很高，并且收率很低，標準品純度低，往往需再次純化；硅膠柱與S印hadexLH-20柱結合，結果實驗流程短，溶劑可回收利用，成本低，并且收率高，標準品純度高。結果見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>下述實施例均能夠實現(xiàn)上述實驗例所述的效果具體實施例方式實施例l:葒草苷制備方法金蓮花藥材，加生藥10倍量50%乙醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至浸膏；該浸膏用甲醇溶解，干法上樣，經(jīng)過硅膠柱層析，70:30:10氯仿甲醇水的下層溶液為洗脫劑，洗脫，TLC檢測，65:30:10氯仿甲醇水的下層溶液為展開劑，展開，收集含有葒草苷的洗脫液，加80%甲醇溶解，S印hadexLH-20柱層析，80%甲醇洗脫；洗脫液用HPLC檢測純度，流動相為12:88的乙腈-0.1%磷酸水，檢測波長350mn合并純度大于98^的洗脫液，即得葒草苷；實施例2:葒草苷制備方法金蓮花藥材，加生藥7倍量60%乙醇回流提取2次，每次3小時，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至稀膏狀；浸膏經(jīng)過硅膠柱層析，80:22:5的氯仿甲醇水的下層溶液為洗脫劑，洗脫，TLC檢測，70:30:10的氯仿甲醇水的下層溶液為展開劑展開，收集含有葒草苷的洗脫液，加70%甲醇溶解，S印hadexLH-20柱層析，75%甲醇洗脫；洗脫洗脫液用HPLC檢測純度，流動相乙腈-0.1%磷酸水為14:82,檢測波長350nm,合并純度大于98%的洗脫液，即得葒草苷。實施例3:葒草苷制備方法金蓮花藥材，加生藥6倍量60%乙醇回流提取4次，每次1小時，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至稀膏狀；浸膏經(jīng)過硅膠柱層析，65:35:10的氯仿甲醇水的下層溶液為洗脫劑，洗脫，TLC檢測，60:4(hl0的氯仿:甲醇水的下層溶液為展開劑展開，收集含有葒草苷的洗脫液，加甲醇溶解，S印hadexLH-20柱層析，甲醇洗脫；洗脫洗脫液用HPLC檢測純度，流動相乙腈-0.1%磷酸水為16:82，檢測波長350nm，合并純度大于98%的洗脫液，即得葒草苷。權利要求1、一種葒草苷標準品的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟步驟I金蓮花藥材，加相當于生藥重量6-10倍量的50-80％乙醇回流提取2-4次，每次1-3小時，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至浸膏；步驟II浸膏用常規(guī)溶劑溶解，經(jīng)過硅膠柱層析，60-8020-405-15的氯仿甲醇水的下層溶液洗脫，洗脫溶液采用薄層色譜檢測，合并含有葒草苷的洗脫液，得純度70-80％葒草苷粗品；步驟III葒草苷粗品加70-100％甲醇溶解，SephadexLH-20柱層析，70-100％甲醇洗脫；步驟IV洗脫液用HPLC檢測純度，合并純度大于98％的洗脫液，即得葒草苷。2、如權利要求1所述的制備方法，其特征在于該方法步驟II中的薄層色譜檢測展開溶劑為氯仿甲醇水60-70:25-45:5-15的下層溶液。3、如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟IV中的HPLC檢測純度時流動相10-20:80-90的乙腈-0.1%磷酸水，檢測波長350nm。4、如權利要求1_3所述的任意一種制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟步驟I:金蓮花藥材，加生藥按重量比計8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至浸膏；步驟II:浸膏用常規(guī)溶劑溶解，經(jīng)過硅膠柱層析，70:30:10的氯仿甲醇水的下層溶液洗脫，收集含有葒草苷的洗脫液，洗脫液采用TLC系統(tǒng)檢測，展開溶劑為65:35:10的氯仿甲醇水的下層溶液，合并含有葒草苷的洗脫液，得純度70-80%葒草苷粗品；步驟m:葒草苷粗品加80%甲醇溶解，S印hadexLH-20柱層析，80%甲醇洗脫；步驟IV:洗脫液用HPLC檢測純度，流動相為乙腈-0.1%磷酸水為12:88,檢測波長350nm,合并純度大于98%的洗脫液，即得葒草苷標準品。全文摘要本發(fā)明公開了一種葒草苷標準品的制備方法，該方法包括如下步驟步驟I金蓮花藥材，加50-80％乙醇回流提取，減壓回收乙醇并濃縮至膏狀；步驟II浸膏經(jīng)過硅膠柱層析，洗脫，收集含有葒草苷的洗脫液；洗脫液采用薄層色譜檢測，合并含有葒草苷的洗脫液，得純度70-80％葒草苷粗品。步驟III葒草苷粗品加70-100％甲醇溶解，SephadexLH-20柱層析，70-100％甲醇洗脫；步驟IVSephadexLH-20洗脫液用HPLC檢測純度，合并純度大于98％的洗脫液，即得葒草苷；本方法收率高、穩(wěn)定性好。文檔編號G01N1/34GK101387586SQ200710121800公開日2009年3月18日申請日期2007年9月14日優(yōu)先權日2007年9月14日發(fā)明者周長奎,張安靜,黃澤奇申請人:黃澤奇