專利名稱：：抗人pd-l1單克隆抗體制備及應(yīng)用的制作方法抗人PD-L1單克隆抗體制備及應(yīng)用發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO，其制備方法以及這些單克隆抗體在抑制腫瘤相關(guān)的PD-L1誘導(dǎo)的特異性CTL的凋亡，以及在生產(chǎn)用于檢測(cè)胃癌組織中的PD-L1分子水平以進(jìn)行胃癌預(yù)后的判斷的試劑盒中的應(yīng)用。發(fā)明的背景已知有許多受體-配體相互作用都參與誘導(dǎo)、建立和調(diào)節(jié)抗原特異性免疫反應(yīng)。為了有效地激活T細(xì)胞反應(yīng)，通常至少需要兩個(gè)信號(hào)。其中除T細(xì)胞抗原受體(TCR)識(shí)別抗原提呈細(xì)胞(APC)上的MHC-抗原復(fù)合物以提供第一信號(hào)即抗原特異性信號(hào)外，還必須獲得T細(xì)胞與APC表達(dá)的共刺激分子相互作用后產(chǎn)生的非抗原特異性、非MHC限制性的第二信號(hào)。第二信號(hào)即為共刺激信號(hào)或協(xié)同刺激信號(hào)。如果僅有抗原特異性信號(hào)而缺失共刺激信號(hào)，T細(xì)胞將表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)或免疫耐受狀態(tài)，甚至導(dǎo)致凋亡。可見，共刺激信號(hào)是T細(xì)胞克隆擴(kuò)增、分化和發(fā)揮生物效應(yīng)所必不可少的。因此可以認(rèn)為，第一信號(hào)決定了T細(xì)胞活化的特異性，而第二信號(hào)則決定T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能否有效進(jìn)行(NoelleRJ，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6550，1992;AllenRCetal.，Science.259:990,1993)。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究，共刺激分子被不斷發(fā)現(xiàn)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)，這些共刺激分子可分為兩類一類是腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(TNF/TNFR)超家族，包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-lBB/4-lBBL、OX40/PD-L1、RANK/RANKL和Fas/FasL等。另一類是免疫球蛋白超家族，如B7-CD28/CTLA4、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-GL50、CD2/LFA-3等(KorthauerUetal.，Nature,361:539，1993)。這些共刺激分子以受體和配體相互作用的方式傳導(dǎo)信號(hào)。受體和配體一般表達(dá)在不同的細(xì)胞表面，通常一個(gè)為持續(xù)性表達(dá)，一個(gè)是誘導(dǎo)性表達(dá)。在免疫應(yīng)答的不同階段，這些分子以各自獨(dú)特而又相關(guān)聯(lián)的方式參與信號(hào)傳導(dǎo)，共同調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答。人PD-L1是1999年克隆的分子量約30-35KD、由290個(gè)氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白，為腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員之一。人PD-L1分子主要表達(dá)在靜止和活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DCs)上，以及心、胎盤、血管上皮、肝臟、肺、腎和骨骼肌等非淋巴組織細(xì)胞表面。另外，PD-L1在肺癌、肝癌、乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌及卵巢癌等癌組織細(xì)胞上均有表達(dá)，許多癌組織被誘導(dǎo)后還可使PD-L1的表達(dá)上調(diào)。但在許多情況下，正常組織須經(jīng)誘導(dǎo)后才表達(dá)PD-L1。在T細(xì)胞的增殖活化過(guò)程中，當(dāng)TCR和CD3處于最佳活化狀態(tài)時(shí)，借助PD-1-PD-L1途徑(作為輔助信號(hào))啟動(dòng)PD-1胞漿區(qū)ITIM酪氨酸殘基的磷酸化，促使SHP-2磷酸酶與SHP-2的結(jié)合，導(dǎo)致SHP-2的活化，從而抑制T細(xì)胞(特別是一些先前活化的T細(xì)胞)的增殖，并在一定條件下拮抗CD28-B7-2途徑的作用。研究還進(jìn)一步表明，PD-1-PD-L1途徑對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用比對(duì)CD4+T細(xì)胞的更加明顯，且此效應(yīng)是IL-2劑量依賴性的。PD-1-PD-L1途徑在抑制抗原特異性T細(xì)胞活化增殖的同時(shí)，也影響很多Thl和Th2型細(xì)胞因子的分泌，例如該途徑可下調(diào)IL-2和IFN-y分泌。近年來(lái)的研究表明，PD-1-PD-L1信號(hào)通路可在介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答和自身免疫性疾病的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。許多攜帶自身抗體識(shí)別之抗原的非淋巴組織均可高表達(dá)PD-L(尤其時(shí)PD-L1)，同時(shí)PD-L又能誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞(主要是T、B細(xì)胞)表面PD-1的表達(dá)上調(diào)，從而在多種自身免疫性疾病的炎癥部位發(fā)揮PD-1/PD-L途徑的負(fù)性調(diào)控作用。將小鼠PD-1基因敲除后，導(dǎo)致心臟、腎臟等非淋巴組織與T、B細(xì)胞間的PD-1/PD-L途徑的缺失，使自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞更容易被活化并遷移到心和腎等靶組織，從而造成自身抗體產(chǎn)生和局部組織損傷。因此，PD-1/PD-L途徑作為一種負(fù)性調(diào)控方式，在外周耐受和自身免疫病的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。PD-L1在許多內(nèi)皮來(lái)源的癌和腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，而PD-1/PD-L1途徑對(duì)CD8+T細(xì)胞的活化增殖又具有明顯的抑制作用，因此提示許多癌和腫瘤組織可能通過(guò)此途徑逃避CD8+T細(xì)胞(CTL)的殺傷作用，減弱機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。最近的動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)的PD-L1的表達(dá)為腫瘤免疫識(shí)別和免疫清除提供了內(nèi)在的途徑，阻斷該通路可有效地提高CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的效率。因此，抗PD-L1單克隆抗體將有可能成為臨床干預(yù)自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)和腫瘤的理想診斷和治療劑。盡管有關(guān)PD-L1受體-配體結(jié)合對(duì)的T細(xì)胞剌激功能、PD-L1抗體的制備及它們的其他免疫學(xué)功能都是部分已知的，但如本發(fā)明的新的抗人PD-L1單克隆抗體及其相對(duì)比較簡(jiǎn)單的制備方法卻未見報(bào)道。而且，本發(fā)明的抗人PD-L1單克隆抗體具有某些不同的生物學(xué)功能。發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10時(shí)分別由保藏編號(hào)為CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636的雜交瘤細(xì)胞系分泌的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備如上限定的抗人PD-L1單克隆抗體的方法，該方法包括(1)用預(yù)制備的高表達(dá)人PD-L1分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株L929/PD-L1或者人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231作為免疫原免疫動(dòng)物；(2)分離被免疫動(dòng)物的脾淋巴細(xì)胞并在適于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的條件下與骨髓瘤細(xì)胞融合；(3)篩選并培養(yǎng)如上得到的雜交瘤細(xì)胞；(4)從細(xì)胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞的動(dòng)物的腹水液中分離并純化所需的單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中產(chǎn)生抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10的雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)分別是CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供保藏編號(hào)分別為CGMCCNo.1636和CGMCCNo.1637的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如上限定的抗人PD-Ll單克隆抗體2H11和10E10在體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活化增殖中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如上限定的抗人PD-Ll單克隆抗體2H11和10E10在增強(qiáng)特異性CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的效率中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如上限定的抗人PD-Ll單克隆抗體2H11和IOEIO作為生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，在胃癌預(yù)后判斷和個(gè)體化治療中的應(yīng)用。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1顯示L929/PD-L1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建示意圖。圖2顯示以流式細(xì)胞術(shù)分析抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上PD-Ll分子的識(shí)別。其中透明峰為陰性對(duì)照，一抗為小鼠IgG，二抗為熒光素PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG。黑色峰顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與抗人PD-Ll單抗反應(yīng)的結(jié)果，其中第一抗體分別是商品化抗人PD-Ll單抗MIHI(陽(yáng)性對(duì)照)及本發(fā)明的抗人PD-Ll單抗2H11和IOEIO，第二抗體是熒光素PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG。圖3顯示2H11和10E10雜交瘤細(xì)胞株染色體的核型分析(xlOOO倍)。圖4顯示以流式細(xì)胞術(shù)分析10E10對(duì)活化的T、B細(xì)胞和成熟的DC上的PD-Ll分子的識(shí)別。A:顯示本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)活化T細(xì)胞上PD-Ll分子的識(shí)別。透明峰為陰性對(duì)照細(xì)胞首先與小鼠IgG反應(yīng)，然后加入二抗熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，最后加入熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人CD25直標(biāo)單抗；黑色峰為B細(xì)胞分別與2株抗人PD-Ll單抗2H11和10E10反應(yīng)后再加熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作用。B:顯示本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)LPS活化的B細(xì)胞的識(shí)別。其中透明峰為陰性對(duì)照細(xì)胞首先與小鼠IgG反應(yīng)，然后加入二抗熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，最后加入熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人CD69直標(biāo)單抗；黑色峰為B細(xì)胞分別與2株抗人PD-Ll單抗2H11和10E10反應(yīng)后再加熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作用。C:顯示本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)成熟樹突狀細(xì)胞(DC)的識(shí)別。其中透明峰為陰性對(duì)照細(xì)胞首先與小鼠IgG反應(yīng)，二抗為PE標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin-PE);黑色峰為DC分別與生物素標(biāo)記的本發(fā)明的兩株抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10反應(yīng)后再加入Streptavidin-PE作用。圖5顯示以流式細(xì)胞術(shù)分析單克隆抗體2H11和10E10識(shí)別的抗原位點(diǎn)。上圖顯示2H11識(shí)別和10E10以及商品化抗體MIH1均不相同的位點(diǎn)。下圖顯示10E10識(shí)別和2H11不相同的位點(diǎn)，但是和MIH1幾乎完全相同的位點(diǎn)。圖6顯示W(wǎng)esternblot免疫印跡分析。第1道為小分量蛋白Marker,第2、5、8道為L(zhǎng)929/PD-L1膜蛋白抽提物；第3、6、9道為L(zhǎng)929/mock膜蛋白抽提物；第4、7、10道為MDA-MB-231膜蛋白抽提物。小鼠IgG作為陰性對(duì)照?？贵w10E10和2H11均能識(shí)別L929/PD-L1和MDA-MB-231膜表面分子量為32KD的蛋白分子。圖7顯示以MTT法分析單抗10E10體外誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖。其中縱坐標(biāo)為OD值，橫坐標(biāo)為不同反應(yīng)組。A:為單克隆抗體CD3單獨(dú)刺激組。B:為1.25Ug/ml抗體刺激組。C:為2.5Ug/ml抗體刺激組。D:為5ug/ml抗體剌激組。E:為10Pg/ml抗體刺激組。其中系列一為鼠IgG對(duì)照組，系列二為10E10作用組。圖8顯示以凋亡檢測(cè)方法分析10E10和2H11對(duì)CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)作用。其中使用MDA-MB-231和MDA-MBB-435/PD-L1作為靶細(xì)胞。A圖顯示MDA-MB-231和MDA-MBB-435/PD-LI表達(dá)的PD-L1分子對(duì)特異性CTL的誘導(dǎo)凋亡作用；B圖和C圖分別顯示抗體10E10和2H11對(duì)上述凋亡現(xiàn)象的阻斷作用。鼠IgG作為陰性對(duì)照，抗體的作用濃度為0-10ug/ml。圖9顯示以免疫組織化學(xué)方法使用單抗2H11和10E10檢測(cè)胃癌組織中PD-L1分子的表達(dá)，PD-L1與胃癌患者病理變化及生存率的相關(guān)性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO，其制備方法以及這些單克隆抗體在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖中、增強(qiáng)特異性CTL殺傷高表達(dá)PD-L1分子的腫瘤細(xì)胞中，及其一種重要的生物學(xué)指標(biāo)在胃癌預(yù)后判斷和個(gè)體化治療中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用抗PD-L1單克隆抗體生產(chǎn)用于提高人或哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)水平的藥物組合物。本說(shuō)明書中所說(shuō)的"PD-1"是指抗原活化的T細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)；PD-1配體是指某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞上表達(dá)的可與PD-1受體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"抗PD-L1抗體"可以是PD-Ll特異性單克隆或多克隆抗體或它們的免疫學(xué)活性部分。本發(fā)明中，優(yōu)選的是單克隆抗體，特別是小鼠抗人PD-Ll抗體?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備本發(fā)明的抗人PD-Ll單克隆抗體2H11和10E10(參見KohlerandMilrtein，Nature256:495-96,1975;HarlowandLane，Aatibodies,ALaboratory,ColdSpringHarborLaboritory，1988)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，最好使用被攜帶人PD-Ll基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的，并可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下高效表達(dá)人PD-Ll多肽的重組體細(xì)胞作為制備本發(fā)明單克隆抗體的免疫原。因此，為了制備本發(fā)明的抗人PD-Ll單克隆抗體，首先構(gòu)建高表達(dá)人PD-Ll的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(L929/PD-L1)。高表達(dá)人PD-Ll分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/PD-L1具有較強(qiáng)的免疫原性，并且所表達(dá)的抗原分子的空間構(gòu)型能以自然狀態(tài)暴露于細(xì)胞膜表面，從而可更有效地激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。另外，由于L929細(xì)胞是鼠源性的成纖維細(xì)胞，其表面的其他分子具有相對(duì)較弱的抗原性，因此用該細(xì)胞作為免疫原將會(huì)減少非特異性抗體的產(chǎn)生，使單克隆抗體的篩選更為方便并大大提高陽(yáng)性檢出率。為了制備L929/PD-L1細(xì)胞，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA操作技術(shù)(例如參見Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbour,1989)進(jìn)行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建及擴(kuò)增、核苷酸序列的分析與鑒定、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)。例如，首先，使用RT-PCR技術(shù)從活化的T細(xì)胞中擴(kuò)增出人PD-Ll基因。將PD-Ll基因裝入逆轉(zhuǎn)錄載體pEGZ-Term，得到重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Terai/PD-Ll。然后，使用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/PD-Ll與輔助病毒pHIT456和pHIT60—起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48小時(shí)后，收集含病毒顆粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)物上清并以其感染L929細(xì)胞(ATCCCat.No.CCL-1)，連續(xù)感染3天。最后，用含Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選，待抗性單克隆生長(zhǎng)至足夠大，挑取單克隆集落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。按上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的PD-L1表達(dá)率高達(dá)97%以上?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的常規(guī)方法(KohlerandMilstein，Nature265:495-497,1975)制備本發(fā)明的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/PD-L1或者乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231免疫BALB/C小鼠。當(dāng)被免疫動(dòng)物的血清抗體水平達(dá)到峰值時(shí)，分離動(dòng)物的脾細(xì)胞并制備單細(xì)胞懸液。必要時(shí)，可使用免疫吸附方法篩選脾細(xì)胞。例如，可以將脾細(xì)胞懸液加到PD-L1抗原蛋白質(zhì)包被的平板或小孔內(nèi)，表達(dá)PD-L1多肽特異性免疫球蛋白的B細(xì)胞即結(jié)合到平板上，而不能被其余的懸液洗掉。然后可以收集所得到的B細(xì)胞或所有解離的脾細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)娜诤蟿├缇垡叶嫉恼T導(dǎo)下與骨髓瘤融合以形成雜交瘤，并在選擇性培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)以篩選融合的雜交瘤細(xì)胞。然后，用流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽(yáng)性抗性細(xì)胞株。于體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(小鼠腹水中)培養(yǎng)所選擇的分泌抗人PD-L1抗體的雜交瘤，并從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化所需的抗體。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10均能不同程度地識(shí)別活化T、B細(xì)胞和成熟DC表面上表達(dá)的PD-L1分子。競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，本發(fā)明的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10可識(shí)別不完全相同的抗原位點(diǎn)。因此，有可能利用2H11和10E10制備用于檢測(cè)可溶性人PD-L1的試劑盒。為了鑒定本發(fā)明的抗人PD-L1單克隆抗體的生物學(xué)功能，本發(fā)明首先進(jìn)行體外活化T細(xì)胞試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10均能阻PD-1/PD-L1結(jié)合，以劑量依賴方式誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖，并且能夠與抗人CD3激發(fā)型單克隆抗體發(fā)揮協(xié)同作用。眾所周知，腫瘤發(fā)生是因細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視而發(fā)生惡性增殖的結(jié)果。免疫逃避機(jī)制是由于機(jī)體的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞處于免疫耐受狀態(tài)。部分腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的PD-L1分子與腫瘤特異性CTL上的受體相互作用從而誘導(dǎo)CTL發(fā)生凋亡，使得腫瘤細(xì)胞逃避了殺傷。在我們的試驗(yàn)中，使用單抗2H11和10E10可以有效地阻斷此效應(yīng)，大大提高CTL的殺傷作用，且具有劑量依賴性。因此，有可能利用本發(fā)明的激發(fā)型抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10改變CTL在腫瘤細(xì)胞附近的狀態(tài)，并激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，以清除和控制腫瘤。雖然造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞均表達(dá)PD-L1(Dong.H.，Zhu.G.etal.NatureMed.1999)，但腫瘤細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常細(xì)胞(YoshikoIwai，MasayoshiIshidaetal.PNAS2002)。我們應(yīng)用本發(fā)明的單克隆抗體2H11和10E10檢測(cè)了100例的胃癌患者的組織標(biāo)本，結(jié)果顯示，PD-L1的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、組織類型無(wú)關(guān)，而與腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，生存期<2年的胃癌患者PD-L1的表達(dá)陽(yáng)性率(58.8%)顯著高于生存期>5年的胃癌患者(25.5%)。將腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1的表達(dá)等納入相關(guān)因素變量分析，提示PD-L1的表達(dá)是影響胃癌生存期的獨(dú)立因素。因此，利用本發(fā)明可有效地檢測(cè)胃癌組織中的PD-L1分子的表達(dá)，用以作為胃癌預(yù)后的判斷和作為個(gè)體化治療選擇的生物學(xué)指標(biāo)。同時(shí)，推測(cè)PD-L1抗體有可能作為一種胃癌治療劑被用于臨床。以下借助非限制性實(shí)施例舉例詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的基本精神和原則前提下，改變或改動(dòng)本說(shuō)明書中描述的某些技術(shù)內(nèi)容或技術(shù)環(huán)節(jié)。但人們可以理解到，這些平行的改變或改動(dòng)均將包括在本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1:抗人PD-L1單克隆抗體的制備本實(shí)施例描述抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10的制備方法。(1)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/PD-L1和L929/mock的建立(a)人PD-L1基因的克隆使用TRIZOL試劑(Gibco,BRL)抽提活化T細(xì)胞的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI，美國(guó))使用說(shuō)明書推薦的方法，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取5plcDNA為模板，使用正鏈引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94。C變性30秒，55。C退火30秒，72'C延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)后72。C延伸5分鐘)。純化后，在T4DNA連接酶作用下使PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接過(guò)夜。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌ToplO,并對(duì)篩選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定以及DNA測(cè)序。結(jié)果顯示，所獲得的cDNA序列與GenBank中注冊(cè)的人PD-L1cDNA序列完全一致。(b)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建分別用核酸內(nèi)切酶Pstl和EcoRI消化測(cè)序正確的pMD18-T/PD-Ll質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term(37°C，4小時(shí))?；厥蘸康幕虻钠?，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。用上述方法鑒定證實(shí)后，將所獲得的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體定名為pEGZ-Term/PD-Ll。(c)穩(wěn)定表達(dá)人PD-Ll的L929轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建:按照?qǐng)D1所示的流程，首先以試劑盒(Iiwitrogen，美國(guó))操作手冊(cè)推薦的脂質(zhì)體法，用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/PD-Ll和輔助病毒pHIT456與pHIT60(現(xiàn)代免疫學(xué)，2004，24(2):99-103)(體積比2:1:1)共轉(zhuǎn)染6孔板中60-70%匯合生長(zhǎng)成片的293T細(xì)胞。48小時(shí)后收集含病毒顆粒的293T培養(yǎng)上清，以其感染L929細(xì)胞。加入polybrene至終濃度為8ng/ml，繼續(xù)37。C感染6小時(shí)。再加入含10%胎牛血清(FCS)的1640培養(yǎng)基(2ml/孔，隔天換液)。重復(fù)感染3次后收集細(xì)胞，將l:6稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)物置于含Zeocin(Invitrogen，500pg/ml)的選擇培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)2周。待抗性細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至足夠大，挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。同時(shí)制備用作陰性對(duì)照的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/mock。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，L929/PD-L1細(xì)胞膜上人PD-L1蛋白的表達(dá)率約為99%。(2)抗人PD-U單克隆抗體的制備使用如上得到的高表達(dá)PD-L1分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(L929/PD-L1)作為免疫原，三次免疫接種Balb/c小鼠(10々500nl/只)(間隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞融合(共20塊96孔板)。以高表達(dá)PD-L1分子的L929/PD-L1為陽(yáng)性對(duì)照及表達(dá)PD-L1分子的L929/mock為陰性對(duì)照，用間接免疫熒光法對(duì)雜交瘤培養(yǎng)物上清進(jìn)行初步篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定(參見圖2)。陽(yáng)性克隆經(jīng)3次有限稀釋后，證明克隆的陽(yáng)性率達(dá)到約95%。經(jīng)復(fù)篩及亞克隆后獲得穩(wěn)定地分泌特異性鼠抗人PD-L1的雜交瘤細(xì)胞株，并分別被命名為2H11。使用天然高表達(dá)PD-L1分子的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231作為免疫原，以同樣的方法獲得了另一株細(xì)胞株IOEIO。這些雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外持續(xù)傳代(40代以上)后，仍能穩(wěn)定地分泌特異性抗體。對(duì)雜交瘤細(xì)胞株2H11和10E10的染色體分析顯示，這三株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為80-110(參見圖3)。(3)抗人PD-U單克隆抗體的生產(chǎn)與特性鑒定(a)采用本室建立的腹水體內(nèi)誘生方法生產(chǎn)單克隆抗體。取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔內(nèi)注入Pristane(0.5ml/只)。一周后腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞(1X10V只)，同時(shí)再次腹腔內(nèi)注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物(0.2ml/只)。5-IO天后收獲腹水，并離心取上清于-8CTC保存。(b)腹水型單抗的純化和定量。腹水液經(jīng)去除纖維蛋白和鹽析處理后，以蛋白G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出液，對(duì)磷酸鹽緩沖液(PBS)透析后用751紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗體蛋白濃度為0.8~10mg/ml。間接免疫熒光法分析，純化后單抗的效價(jià)為1:1000以上。(c)Ig亞類鑒定。采用試紙快速測(cè)定(Argen公司)法，鑒定Ig亞類，結(jié)果顯示2H11和10E10均為小鼠IgGl型。(d)抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)。在L929/PD-L1細(xì)胞(5xl05/管)懸液內(nèi)分別加入單克隆抗體(每管2ng)，4'C孵育45分鐘。洗細(xì)胞后，依次加入生物素標(biāo)記的單抗和Streptavidine-PE，并分別4。C孵育30分鐘。再次洗滌后用流式細(xì)胞儀分析，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。如圖5所示，單抗2H11部分阻斷單抗10E10與L929/PD-L1細(xì)胞上PD-L1分子的結(jié)合。由此表明，2H11和10E10識(shí)別不同的PD-L1抗原位點(diǎn)。(f)本發(fā)明單克隆抗體的Western印跡鑒定。抽提L929/PD-L1細(xì)胞膜蛋白，用5%脫脂奶粉4'C封閉過(guò)夜。翌日加入純化的抗體室溫孵育1小時(shí)。用TBST溶液洗去未結(jié)合的抗體，加入AP標(biāo)記的二抗，30分鐘。孵育后加入底物顯色。如圖6所示，L929/PD-L1細(xì)胞均能與PD-L1蛋白特異性結(jié)合，形成陽(yáng)性條帶。表明這兩株單抗均具有識(shí)別PD-L1分子的良好特異性。實(shí)施例2:抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10體外誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增殖本實(shí)施例描述以SH-TdR摻入法檢測(cè)單克隆抗體2H11和10E10體外誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增殖作用。(1)T細(xì)胞制備取正常志愿者外周血100ml(得自蘇州紅十字血站)，分離(Ficoll)得到單個(gè)核細(xì)胞。洗細(xì)胞后，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至3x106/1111。然后將細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中培養(yǎng)2小時(shí)(5%C02，37。C)。輕輕吸出懸浮細(xì)胞，即得到PBMC。然后按照常規(guī)綿羊紅細(xì)胞結(jié)合法分離得到T細(xì)胞(純度>90%)。(2)體外誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖用激發(fā)型抗CD3單克隆抗體(0.5pg/ml)包被96孔板(4X:過(guò)夜)。次日，向小孔內(nèi)加入純化的T細(xì)胞并分為5組(A)為單克隆抗體CD3(0.5pg/ml)單獨(dú)刺激組；(B)為L(zhǎng)25yg/ml單克隆抗體2H11或IOEIO刺激組;(C)為2.5ug/ml單克隆抗體2H11或IOEIO刺激組。D:為5ug/ml單克隆抗體2H11或10E10刺激組。E:為10yg/ml單克隆抗體2H11或10E10刺激組。每組各設(shè)相應(yīng)劑量的鼠IgG同型對(duì)照組。刺激3天后以SH-TdR摻入法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況。由圖7所示的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的兩株單克隆抗體均能以劑量依賴方式明顯誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增殖。實(shí)施例3:抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10促進(jìn)特異性CTL體外殺傷乳腺癌細(xì)胞本實(shí)施例描述分別以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單克隆抗體2mi和IOEIO對(duì)CTL體外殺傷腫瘤靶細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞)的增強(qiáng)作用。(1)特異性CTL的制備取正常志愿者外周血200ml(得自蘇州紅十字血站)，分離得到單個(gè)核細(xì)胞。洗細(xì)胞后，用含1(m小牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至3xl06/ml，并置于6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中培養(yǎng)2小時(shí)(5%C02，37。C)。然后輕輕吸出懸浮細(xì)胞，在培養(yǎng)板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)和10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，3天換液一次，第6天加入經(jīng)絲裂霉素處理的MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-435細(xì)胞。兩天后，取出負(fù)載抗原的DC與分離自同一外周血的T細(xì)胞共培養(yǎng)，3天后收獲被激活的特異性CTL。(2)CTL殺傷腫瘤細(xì)胞取如上制備的CTL和經(jīng)絲裂霉素處理的MDA-MB-231細(xì)胞及MDA-MB-435細(xì)胞，按50:1加入96孔板小孔中共培養(yǎng)。同時(shí)向小孔內(nèi)加入濃度分別為1.25ug/ml、2.5yg/ml、5ug/ml、10ng/ml的單克隆抗體2H11和IOEIO。各組設(shè)相應(yīng)濃度的小鼠IgG同型作為對(duì)照。培養(yǎng)3天后，經(jīng)AnexinV和PI染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞。如圖8所示，MDA-MB-231作用組，在加入不同濃度抗體后，均不同程度地降低了CTL的凋亡率，而MDA-MB-435組則無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，抗體2H11和IOEIO可以加強(qiáng)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。實(shí)施例4:以抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO作為胃癌預(yù)后判斷療效觀察的生物學(xué)指標(biāo)本實(shí)施例描述以單克隆抗體2H11和IOEIO水平作為生物學(xué)指標(biāo)，用免疫組化方法進(jìn)行胃癌預(yù)后判斷和療效監(jiān)測(cè)。同時(shí)，描述使用本發(fā)明的單克隆抗體制備的用于胃癌預(yù)后判斷和療效監(jiān)測(cè)的試劑盒。(1)標(biāo)本來(lái)源102例標(biāo)本取自1998-1999年間收住的胃癌手術(shù)患者。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。(2)免疫染色及評(píng)估使用己知的ElivisionTMplus免疫組化染色將待檢標(biāo)本的石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗三次，每次3分鐘。取一定量pH6.0檸檬酸鹽緩沖液于燒杯中加熱脫蠟，冷卻至室溫后，依次用蒸餾水和PBS各沖洗兩次，每次3分鐘。每張切片加1滴或50^3%H202，室溫下孵育IO分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。切片用PBS沖洗三次(每次3分鐘)后滴加第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4'C過(guò)夜。再用PBS沖洗三次后，每張切片加50nl聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，室溫下孵育20分鐘和PBS沖洗3次后，再滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(試劑B)，室溫下孵育30分鐘。用PBS沖洗并加100nl新鮮配制的DBA顯色液后，于顯微鏡下觀察3~10分鐘。陽(yáng)性為顯棕黃顏色的顆粒。蒸餾水沖洗后，用蘇木素復(fù)染。切片子用乙醇脫水干燥和二甲苯透明，然后用中性樹膠封片。結(jié)果判斷以腫瘤細(xì)胞質(zhì)明顯著色為陽(yáng)性。胃癌組織中PD-L1明顯著色的陽(yáng)性細(xì)胞少于20%為表達(dá)陰性，大于20%為表達(dá)陽(yáng)性。(3)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件迸行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)上，以X"檢驗(yàn)法對(duì)PD-L1表達(dá)陽(yáng)性及陰性組的組間比較。采用多變量Logisticregression法分析預(yù)后和諸因素的關(guān)系。結(jié)果如表1所示。表1:胃癌的預(yù)后情況與胃癌患者癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表1所示的數(shù)據(jù)可以看出，胃癌組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均顯示有PD-L1分子的陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率達(dá)42.2%。而且，數(shù)據(jù)分析顯示，生存期大于5年與生存期小于2年的胃癌患者癌組織細(xì)胞中PD-L1分子的表達(dá)有顯著差異:生存期小于2年的患者PD-L1分子在胃癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率(58.8%)顯著高于生存期大于5年的胃癌患者(25.5%)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示PD-L1分子在胃癌細(xì)胞的表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。因此，可使用單抗10E10盒2H11制備免疫組織化學(xué)試劑盒，應(yīng)用于臨床胃癌組織的檢測(cè)。雜交瘤樣品保藏鑒于陽(yáng)性雜交瘤特別是以高產(chǎn)率產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤篩選的偶然機(jī)遇性，也是作為對(duì)本說(shuō)明書文字描述部分的補(bǔ)充，本申請(qǐng)人已在中國(guó)普通微生物保藏管理中心(CGMCC)保藏了分別產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體2H11和10E1的兩個(gè)雜交瘤細(xì)胞株，它們的保藏編號(hào)分別為CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636。權(quán)利要求1、抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10，特征在于所說(shuō)的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10是分別由保藏編號(hào)為CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636的雜交瘤細(xì)胞株分泌的。2、根據(jù)權(quán)利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體，特征在于這些抗體是抗可溶性人PD-L1的單克隆抗體。3、根據(jù)權(quán)利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體，其中產(chǎn)生抗人B7-H3單克隆抗體2H11和10E10的雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)分別為CGMCCNo.1637和CGMCCNo.1636。4、根據(jù)權(quán)利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖中的應(yīng)用。5、根據(jù)權(quán)利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體2H11和IOEIO在增強(qiáng)特異性CTL殺傷高表達(dá)PD-L1分子的腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用。6、根據(jù)權(quán)利要求1的抗人PD-L1單克隆抗體2Hl:l和10E10作為生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo),在胃癌預(yù)后判斷和個(gè)體化治療中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及抗人PD-L1單克隆抗體2H11和10E10，其制備方法以及這些單克隆抗體在抑制腫瘤相關(guān)的PD-L1誘導(dǎo)的特異性CTL的凋亡，以及檢測(cè)胃癌組織中的PD-L1分子作為胃癌預(yù)后的判斷的生物學(xué)指標(biāo)中的應(yīng)用。文檔編號(hào)G01N33/577GK101104640SQ20061008830公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2006年7月10日優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日發(fā)明者靜孫,張學(xué)光,徐寬楓申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)