專利名稱：一種蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)酶解的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解的方法。
背景技術(shù)：
隨著大規(guī)模生物基因組測(cè)序工作的完成，人類已經(jīng)進(jìn)入了蛋白質(zhì)組時(shí)代。目前在蛋白質(zhì)組研究中，質(zhì)譜(MS)技術(shù)是最核心的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(Cánovas F M，ElianeD G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P and Rossignol M.Plant proteome analysis.Proteomics，2004，4285-298；Chen S and Harmon A C.Advances in plantproteomics.Proteomics，2006，65504-5516)。根據(jù)離子化方法的不同，質(zhì)譜主要分為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜(Matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight，MALDI TOF)和電噴霧電離飛行質(zhì)譜(Electrospray ionization time-of-flight，ESI-TOF)兩大類型(Cánovas F M，Eliane D G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P and Rossignol M.Plant proteomeanalysis.Proteomics，2004，4285-298)。通常是通過(guò)雙向電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離，切取目標(biāo)蛋白點(diǎn)，用胰蛋白酶(trypsin)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fingerprinting，PMF)，最終既可以直接根據(jù)PMF數(shù)據(jù)搜庫(kù)鑒定出目標(biāo)蛋白，也可以進(jìn)一步通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜獲得部分肽段序列后搜庫(kù)，得到更為可靠的鑒定結(jié)果(Cánovas F M，El iane D G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P andRossignol M.Plant proteome analysis.Proteomics，2004，4285-298；RossignolM，Peltier J B，Mock H P，Matros A，Maldonado A M，Jorrin J V.Plant proteomeanalysisA 2004-2006 update.Proteomics，2006，65529-5548)。
無(wú)論哪種質(zhì)譜鑒定技術(shù)，蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解都是至關(guān)重要的一步。目標(biāo)蛋白酶解是否完全、酶切位點(diǎn)是否特異、酶切片斷數(shù)量(peptide number)的多少、序列覆蓋率(sequence coverage)的高低，以及酶自切程度的高低、信噪比的強(qiáng)弱等，都會(huì)直接影響搜庫(kù)的結(jié)果和蛋白鑒定的成功率。雖然隨著各種先進(jìn)的質(zhì)譜儀器的出現(xiàn)，蛋白鑒定的成功率已經(jīng)大大提高，但儀器的進(jìn)步畢竟還沒(méi)有到達(dá)不需要進(jìn)行膠內(nèi)酶解的程度，最終要得到可信度高、重復(fù)性好的蛋白鑒定結(jié)果，在很大程度上仍然依賴于選用合適的膠內(nèi)酶解方法(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and VincentR.An optimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)。
許多酶解方法都可以用在質(zhì)譜研究中，也取得了一定的效果，但均存在一定不足(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized proteinin-gel digest method for reliable proteome characterization byMALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemi stry，2005，34685-89)。加上目前質(zhì)譜鑒定技術(shù)的成本還是非常高，每次實(shí)驗(yàn)都去花費(fèi)大量時(shí)間和資金去比較摸索不同酶解方法，對(duì)于小規(guī)模進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，代價(jià)還是太高。因此，摸索一種簡(jiǎn)便易行、效果理想的酶解方法就十分必要。
較早的膠內(nèi)酶解方法是Rosenfeld等人在Analytic Biochemistry雜志上報(bào)道的(Rosenfeld J，Capdevielle J，Guillemont J C and Ferrara P.In-gel digestionof proteins for internal sequence analysis after one-or two-dimensional gelelectrophoresis.Analytical Biochemistry，1992，203173-179)；隨后，又有了幾種優(yōu)化改進(jìn)后的方法(Hellman U，Wernstedt C，Gonez J and Hel din C H.Improvement of an″In-Gel″Digestion Procedure for the Micropreparation ofInternal Protein Fragments for Amino Acid Sequencing.AnalyticalBiochemistry，1995，224451-455；Rachel R，Tracy I S，Charles M，JosephA L and Philip C A.Mass Spectrometry of Proteins Directly from PolyacrylamideGels.Anal Chem，1996，68(11)1910-1917；Alan D，David C and Liang L.ProteinConcentration and Enzyme Digestion on Microbeads for MALDI-TOF Peptide MassMapping of Proteins from Dilute Solutions.Anal Chem，2000，72(14)3355-3362；Volker E，Konrad B，Christine L，Hans L and Eckhard N.Improvements in Protein Identification by MALDI-TOF-MS Peptide Mapping.AnalChem，2000，72(13)2741-2750；Vukic S and Jasminka G Z.Improvement ofan in-gel tryptic digestion method for matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mapping byuse of volatile solubilizing agents.Proteomics，2001，11364-1367)。雖然這些方法已經(jīng)被成功應(yīng)用在質(zhì)譜研究中，但均存在諸如酶解不完全、肽段復(fù)性效率低等各種不足(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.Anoptimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)。最近(2005年)，Kumarathasan等人經(jīng)過(guò)系統(tǒng)性研究，報(bào)道了一種改進(jìn)的膠內(nèi)酶解方法(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)，有效提高了蛋白鑒定的成功率，質(zhì)譜鑒定的靈敏度較常規(guī)方法提高了6-10倍(為敘述方便，以下將該酶解方法簡(jiǎn)稱為K法)。
雖然K法比常規(guī)酶解方法大大提高了蛋白鑒定可信度和成功率，但該方法存在幾個(gè)明顯不足。為了提高酶切位點(diǎn)的特意性，該方法將最終酶解的pH值調(diào)節(jié)為7.0，從而有效避免了酶的錯(cuò)切。但是，牛胰蛋白酶(Trypsin)是一種堿性的酶，在pH7.5-9.0時(shí)具有最高的酶切特異性(詳見Roche公司產(chǎn)品說(shuō)明書)。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值到中性來(lái)提高酶切特異性，是以降低Trypsin酶的活性和特異性為代價(jià)的。因此，Kumarathasan等人是通過(guò)加大酶量來(lái)進(jìn)行彌補(bǔ)。每個(gè)蛋白點(diǎn)用的酶量達(dá)到500ng(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimizedprotein in-gel digest method for reliable proteome characterization byMALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)，而通常有50ng就足夠了。加大酶量確實(shí)可以提高酶切效果，但加入過(guò)量的胰蛋白酶，在造成酶的浪費(fèi)、提高成本(Roche公司的Trypsin價(jià)格昂貴)的同時(shí)，極易引起酶的自切和錯(cuò)切，為后面質(zhì)譜鑒定時(shí)如何消除酶自切峰和其它雜峰造成了很大的困難。另外，該方法還加大了最后肽段抽提的強(qiáng)度，通過(guò)逐步提高抽提液中乙腈(ACN)的濃度，可以獲得更好的抽提效果(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P andVincent R.An optimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)。但是，在獲得盡可能多的肽段的同時(shí)，也將膠內(nèi)的雜質(zhì)一起抽提出來(lái)，從而嚴(yán)重干擾質(zhì)譜鑒定時(shí)蛋白樣品有效離子化過(guò)程，造成丟峰。因此采用該方法進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，同樣存在酶解不充分、肽段丟失嚴(yán)重、酶消耗量大、操作繁瑣等不足，最終數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的結(jié)果也不是太理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)酶解的方法。
本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)酶解的方法，包括下述步驟1)將含有目標(biāo)蛋白的凝膠用超純水洗滌；將凝膠脫水，干燥；2)將干燥后的凝膠用酸化過(guò)的胰蛋白酶工作液浸泡0.5-1.5h后，吸去多余酶工作液；所述酸化過(guò)的胰蛋白酶工作液是用80-120mM鹽酸溶解胰蛋白酶，酸化8-12分鐘，再用NH4HCO3將pH值調(diào)節(jié)至8.0-9.0得到的溶液；
3)加入含有Ca2+的緩沖液，37℃酶解14-18hr，去除凝膠得到蛋白酶解液。
步驟2)中所述鹽酸的濃度為100mM；所述NH4HCO3的濃度為50mM；所述100mM鹽酸溶解胰蛋白酶后的酶濃度為0.08-0.12μg/μl，優(yōu)選為0.1μg/μl；所述胰蛋白酶工作液的胰蛋白酶濃度為8-12ng/μl，優(yōu)選為10ng/μl。
所述步驟1)中，超純水的用量為50-150μl/50μg含蛋白凝膠，優(yōu)選為100μl/50μg含蛋白凝膠，洗滌時(shí)間為15-45min，優(yōu)選為30min；洗滌次數(shù)為2次或2次以上，優(yōu)選為2次。
所述步驟1)中還包括洗滌后，用脫色液脫去凝膠中考馬斯亮藍(lán)顏色的步驟；所述脫色液為含有質(zhì)量百分含量為45-55％乙腈和質(zhì)量百分含量為0.356-0.435％NH4HCO3，pH值為8.0-9.0的水溶液。所述脫色液優(yōu)選為含有質(zhì)量百分含量為50％乙腈和質(zhì)量百分含量為0.395％NH4HCO3，pH值為8.0-9.0的水溶液。
所述步驟1)中用乙腈浸泡脫水。
所述步驟3)中的含有Ca2+的緩沖液為含有0.8-1.2mM CaCl2和20-30mMNH4HCO3，pH值為8.0-9.0的溶液。
所述含有Ca2+的緩沖液優(yōu)選為含有1mM CaCl2和25m MNH4HCO3，pH值為8.5的溶液。
本發(fā)明的方法是一種適合于質(zhì)譜分析的簡(jiǎn)化的蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解方法。本發(fā)明的方法，首先，加大了凝膠洗滌強(qiáng)度(每50μg蛋白凝膠改用80-120μl超純水洗兩次，每次半個(gè)小時(shí))，可以有效去除雜質(zhì)和部分鹽離子；其次，增加酶酸化處理的步驟(用100mM鹽酸酸化10分鐘)，有效地提高了胰蛋白酶的酶解活性；同時(shí)，在預(yù)酶解時(shí)免除了加入CaCL2的步驟(Ca2+對(duì)于Trypsin的活性有重要作用)，并吸去多余的酶液，可以有效避免在還沒(méi)有正式進(jìn)行酶解之前Trypsin的自切作用。本發(fā)明的方法得到的酶解液，可以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，不但節(jié)省了肽段抽提和真空干燥等繁瑣的步驟，而且可以較好地解決真空干燥之后肽段難于溶解的難題。
以鹽角草Rubisco和BSA為研究材料的實(shí)驗(yàn)表明，利用K法和本發(fā)明簡(jiǎn)化法酶解BSA和Rubisco蛋白，用MALDI TOF分析酶解產(chǎn)物，最終通過(guò)Mascot Distiller軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，都能購(gòu)獲得很好的鑒定結(jié)果，得分和序列覆蓋率都很高(表1)，說(shuō)明這兩種酶解方法都可以用在質(zhì)譜研究中。
本發(fā)明簡(jiǎn)化的膠內(nèi)酶解方法與k法得到的MALDI TOF數(shù)據(jù)最終搜庫(kù)結(jié)果進(jìn)行綜合比較，本發(fā)明簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解方法比K法得到的結(jié)果更為可信。首先，本發(fā)明簡(jiǎn)化法得到的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得分高。用K法得到的Rubisco蛋白和BSA得分分別為104分(圖1D)和117分(圖2D)，而本發(fā)明簡(jiǎn)化法得分分別為117分(圖1E)和148分(圖2E)(表1)。其次，本發(fā)明簡(jiǎn)化法得到的PMF圖譜信息量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于K法。用本發(fā)明簡(jiǎn)化法酶解，分別可以得到53條(圖1C)和70條總肽段(圖2C)，而用K法，分別得到得49條(圖1B)和33條肽段(圖2B)。另外，本發(fā)明簡(jiǎn)化法可以明顯提高鑒定蛋白的序列覆蓋率。在進(jìn)行Rubisco蛋白和BSA質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明簡(jiǎn)化法酶解產(chǎn)物中，分別有16條和23條肽段能夠和數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列匹配得上，覆蓋率高達(dá)41％和37％。利用K法進(jìn)行酶解，最終得不到這么高的序列覆蓋率(表1)。
表1.不同膠內(nèi)酶解方法得到的質(zhì)譜信息的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果比較

本發(fā)明的方法在降低操作難度、簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟、降低成本的同時(shí)，能夠有效提高了酶解效率，獲得更多肽段信息，得到更高的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索分值，顯著提高序列覆蓋率，最終取得了更好的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。因此，本發(fā)明的方法具有質(zhì)譜兼容性，能夠有效地減少蛋白質(zhì)酶解后肽段的損失，得到更為可靠的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，可作為一種效果好、穩(wěn)定的膠內(nèi)酶解方法，應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。


圖1A為鹽角草Rubisco蛋白雙向電泳分離結(jié)果圖1B為用K法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質(zhì)譜1C用本發(fā)明膠內(nèi)酶解法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質(zhì)譜1D為用K法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的NCBI搜庫(kù)結(jié)果圖1E為用本發(fā)明膠內(nèi)酶解法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的NCBI搜庫(kù)結(jié)果圖2A為BSA單向電泳分離結(jié)果圖2B為用K法酶解BSA后獲得的質(zhì)譜2C為用本發(fā)明簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解法酶解BSA后獲得的質(zhì)譜2D為用K法酶解BSA后獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的NCBI搜庫(kù)結(jié)果圖2E為用本發(fā)明簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解法酶解BSA后獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的NCBI搜庫(kù)結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
下述實(shí)施例中以鹽角草Rubisco蛋白和BSA為研究材料，系統(tǒng)地比較了本發(fā)明蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)化的膠內(nèi)酶解法(簡(jiǎn)化法)和最新報(bào)道的酶解方法(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized protein in-gel digestmethod for reliable proteome characterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemi stry，2005，34685-89；以下簡(jiǎn)稱K法)的質(zhì)譜鑒定效果。
所用蛋白材料鹽角草Rubisco蛋白提取自溫室種植的鹽角草(Salicorniaeuropaea)，鹽角草的培養(yǎng)方法為種子萌發(fā)后，用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，每3天1次，澆透。一個(gè)月后取材，用液氮研磨后置-80℃保存。
牛血清蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。
下述實(shí)施例中所用的試劑胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)自瑞典Roche公司(商品目錄號(hào)Cat.No.11418 033 001)，為經(jīng)過(guò)修飾的質(zhì)譜測(cè)序級(jí)產(chǎn)品，常規(guī)分析純藥品購(gòu)自北京化工廠；所用到的其它試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自Amersham公司(Amersham Biosciences，Sweden)，雙向電泳及質(zhì)譜分析中所用到的水均為超純滅菌水。
在利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白時(shí)，體現(xiàn)最終鑒定結(jié)果好壞的最為關(guān)鍵的指標(biāo)就是搜庫(kù)得分高低，分值越高，說(shuō)明鑒定結(jié)果越可靠，蛋白鑒定的可信度就越高(RossignolM，Peltier J B，Mock H P，Matros A，Maldonado A M，Jorrin J V.Plant proteomeanalysisA 2004-2006 update.Proteomics，2006，65529-5548)。在Mascot搜索中，通常軟件認(rèn)為最終搜庫(kù)得分大于67分時(shí)，則可信度達(dá)到95％以上，鑒定的蛋白是可信的。體現(xiàn)蛋白鑒定結(jié)果好壞的另外一個(gè)參數(shù)是序列覆蓋率(SequencingCoverage，SC)，序列覆蓋率越高，說(shuō)明酶解產(chǎn)物中包含的目標(biāo)蛋白的肽段序列越多，鑒定結(jié)果當(dāng)然就越可靠。此外，所獲得的肽段總數(shù)與能夠匹配得上得肽段得數(shù)目也是重要的參考因素，通常肽段總數(shù)越多，能配對(duì)的肽段數(shù)量越大，結(jié)果越可信。
下面對(duì)本發(fā)明的簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解方法利用上述指標(biāo)進(jìn)行效果驗(yàn)證實(shí)施例1、簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解方法酶解鹽角草Rubisco蛋白及其效果驗(yàn)證在綠色植物中，Rubisco蛋白(ribμlose-1，5-bisphospatecarboxylase/oxygenase)含量非常豐富，可以達(dá)到可溶性總蛋白的50％以上，并且不同植物的Rubisco蛋白具有很高的保守性(Rossignol M，Peltier J B，Mock H P，Matros A，Maldonado A M，JorrinJ V.Plant proteome analysisA 2004-2006update.Proteomics，2006，65529-5548)。在質(zhì)譜研究中，通常用Rubisco蛋白來(lái)檢測(cè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件是否適合。
1、蛋白質(zhì)電泳及目標(biāo)蛋白點(diǎn)的切取按照Saravanan和Rose的改進(jìn)酚抽法(Saravanan R S and Rose J C.A criticalevaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysisof recalcitrant plant tissues.Proteomics，2004，42522-2532)提取鹽角草地上部分(shoot)總蛋白，按Bradford方法定量蛋白質(zhì)(Bradford M M.A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem，1976，72248-254)。取700μg鹽角草地上部分總蛋白，進(jìn)行雙向電泳分離，鹽角草總蛋白雙向電泳具體操作按照Amersham公司雙向電泳說(shuō)明書進(jìn)行。雙向電泳(2-DE)結(jié)果顯示，鹽角草地上部分總蛋白中，Rubisco蛋白大亞基含量同樣非常高(圖1A中箭頭所示)。因此，用它來(lái)摸索酶解以及進(jìn)行質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)庫(kù)分析等條件。小心切取含量最豐富的蛋白點(diǎn)(Rubisco)，平均分成100份，則每份中含有約5μg Rubisco蛋白。將凝膠樣品置于干凈的1.5毫升離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解方法酶解蛋白將步驟1得到的-80℃保存的含有目標(biāo)蛋白點(diǎn)的凝膠中的一份約5μg Rubisco蛋白的樣品，置室溫解凍10min，平均分成5等份，每份蛋白含量為1μg Rubisco蛋白(含該蛋白的凝膠為50ug)，取兩份，分別用本發(fā)明的簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解方法和常規(guī)膠內(nèi)酶解方法。常規(guī)膠內(nèi)酶解方法按照Kumarathasan等人((Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized protein in-gel digestmethod for reliable proteome characterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)的方法進(jìn)行(簡(jiǎn)稱K法)。
本發(fā)明簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解方法，具體操作步驟如下(1)洗滌將有1μg Rubisco蛋白的凝膠(凝膠為50ug)置于干凈的1.5毫升離心管中，加入100μl超純水(ddH2O)，輕輕混勻30min，瞬時(shí)離心(室溫，1000g，1min)，棄上清。重復(fù)該步驟一次。
(2)脫色步驟(1)洗滌過(guò)的凝膠，用50μl脫色液(pH為8.5，含有質(zhì)量百分含量為50％乙腈(ACN)和質(zhì)量百分含量為0.395％NH4HCO3的水溶液)脫色兩次，每次30min，期間混勻3到5次。若顏色脫不盡，可以再脫色一次，直到考馬斯亮藍(lán)顏色脫盡為止，然后離心(室溫，1000g，1min)，棄上清。
(3)脫水干燥在裝有步驟(2)脫色過(guò)的凝膠的離心管中，加入50μl乙腈(ACN)，置室溫5min，離心(室溫，1000g，1min)后棄上清。重復(fù)一次。在超凈臺(tái)中微風(fēng)吹干約1hr，讓凝膠充分干燥。
(4)酶工作液的配制向胰蛋白酶(Trypsin)干粉(Roche公司修飾測(cè)序級(jí)產(chǎn)品)加入100mM鹽酸，使酶的終濃度為0.1μg/μl，常溫酸化10分鐘，得到Trypsin原液。分裝成20μl/管，-20℃可以儲(chǔ)存一個(gè)月。使用之前再向原液中加入9倍體積的50mM NH4HCO3(pH 8.5)，混勻即得Trypsin酶工作液(酶終濃度為10ng/μl)。
(5)預(yù)酶解向干燥好的凝膠中加入10μl步驟(4)制備的Trypsin酶工作液(10ng/μl)，4℃放置1h，使酶液充分浸入膠粒中。不用離心，吸去多余的酶液。
(6)酶解加入8μl酶緩沖液(含有1mM CaCL2和25mM NH4HCO3，pH為8.5的溶液)，此時(shí)酶解反應(yīng)體系的pH為8.5，37℃水浴酶解16hr。
(7)酶解完成后，在常溫下5000g離心5min，小心吸取上清，將上清轉(zhuǎn)移到PCR薄壁管中，直接利用上清進(jìn)行質(zhì)譜分析。
3、酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索利用Bruker公司的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI TOF MS/MS II)進(jìn)行K法酶解和簡(jiǎn)化酶解法的酶解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并以基質(zhì)峰、酶自動(dòng)降解片段峰進(jìn)行校正，測(cè)定各肽段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。
結(jié)果表明，利用K法酶解Rubisco后進(jìn)行MALDI TOF分析，得到的PMF圖譜中，有49條肽段，質(zhì)核比(m/z)分布從700到3000(圖1B)；而用本發(fā)明的簡(jiǎn)化酶解法進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，可以得到53條肽段，主峰主要分布在1000到2000之間，更加利于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，并且主要峰的信噪比(S/N)也提高了很多(圖1C)。這些結(jié)果說(shuō)明，利用K法酶解，會(huì)造成肽段丟失，引起質(zhì)譜圖譜部分峰丟失，從而造成蛋白鑒定得分降低，而用本發(fā)明的簡(jiǎn)化酶解法，成功的解決了這一問(wèn)題。
將利用質(zhì)譜分析得到PMF圖譜數(shù)據(jù)通過(guò)Mascot Distiller軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，然后通過(guò)Matrixscience搜索網(wǎng)站(http://www.matrixscience.com/search)，在相應(yīng)的查詢條件下(具體查詢條件EnzymeTrypsin，Allow up to 1 missed cleavage，Peptide tolerance±0.3 Da，Mass valuesMH+，Monoisotopicaverage，Reporttop20 hits)搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，得到各蛋白的具體鑒定信息。用K法和本發(fā)明簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的NCBI搜庫(kù)結(jié)果分別如圖1D和圖1E所示。結(jié)果表明，本發(fā)明簡(jiǎn)化法得到的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得分高，用K法得到的Rubisco蛋白得分為104分(圖1D)，而簡(jiǎn)化法得分為117分(圖1E)。
實(shí)施例2、簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解方法酶解牛血清蛋白(BSA)及其效果驗(yàn)證牛血清蛋白(BSA)是牛血清中含量非常豐富的一種蛋白，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，有大量的數(shù)據(jù)信息可供參考，從而大大降低了利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定該蛋白的難度。為了對(duì)K法和簡(jiǎn)化酶解法進(jìn)行量化比較，以BSA為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了進(jìn)一步對(duì)比研究。
取10μg-5ng BSA進(jìn)行單向電泳分離，不同量的BSA經(jīng)過(guò)單向SDS-PAGE分離后(圖2A)，手工切取含量為0.1微克的蛋白條帶(圖2A，箭頭所指的條帶)，平均分為10等份，則每份凝膠中含有10ng牛血清蛋白(含該蛋白的凝膠的重量為50ug)。取兩份，分別用實(shí)施例1所述的K法和本發(fā)明簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解法進(jìn)行膠內(nèi)酶解。
利用Bruker公司的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI TOF MS/MS II)進(jìn)行K法酶解和本發(fā)明的簡(jiǎn)化酶解法的酶解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并以基質(zhì)峰、酶自動(dòng)降解片段峰進(jìn)行校正，測(cè)定各肽段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。然后按照相同查詢條件(具體查詢條件EnzymeTrypsin，Allow up to 1 missed cleavage，Peptide tolerance±0.3 Da，Mass valuesMH+，Monoisotopicaverage，Reporttop20hits)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。重復(fù)三次。結(jié)果表明，在MALDI TOF所得的肽指紋圖譜(PMF)中，利用K法酶解可以得到33條肽段(圖2B)，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得分為117分(圖2D)；而用簡(jiǎn)化法可獲得70條肽段，信息量約為K法的2倍(圖2C)，蛋白鑒定得分為148分(圖2E)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)比前者要高。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，在蛋白量較少(10ng)的情況下，簡(jiǎn)化酶解方法優(yōu)越性更為明顯，可以得到更多PMF數(shù)據(jù)，為搜庫(kù)提供更多有用信息，從而得到更高的分值，有效提高了蛋白質(zhì)鑒定的可信度和成功率。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)酶解的方法，包括下述步驟1)將含有目標(biāo)蛋白的凝膠用超純水洗滌；將凝膠脫水，干燥；2)將干燥后的凝膠用酸化過(guò)的胰蛋白酶工作液浸泡0.5-1.5h后，吸去多余酶工作液；所述酸化過(guò)的胰蛋白酶工作液是用80-120mM鹽酸溶解胰蛋白酶，酸化8-12分鐘，再用NH4HCO3將pH值調(diào)節(jié)至8.0-9.0得到的溶液；3)加入含有Ca2+的緩沖液，37℃酶解14-18h，去除凝膠得到蛋白酶解液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中所述鹽酸的濃度為100mM；所述NH4HCO3的濃度為50mM；所述100mM鹽酸溶解胰蛋白酶后的酶濃度為0.08-0.12μg/μl；所述胰蛋白酶工作液的胰蛋白酶濃度為8-12ng/μl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，超純水的用量為80-120μl/50μg含蛋白凝膠，洗滌時(shí)間為20-40min；洗滌次數(shù)為2次或2次以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述100mM鹽酸溶解胰蛋白酶后的酶濃度為0.1μg/μl；所述胰蛋白酶工作液的胰蛋白酶濃度為10ng/μl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，超純水的用量為100μl/50ug含蛋白凝膠，洗滌時(shí)間為30min；洗滌次數(shù)為2次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟1)中還包括洗滌后，用脫色液脫去凝膠中考馬斯亮藍(lán)顏色的步驟；所述脫色液為含有質(zhì)量百分含量為45-55％乙腈和質(zhì)量百分含量為0.356-0.435％NH4HCO3，pH值為8.0-9.0的水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述脫色液為含有質(zhì)量百分含量為50％乙腈和質(zhì)量百分含量為0.395％NH4HCO3，pH值為8.5的水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟1)中用乙腈浸泡脫水。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟3)中的含有Ca2+的緩沖液為含有0.8-1.2mM CaCl2和20-30mM NH4HCO3，pH值為8.0-9.0的水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述含有Ca2+的緩沖液為含有1mMCaCl2和25mM NH4HCO3，pH值為8.5的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)酶解的方法。該方法包括下述步驟1)將含有目標(biāo)蛋白的凝膠用超純水洗滌；將凝膠脫水，干燥；2)將干燥后的凝膠用酸化過(guò)的胰蛋白酶工作液浸泡0.5－1.5h后，吸去多余酶工作液；所述酸化過(guò)的胰蛋白酶工作液是用80－120mM鹽酸溶解胰蛋白酶，酸化8－12分鐘，再用NH
文檔編號(hào)G01N30/00GK1987401SQ20061016528
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者李銀心, 王旭初 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所