專利名稱：靶特異性復(fù)合體以及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及化學(xué)分析領(lǐng)域，并涉及用于才全測(cè)特定耙生物 分子(包括核酸分子)的組合物及方法。特別的，本發(fā)明涉及通過
方法。
技術(shù)背景 1.引言
以下說明包括可能對(duì)于理解本發(fā)明比較有用的信息。但并不認(rèn) 可任何這種信息是現(xiàn)有技術(shù)或要求保護(hù)的本發(fā)明的相關(guān)技術(shù)，或者 認(rèn)可明確或隱含引用的任何出版物是現(xiàn)有技術(shù)。
2.粒
在生物學(xué)中，有效而高度保真地檢測(cè)及分析生物分子(如，核 酸、蛋白質(zhì)、糖類、和脂質(zhì))是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。在分析生物樣品時(shí) 這些挑戰(zhàn)尤其尖銳，因?yàn)樯锓肿拥男再|(zhì)是極其復(fù)雜的，表現(xiàn)在無 i侖存在的不同分子種類(species)的凄t量方面還是在所述不同的特 定種類的分子的數(shù)量方面。由于這種復(fù)雜性，為了得到有效且可重 復(fù)的結(jié)果，則需要極其靈敏的和選擇性的方法。使事情進(jìn)一步復(fù)雜 化的是，需要利用商品化的可行方式(例如，在費(fèi)用、時(shí)間等方面) 來獲得這樣的結(jié)果。
10在大規(guī)^莫^r測(cè)和分析儲(chǔ)存所有活生物體(例如動(dòng)物、纟直物和 微生物)的遺傳信息的核酸時(shí)，恰當(dāng)解決這些挑戰(zhàn)的重要性可能考 慮得最多。簡(jiǎn)單的i兌，遺傳信息通常在脫氧核糖核酸(DNA)中編 碼，盡管一些病毒含有由核糖核酸(RNA)組成的基因組。在人類， 完整的單倍體基因組包括約三十億個(gè)核苷酸，含有分布在24條染 色體(22條常染色體和2條性染色體)上的約35， OOO個(gè)基因。天 然存在的DNA和RNA分子由酶促合成為核苷酸的線性聚合物，彼 此之間僅才艮據(jù)特定核香酸所含有的石成基而區(qū)分。在DNA中，存在 4種不同的脫氧核糖核芬酸，由于所述特定脫氧核糖核苦酸中含有 Ai。票呤、鳥噤呤、胞嘧啶或胸腺嘧咬石烕基而命名為"A"、 "G"、 "C'，、 和"T"。類似地，RNA由4種不同的核糖核普S交組成，由于所述 核苷酸中含有腺噪呤、鳥噤p令、力包嘧"定或尿嘧p定石咸基而命名為"A"、 "G"、 "C"、和"U"。本質(zhì)上，基因組DNA通常是雙鏈，4艮據(jù)經(jīng) 典的Watson-Crick石威基配對(duì)^見則，其中 一條DNA《連以反向平4亍的 方式與另一條鏈雜交，其中一條鏈上的A始終與另一條鏈上的T形 成氫4建，而G始終與C配對(duì)。同樣的石咸基配對(duì)法則適用于RNA, 只是在RNA中，U代替了 T而與A配對(duì)(在DNA或RNA中)。
本質(zhì)上，特定核酸的核苷酸序列是非隨4幾的，且正是所述核苷 酸的特定序列將種類中的一個(gè)成員與同 一種類的其它成員區(qū)分開， 并將一個(gè)基因與其它基因區(qū)分開。通常，每一種基因編碼一種特定 的蛋白，盡管由于從同一基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA采用不同的剪接方 式， 一些基因最終編碼了若干種蛋白。任何情況下，當(dāng)編碼蛋白的 基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而表達(dá)后，所述編碼的蛋白在活細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行特 定功能。
已知對(duì)于特定基因或遺傳位點(diǎn)，可能存在一個(gè)或多個(gè)不同的等 位基因。特定基因的等位基因通過每一種等位基因核苷酸序列中的 差異而彼此區(qū)分。特定基因的等位基因可能起源于 一 個(gè)核苷酸在特 定的核香酸位點(diǎn)替換另一個(gè)核普酸。可選地，等位基因差異可能由于在不同等位基因中插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核香酸而形成。由于這 些基因的蛋白編碼區(qū)的差異，由不同等位基因編碼的蛋白或許在大 小和/或氨基酸序列方面不同。對(duì)于作為酶的蛋白，氨基酸序列的差
異可以引起催化速率、底物專一性、對(duì)協(xié)同因子(co-factor)的需 要、細(xì)胞定位、穩(wěn)定性、最佳pH等產(chǎn)生不同，這些因素中的部分 或全部可能與例如疾病4企測(cè)、預(yù)防和治療相關(guān)(例如，爿尋4爭(zhēng)定藥物 給予特定患者的合適性，藥物/蛋白相互作用)。另一方面，如果所 述等位基因之間的差異是由于所述基因調(diào)節(jié)區(qū)的變化，則由所述特 定等位基因所編碼蛋白的表達(dá)水平可能不同，甚至產(chǎn)生顯著差異。
基因組核酸分子的核香酸序列變化作為突變的結(jié)果而發(fā)生，其 中，在復(fù)制過程中模板核酸的復(fù)制拷貝未得到所述模板核酸的精確 復(fù)制(duplication )。突變還可以在DNA修復(fù)過程中發(fā)生，因此DNA 雙鏈體的 一條或兩條4連與^f奮復(fù)反應(yīng)前或^f奮復(fù)反應(yīng)后相比核苷酸序 列不同。如上4是到的，復(fù)制或修復(fù)過程中的突變包括雙鏈DNA — 條或兩條鏈中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或替換。涉及到一 個(gè)核苷酸替換另一個(gè)核苷酸的突變(例如A^齊換G)命名為"點(diǎn) 突變"，因其發(fā)生在特定的核苷酸位置。在蛋白編碼區(qū)，點(diǎn)突變可 以為"錯(cuò)義"突變，引起由發(fā)生所述突變的特定密碼子所編碼的氨 基酸的變化；"無義"突變，其中所述變化引起所述密碼子乂人編碼 氨基酸變?yōu)榫幋a終止密碼子，因此得到截短型蛋白；或同義突變， 得到的密碼子編碼跟先前相同的氨基酸。另外，突變也可以發(fā)生在 非編碼區(qū)。盡管這種突變不改變由所述基因編碼的蛋白的氨基酸序 列，4旦可能影響所述基因的表達(dá)調(diào)節(jié)、所述DNA或RNA分子的穩(wěn) 定性等。
特定突變是否在所述基因庫中持續(xù)一段時(shí)間(overtime),是由 自然選擇的過程決定的，其中能一段時(shí)間改善繁殖適應(yīng)性的變化能 存留，否則就會(huì)消失。無論進(jìn)化效應(yīng)是什么，如上指出的，突變可 導(dǎo)致改變的或者在一些情況下甚至丟失生化活性的蛋白，因而引起疾病、對(duì)特定藥物的不良反應(yīng)等。類似地，突變可以引起基因表達(dá) 的異常調(diào)節(jié)，其可由于一種或多種特定基因產(chǎn)物的高豐度或低豐 度，而引起疾病、藥物每文感性改變等。
由突變引起的疾病，無"i侖是遺傳的還是起源于特定受試者的
DNA,都稱為"遺傳性疾病"或相似"i兌法。現(xiàn)在已知有4000多種 遺傳性疾病起因于等^立基因差異，包4舌血友病、i也中海貧血、 Duchenne型月幾營(yíng)養(yǎng)不良(DMD )、亨廷頓癥(HD )、阿爾茨海默病 (Alzheimer's Disease )、嚢寸生纖維-化(CF)以及鐮刀形細(xì)胞貧血。 除了由引起疾病相關(guān)等^立基因的突變導(dǎo)致的疾病，遺傳性疾病還可 以由較大的遺傳異常引起，例如特定染色體的部分或全部易位、重 復(fù)和缺失。這種異常的實(shí)例包括21三體(Down's綜合征的病因)、 13三體(引起Patau綜合征)、18三體(引起Edward's綜合征)、X 單體(Turner's綜合征的原因)以及其它性染色體的非整倍體例如 XXY (引起Klinefelter，s綜合征)。另外已知某些DNA序列使個(gè)體 對(duì)多種疾病中的^f壬^可一種易感，例如糖尿病、動(dòng)月永石更化癥、月巴胖、 多種自身免疫疾病以及癌癥(例如結(jié)直腸癌、乳&，癌、卵巢癌、 肺癌和前列腺癌)，還可以預(yù)測(cè)患者如何對(duì)特定藥物發(fā)生反應(yīng)(即 她/他是否發(fā)生反應(yīng)，以及如果發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)為肯定的反應(yīng)還是 不良反應(yīng)？)。遺傳差異在器官和組織移一直領(lǐng)域也具有相關(guān)性，如 不能"匹酉己"HLA (人體白細(xì)胞抗原)型可以引起器官或組織排斥。 由于特定物種內(nèi)個(gè)體之間的遺傳變異，DNA序列也可以作為"指 紋"來沖企測(cè)或鑒定不同的個(gè)體、評(píng)估物種的成員之間的親子關(guān)系或 其它方面的相關(guān)性等。
隨著核酸分斗斤在多個(gè)領(lǐng)^<內(nèi)的重要性增加，已經(jīng)開發(fā)了幾種用 于才企測(cè)和表4￡化DNA的方法。例如，核酸序列可以通過利用凝月交 電泳將擴(kuò)增核酸片^殳的遷移率與已知的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)^f亍比4交或者通過與
互補(bǔ)于待鑒定序列的探針寡核苷酸雜交而加以鑒定。然而，只有所 述核酸片^殳標(biāo)記上靈壽文的才艮道子功能(reporter function )(例如，包含放射性同位素(例如311、 "P或"S)的分子或熒光性或化學(xué)發(fā)光
性分子)，才可實(shí)現(xiàn)4企測(cè)。然而，》文射性標(biāo)記可能比4交危險(xiǎn)，其產(chǎn) 生的信號(hào)隨時(shí)間而消退，而且需要特殊的處理步驟。非同位素標(biāo)記
(例如熒光標(biāo)記)通常靈敏度很差，特別是當(dāng)使用高強(qiáng)度激光時(shí) 會(huì)消退。另外，標(biāo)記、電泳以及隨后的檢測(cè)涉及的步驟費(fèi)力、耗時(shí) 且易于出錯(cuò)。
另一方面，質(zhì)譜分析通過真空電離所述分子并通過揮發(fā)作用使 其"飛行移動(dòng)"而"稱量，，單個(gè)分子(例如核酸、肽和蛋白)。在 電場(chǎng)和磁場(chǎng)的聯(lián)合影響下，所述離子根據(jù)其各自的質(zhì)量(m)和電 荷(z)遵循一定4九跡。4艮久以來，質(zhì)i普分沖斤一直作為分析和表4正 化{氐分子量有才幾分子的常失見物理-有4幾方法的一部分。由于質(zhì)i普分析 的分析方面的優(yōu)勢(shì)，如提供高檢測(cè)靈敏度、質(zhì)量測(cè)定準(zhǔn)確性、詳細(xì) 的結(jié)構(gòu)信息和速度以及將數(shù)據(jù)在線轉(zhuǎn)移到電腦上，人們已經(jīng)付出相 當(dāng)大的努力以將質(zhì)譜分析應(yīng)用于核酸的結(jié)構(gòu)分析。參見，例如第 6,706,530、 6,635,452、 6,602,662、 6,589,485、 6,569,385、 6,566,055、 6,558,902、 6,468,748、 6,436,635、 6,428,955、 6,300,076、 6,277,573、 6,268,144、 6,268,131、 6,258,538、 6,235,478以及6,225,450號(hào)美國(guó) 專利?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了先進(jìn)的4支術(shù)用于含有諸如多核甘酸的較大生 物分子的樣品的電離/解吸，包括電噴霧/離子噴霧以及特別是基質(zhì) 輔助激光解吸/電離(MALDI )。典型的MALDI質(zhì)譜分析通常利用 飛4亍時(shí)間(TOF )結(jié)4勾(a time-of-flight configuration)以分一斤質(zhì)量。
質(zhì)譜分析提供的另 一 個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是其提供了巨大的多重化 (multiplex)能力，即在單個(gè)分析中特異靈敏的區(qū)分大量不同的分 子。最近，已經(jīng)闡述了利用非揮發(fā)性可釋放標(biāo)記分子的系統(tǒng)，其中 所述標(biāo)記分子含有可釋^:的質(zhì)量標(biāo)記(mass label )。參見例如第 6,635,452號(hào)美國(guó)專利。在這種系統(tǒng)中， 一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)的非揮發(fā) 性質(zhì)量標(biāo)記(每個(gè)對(duì)于特定靶核酸是特異性的)從探針分子上釋放， 所述探針分子特異性雜交于特定的核苷酸序列。因此，基于質(zhì)譜分析而;f企測(cè)特定質(zhì)量標(biāo)記可^是供對(duì)與所述特定質(zhì)量標(biāo)記相關(guān)的靶分 子的間接檢測(cè)。由于質(zhì)i普分析提供的靈敏度，數(shù)十、數(shù)百甚至數(shù)千 個(gè)不同的探針種類(每個(gè)均具有不同的可釋放質(zhì)量標(biāo)記)可以應(yīng)用 于單個(gè)多重化反應(yīng)中。然而，這種系統(tǒng)要求可檢測(cè)的非揮發(fā)性質(zhì)量 標(biāo)記/人所述#笨針釋放。因此，尚有才幾會(huì)開發(fā)其它可能更有效的系統(tǒng)， 適用于同時(shí)才企測(cè)生物樣品中大量不同的靶生物分子(例如核酸分 子和/或蛋白)。這將可以系統(tǒng)性大規(guī)才莫地分析多個(gè)具有預(yù)先確定的 性能和/或功能的靶分子。
3.定義
在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，先定義幾個(gè)在本發(fā)明中應(yīng)用的術(shù)i吾。 除了這些術(shù)語，如有必要，其它術(shù)語在說明書的其它地方加以定義。 除非在本文中清楚的定義，在本發(fā)明書中應(yīng)用的技術(shù)術(shù)語將具有其 領(lǐng)域公認(rèn)的意義。
術(shù)語"等位基因"或"等位基因變異體(variant)"指的是特定 基因的可替代形式，且因此占據(jù)同源染色體或染色體外DNA上的 相同位點(diǎn)或位置。當(dāng)具有二倍體基因組的受試者具有基因的兩個(gè)相 同等位基因時(shí)，所述受試者稱為對(duì)所述基因或等位基因純合。當(dāng)受 試者具有基因的兩個(gè)不同等位基因時(shí)，所述受試者稱為對(duì)所述基因 雜合。特定基因的等位基因可以通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸而4皮此區(qū) 分，根據(jù)核苷酸數(shù)量和/或由于例如核苷酸替換、缺失和/或插入而 形成特定核苷酸位置的核苷酸身份(identity)的任意一個(gè)或兩者。 因此，等位基因也可以為基因的突變形式。
術(shù)語"氨基酸，，指的是天然存在和非天然存在的氨基酸，以及 任何可以合成或可選的從天然來源獲得的修飾氨基酸。"擴(kuò)增子"是在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的核酸分子，且衍生于靶 核酸。擴(kuò)增子含有的耙核酸序列可能與所述靶核酸同義或反義。擴(kuò) 增子還可以含有其^f汙生的核酸中不存在的序列。
"擴(kuò)增引物"或"引物"意指能夠雜交于引物結(jié)合位點(diǎn)(即， 互補(bǔ)于所述引物的堿基序列的核酸堿基序列)的寡核苷酸，并作為 核酸合成起始的引物和/或啟動(dòng)子模板(例如，用于互補(bǔ)鏈的合成， 因此形成功能性啟動(dòng)子序列)。如果所述引物經(jīng)i殳計(jì)也可以編碼啟
動(dòng)RNA合成的序列(例如啟動(dòng)子)，則命名為"啟動(dòng)子引物"，而 且它優(yōu)選除了含有雜交于引物結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域，還含有非互補(bǔ)于所 述耙核酸^旦可,皮RNA聚合酶例如T7、 T3、 SP6 RNA聚合酶識(shí)別的 堿基序列。擴(kuò)增引物含有的3'末端可能被修飾為防止或減小引物延 伸的速率或數(shù)量(見例如第5,766,849號(hào)美國(guó)專利)。優(yōu)選擴(kuò)增過 程中采用兩種或多種不同引物。"通用"引物指的是經(jīng)設(shè)計(jì)雜交于 不依賴于待擴(kuò)增序列的引物結(jié)合位點(diǎn)的引物。因此，通用引物在多 重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中特別有用，其中大量不同的靶序列可以使用單對(duì)通用 引物而擴(kuò)增。
術(shù)語"生物樣品"指的是從任何活的(或以前活的)來源(例 如人類、動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物如牛、犬、馬、貓、羊和豬等家畜、 魚類、鳥類等)、植物、細(xì)菌、真菌、原生生物或病毒)獲得的材 料，其含有一種或多種核酸和/或一個(gè)或多個(gè)種群的其它靶生物分 子。生物樣品可由固態(tài)材料(例如組織、細(xì)胞團(tuán)、活4企等)、生物
;危體(^列^口尿、血液、p垂'液、羊7JC、沬大口、液、淋巴液、'汙液、津青'液、 粘液、淚液等)組成。生物樣品代表一個(gè)亞類的樣品，可以是任何 材料的樣品，所述材料含有可利用根據(jù)本發(fā)明的 一種或多種耙;險(xiǎn)測(cè) 試劑進(jìn)行檢測(cè)和/或分析的 一種或多種靶分子。
"生物分子"指的是生物系統(tǒng)(例如生物體)中天然存在的分 子。代表性的生物分子種類包括核酸、蛋白、肽、抗體、酶、糖類、
16脂類、金屬以及毒素。"耙，，生物分子是由本發(fā)明中的耙檢測(cè)試劑 而革巴向定位的分子。
術(shù)語復(fù)合體模板"編碼區(qū)"指的是對(duì)復(fù)合體或切割底物進(jìn)行編 石馬的區(qū)i或，才艮才居具體情況而定。
當(dāng)兩個(gè)單鏈核酸分子各自長(zhǎng)度的至少一部分存在足夠大小 (即，多個(gè)核酸石咸基亞單4立例如核普酸)的區(qū)i或允^午在所述兩個(gè)核
酸之間形成足夠的氫4建4建合而穩(wěn)定通過所述兩個(gè)核酸雜交形成的 雙鏈體時(shí)，則這兩個(gè)單4連核酸分子為"互補(bǔ)的"。因此，為了本發(fā) 明的目的，當(dāng)一個(gè)多肽中的每一個(gè)石威基在預(yù)期的互補(bǔ)區(qū)域上均與另 一個(gè)多肽中的互補(bǔ)石咸基配對(duì)時(shí)，則所述一個(gè)核酸完全互補(bǔ)于所述另 一個(gè)核酸，其中所述預(yù)期互補(bǔ)區(qū)纟或可以包4舌所述兩個(gè)核酸分子中一 個(gè)或兩個(gè)的全部或僅一部分。如人們所理解的，兩個(gè)單4連核S交分子 還可以在預(yù)期互補(bǔ)區(qū)域上未達(dá)到完全互補(bǔ)，仍然表現(xiàn)出足夠的互補(bǔ) 性以允許在嚴(yán)才各的雜交條件下于所述核酸之間進(jìn)行雜交。
"互補(bǔ)物"是互補(bǔ)于另一個(gè)核酸的核酸的同義詞。
"復(fù)合體"是在靶檢測(cè)分析中從復(fù)合體模板合成的分子，以間 接表明所分析的樣品中存在特定的靶分子。復(fù)合體含有 一 個(gè)或多個(gè) 亞單位。特別優(yōu)選用于復(fù)合體聚合的亞單位是堿基亞單位。
"復(fù)合體模板"指的是本發(fā)明的靶檢測(cè)試劑中進(jìn)行復(fù)合體編碼 的部分。
如果預(yù)先已知特定復(fù)合體種類的檢測(cè)表示相應(yīng)的靶分子存在 于所分析的樣品中，則稱復(fù)合體與靶分子"相關(guān)'，。這種相關(guān)歸因 于所述靶檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)，因?yàn)橐阎霭袡z測(cè)基團(tuán)是與所述特定 輩巴進(jìn)4亍專一性反應(yīng)。因此，該專一性的相互作用允"^午隨后生成由所 述耙沖企測(cè)試劑編碼的復(fù)合體。同樣的，革巴分子的相應(yīng)復(fù)合體稱為與所述特定靶分子"相關(guān)"，因此檢測(cè)特定復(fù)合體間接表明所分析的 樣品中存在所述相應(yīng)的耙分子。
分子的連續(xù)^爭(zhēng)距(Contiguous span)指的是線性聚合體中的一 個(gè)區(qū)域，其中由所述聚合體合成的分子是同種類型的聚合物。例如， 核4t核苷酸的連續(xù)^爭(zhēng)距指的是多肽(或其一部分)，其中所述^,距 內(nèi)的核香酸均為核糖核苦酸。其它核苦酸，例如脫氧核糖核香酸， 不包括在所述連續(xù)^夸距之內(nèi)，盡管其可能包括在所述多肽的其它位 置，如果所述聚合體包括的核普酸多于所述核糖核苷酸的連續(xù)^爭(zhēng) 距。
"確定的特征"指的是允許一個(gè)復(fù)合體種類被檢測(cè)并與其它復(fù) 合體區(qū)分的已知特征。確定的特征包括確定的化學(xué)組成、確定的質(zhì) 量、確定的長(zhǎng)度、確定的大小、確定的序列以及確定的結(jié)構(gòu)。具有
"確定的化學(xué)組成"意指所述復(fù)合體中每一個(gè)堿基的身份(標(biāo)志， identity)是已知的。具有"確定的分子結(jié)構(gòu)式"意指組成所述分子 的每一個(gè)原子的數(shù)量和身份已知。因此，所述分子的質(zhì)量或質(zhì)量范
圍(由于同位素變異)也可一皮確定，即所述分子含有"確定的質(zhì)量"。 例如， 一個(gè)確定的分子質(zhì)量可以通過爿夸所述分子的4匕學(xué)式中(例如 C6H1206)表示的原子的質(zhì)量進(jìn)行求和而確定。"質(zhì)量范圍"反映由
量范圍。具有"確定的長(zhǎng)度"或"確定的大小"意指已知多少個(gè)亞 單位構(gòu)成一個(gè)特定復(fù)合體。例如，含有十個(gè)核苷酸的復(fù)合體稱為具 有10個(gè)核苦酸的長(zhǎng)度。"特定序列，，意指所述復(fù)合體具有特定的堿 基序列，該序列可以由任何恰當(dāng)4支術(shù)確定(例如，通過雜交、測(cè)序 等)。"確定的結(jié)構(gòu)，，意指復(fù)合體具有的三維結(jié)構(gòu)(例如抗原決定簇) 可#1與所述結(jié)構(gòu)特異性反應(yīng)的試劑(例如抗體)識(shí)另'J。如人們所理 解的，某些情況下復(fù)合體可以^皮分類，因此通過一種或多種方法進(jìn) 行檢測(cè)，其中每種檢測(cè)方法都是根據(jù)特定的特征分析而實(shí)施的。例 如，由石咸基亞單位組成的復(fù)合體將具有確定的組成、質(zhì)量(或質(zhì)量范圍)、序列以及長(zhǎng)度，因此可以通過多種基于元素、質(zhì)量、序列 和長(zhǎng)度的4企測(cè)方法進(jìn)行4企測(cè)。當(dāng)采用恰當(dāng)?shù)牟牌鬁y(cè)方法時(shí)，具有唯一 的確定特征(例如唯一確定的質(zhì)量、化學(xué)組成等)的復(fù)合體可能4艮 容易與其它復(fù)合體種類區(qū)分開。
"基因"指的是對(duì)基因產(chǎn)物(即多肽或RNA分子)編碼的特 定遺傳位點(diǎn)或DNA分子中的區(qū)域。除了所述結(jié)構(gòu)編碼區(qū)，基因可 能還包括非編碼區(qū)，包括內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄但不翻譯的區(qū)域以及所述編 碼區(qū)上游和下游調(diào)節(jié)元件。根據(jù)上下文，"基因"可能任選包括表 達(dá)所述基因必需的核普酸序列(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)。
術(shù)語"基因型，，指的是受試者基因組中至少部分基因的等位基 因身份。樣品"基因分型"指的是確定在特定位置由受試者(在其 全部或僅部分細(xì)胞中)攜帶的所述特定等位基因或所迷特定核苷 酸。因此，基因型可能指的是一個(gè)或多個(gè)特定等位基因。
"雜交體"或"雙鏈體(二倍體，duplex)"指的是由兩個(gè)線性 聚合體構(gòu)成的分子，所述兩個(gè)線性聚合物在各自長(zhǎng)度的至少一部分 上雜交而形成穩(wěn)定的雜交體或雙鏈體分子。在雜交體中，每個(gè)線性 聚合物均由》咸基亞單位構(gòu)成。這種聚合物的實(shí)例包括含有天然存在 的和/或〗奮飾的》咸基和/或主干化學(xué)的單鏈RNA和DNA分子。所述 雜交體的雙鏈區(qū)足夠穩(wěn)定，因此可以維持用于預(yù)期的目的或操作， 例如作為可被催化延伸的引物；因此，如果需要，雙鏈體可以從單 鏈分子上分離，等等。
"雜交，，指的是在指定的雜交分析條件下以平行或優(yōu)選的反向 平行的方向兩條完全或部分互補(bǔ)的核酸鏈聚合到一起而形成具有 雙鏈區(qū)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的能力。這種雙鏈結(jié)構(gòu)(有時(shí)稱為雜交體或雙鏈 體)的兩條組成鏈，由氫鍵束縛在一起。盡管這種氫鍵通常在單核 酉臾《連上含有所述石咸基^^票p令與胸^l^密口定或尿嘧"定(A與T或U )或者胞嘧咬與鳥噤呤(C與G)的核苦酸之間形成，但也可以在非"規(guī) 范"配對(duì)成員的石咸基之間形成，如本領(lǐng)域中已知的。
術(shù)語"同位素確定的"指的是具有相同化學(xué)式的分子群，其中 構(gòu)成所述分子的一種或多種原子種類具有比天然存在更嚴(yán)格的同 位素分布(由于同位素富集或損耗)。例如，典型的碳原子具有幾 種天然存在的同位素(例如12C6、 13(^6和14(:6)，其中每一種具有 不同數(shù)量的中子(分別為6、 7和8)。提到特定元素的同位素時(shí)， 使用分子式"AXZ",其中"X"是所述原子的化學(xué)符號(hào)，"Z"是原 子數(shù)量(等于所述元素的原子中質(zhì)子的數(shù)量)，而"A"是所述特定 同位素中質(zhì)子和中子總和的數(shù)量。已經(jīng)有研究才艮道了一部分天然存 在的C 、 H 、 N以及O的同位素的相對(duì)豐度(見例如 Bievre and Taylor (，993)， /. Moss, S/ e"ram, /o打vol. 123:149 )。只于于
碳，所述"C6和13C6同位素的相對(duì)豐度(以百分比表示)分別為98.90 和1.10。對(duì)于氫，所述'Hi和同位素的相對(duì)豐度分別為99.985 和0.015。氮的"N7和"N7同位素的相對(duì)豐度分別為99.634和0.366, 而所述氧同位素1608、1708和1808同位素的相對(duì)豐度分別為99.762、 0.038和0.200。如前述，如果所述碳原子同位素12<^6和1306在所述 種群中的相對(duì)豐度分別是99.90和0.10，則特定種類(物種，species )
(例如核香如腺苦)的分子群將關(guān)于碳進(jìn)行同位素確定。因此， 對(duì)于由幾種原子種類構(gòu)成的分子，其中一種或多種具有一種以上天 然存在的同位素，則分子的合成利用其中富集的最普遍的同位素原 子，即其中相對(duì)而言相比于所述該元素豐度低的同位素而存在的豐
度大的同位素，或者較少(最少)豐度的同位素被損耗。用于同位 素富集和損肆毛的方法在本領(lǐng)域中已知。
"標(biāo)記"指的是通過直4妻或間-接方法將分子連4妻到所述標(biāo)記上 的分子。此處，"直接"檢測(cè)指的是不需要另一個(gè)分子與用于檢測(cè) 的標(biāo)記基團(tuán)相互作用?？梢灾苯訖z測(cè)到的標(biāo)記包括放射性同位素、 發(fā)光性分子、熒光分子以及其它可以直沖妄4全測(cè)其存在的分子。"間接"檢測(cè)指的是為了檢測(cè)需要一個(gè)或多個(gè)其它分子與所述標(biāo)記基團(tuán) 相互作用的方法?？梢蚤g接檢測(cè)的標(biāo)記包括高親和性結(jié)合配對(duì)的一
個(gè)成員(例如生物素和抗生物素蛋白《連菌素中的一個(gè)，以及抗體 及其一個(gè)或多個(gè)特異抗體(或抗體片段)中的一個(gè)，等等)。
"文庫"(庫，library )指的是兩個(gè)或多個(gè)不同分子種類的集合。 在復(fù)合體的上下文中，文庫包括多個(gè)不同的復(fù)合體種類。典型的， 每種復(fù)合體種類與不同的靶分子相關(guān)，可理解為"不同的耙分子" 意思可以為相同分子(例如基因或多肽)遺傳性或結(jié)構(gòu)性變異體， 也可以為由不同基因編碼的不同基因或多肽靶分子。在輩巴才企測(cè)試劑 的上下文中，文庫包^t舌兩種或多種不同的革巴試劑種類。在4壬^T情況 下，文庫的成員可由于耙結(jié)合基團(tuán)(部分，moiety)和/或復(fù)合體才莫 才反的差異而與其它成員區(qū)分開。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"多重"、"多重化"以及相似術(shù)語 指的是在單個(gè)分析中檢測(cè)和/或分析多個(gè)靶生物分子種類的能力。例 如，多個(gè)不同的靶檢測(cè)試劑，每個(gè)均特異于不同種類的靶生物分子， 可以用來在單個(gè)分析中分析生物樣品。如果樣品中存在部分或全部 被耙向的生物分子，所述分析結(jié)果將如之表明。因此，多重化顯著 增加了分析效率，典型的，多重化允許在單個(gè)分析中分析多于10 種、伊C選多于50、 100、 250、 500或1,000種、專交伊乙選多于1,000 種不同種類的革巴生物分子。當(dāng)然，可以在特定多重化分析中4全測(cè)的 耙分子種類數(shù)量將依賴于某些因素如由所采用的多種靶檢測(cè)試劑 編碼的復(fù)合體的化學(xué)組成、使用的檢測(cè)劑類型以及所述檢測(cè)劑的敏 感性，等等。
術(shù)語"突變的基因"指的是相對(duì)于不含有突變基因的受試者， 能夠改變具有所述突變的受試者表型的基因等位形式。如果受試者 必須對(duì)這種突變純合才能具有改變的表型，所述突變稱為"隱性"。 如果一個(gè)拷貝的所述突變基因足以改變所述受試者的表型，所述突變稱為顯性。如果受試者具有一個(gè)拷貝的所述突變基因且其具有的 表型介于純合受試者和雜合受試者(對(duì)該基因)的表型之間，所述 突變稱為共顯性。如在本文中應(yīng)用的術(shù)語"突變"指的是不同基因 組之間或者具有的頻率低于1%的個(gè)體之間，在特定遺傳位點(diǎn)(例 如基因中的核苷酸位置)核苦酸序列的差異。
本文中，術(shù)i吾"核酸，，指的是由天然存在的核^f唐-或脫氧核4唐核 苷酸組成的雙鏈或單鏈聚合物分子(例如RNA、 mRNA、 rRNA、 tRNA、小核RNA、 DNA、 cDNA以及RNA/DNA共聚物)，以及<奮 飾的/非天然核酸，常稱為核酸沖莫擬物。核酸才莫擬物的實(shí)例包4舌具有 磷酸二酯的修飾物或取代物，包括硫代磷酸酯、磷酸甲酯、苷硼烷 磷酸酯、酰胺、酯和醚的亞單位間45t接，以及用分子完全耳又代亞單 位，所述分子如除了核苷和核普酸以外切割連4妄(例如可光切割的 硝基苯基)以及石咸基亞單位。"輩巴"核酸是含有靶核酸序列的核酸。
"核香酸序列"通常指的是構(gòu)成特定核酸分子的堿基的線性序 列。除非另有指明，核苷酸序列寫為5，到3，。"靶"核苷酸序列指 的是樣品中存在的核酸分子的核苷酸序列被靶向的特定部分，因此 與所述相應(yīng)輩巴檢測(cè)試劑的寡核苦酸部分基本互才卜。
"核酸擴(kuò)增，，指的是用于增加特定核酸分子數(shù)量的方法。根據(jù) 本發(fā)明的核酸擴(kuò)增可能為線性的或指數(shù)的，盡管優(yōu)選指數(shù)擴(kuò)增。
"核酸堿基(堿基，nucleobase)"指的是能夠與互補(bǔ)堿基形成 氫鍵而形成堿基對(duì)的堿基。堿基包括腺嘌呤("A")、胞嘧啶("C")、 鳥。票呤("G")、次黃。票呤、乳清酸、胸腺嘧啶("T，，)、尿嘧啶("U") 以及黃噤呤。石咸基對(duì)包括所述標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick DNA石咸基對(duì) A:T、 T:A、 G:C、 C:G,而在RNA中，U代替T。"堿基亞單位，， 指的是線性聚合物的特定單體亞單位，其中所迷亞單位包括與允許 亞單位聚合的骨架(scaffold)連接的堿基，因此得到的單鏈聚合物
22表現(xiàn)出其起源的堿基，因此所述聚合物可以與互補(bǔ)的核酸分子(例
如生物樣品中天然存在的耙核酸分子)形成穩(wěn)定的雙鏈雜交體。 核苦和核苦酸代表實(shí)施本發(fā)明時(shí)比較有用的堿基亞單位的優(yōu)選實(shí) 例。石咸基還可以{務(wù)飾為包括一個(gè)或多個(gè)已知化學(xué)組成的分子，以進(jìn) 行質(zhì)量修飾。這種質(zhì)量修飾基團(tuán)命名為"質(zhì)量標(biāo)簽"，得到的質(zhì)量 ^修飾核苷或石咸基亞單位分別命名為"質(zhì)量標(biāo)記的核苷"和"質(zhì)量標(biāo) 記的堿基亞單位"。
"核苷，，是通過糖的C-l與N-9 (在嘧p定石咸基的情況)或N-l (在。票呤堿基的情況)之間的N-糖苷鍵而將嘌呤或嘧啶堿連接到糖 基(例如P -D-核糖或(3 -D-2-脫氧核糖)的分子。所述糖基在脫 氧—亥^唐核苷酸中為2，-脫氧斗亥一唐，在核4唐核苷酸中為一亥4唐基團(tuán)。脫 氧核糖和核糖的類似物也可以應(yīng)用，包括2，、 3'-脫氧以及大量本領(lǐng) i或中已知的其它核普酸才莫擬物。才莫擬物包^^連終止核苷酸，例如 3，_0_甲基、卣化石咸基或糖取代基；替代性的糖結(jié)構(gòu)包括非糖、烷基 環(huán)狀結(jié)構(gòu)。核香的代表性實(shí)例包括腺苦、胞苷、鳥香、肌苦、乳清 酸核苷、胸苷、尿苷以及黃苷。"核苷亞單位"指的是多聚核苷酸 的特定核苷。
"核苷酸"指的是具有一個(gè)或多個(gè)酯化于其糖基5，-碳原子的 石粦酸酯基團(tuán)的核芬。核苦酸可以為天然存在的或者合成的。在實(shí)施
磷酸(phosphate);胞苷單-、雙-以及三-磷酸；鳥苷單-、雙-以及三 -石粦酸；力幾香；乳清酸核苷；胸苷單-、雙-以及三-石粦酸；尿苷單-、 雙隱以及三-石粦酸；以及黃普。
"寡核苷酸"是由兩個(gè)或多個(gè)核苷和/或石咸基亞單位偶l關(guān)在一起 而構(gòu)成，例如通過核苷酸的聚合。寡核苷酸可能由包括例如在DNA 和/或RNA及其類似物中存在的石咸基組成。當(dāng)所述石咸基亞單位是核 香時(shí)，所述;咸基亞單位的糖基可能為核糖、脫氧核糖或其類似物，包括例如用2'-0-曱基取代呋喃核糖(ribofuranosyl)基的核糖核苷。 所述;成基亞單位可能由某些諸如磷酸二酯鍵接基、修飾的鍵接基， 或通過不阻止所述寡核苦酸雜交于其互補(bǔ)的把核酸序列的非核苷 酸基團(tuán)之間的鍵連接。修飾的鍵包括那些標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯鍵接基由不 同的鍵取代，例如硫代磷酸酯鍵鍵接基或磷酸甲酯鍵鍵接基。堿基 亞單位可能通過例如天然DNA的脫氧核糖磷酸主干由假肽主干取 代，例如2-氨乙基甘氨酸(2-aminoethylglycine)主干，其通過羧甲 基連接子連接到中心的仲胺而與核酸石咸基亞單位偶聯(lián)。具有假肽主 干的DNA類似物通常稱為"肽核酸，，或"PNAs，，(見例如第 5,539,082號(hào)美國(guó)專利)。本發(fā)明設(shè)想的寡核普酸或^f氐聚物的其它非 限定性示例包括含有雙環(huán)或三環(huán)核苷的核酸類似物以及稱為"鎖核 酸""鎖核苷酸類似、物"或"LNAs"的核苷酸類似物(見例如第 6,083,482號(hào)美國(guó)專利)。只要所述1務(wù)飾的寡核苷酸在嚴(yán)嚴(yán)4各的雜交 分析條件或擴(kuò)增條件下可以雜交于耙核酸，任何核酸類似物均屬本 發(fā)明所i殳想-使用的。具有4爭(zhēng)定石威基亞單^f立序列的寡核苷酸可以通過 本領(lǐng)域中的普通沖支術(shù)人員已知的才支術(shù)生產(chǎn)，例如通過化學(xué)分析或其 它'除當(dāng)方法。
當(dāng)寡核苦酸含有至少6個(gè)，優(yōu)選8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15或更多連續(xù)石咸基，且其中至少80%，優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選100%, 互補(bǔ)于相應(yīng)革巴核酸中核苷酸連續(xù)^爭(zhēng)距時(shí)，則其"基本互補(bǔ)"于其相 應(yīng)的耙核酸分子。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員很容易理解，以各種互補(bǔ) 性百分比，對(duì)雜交分析條件所作的調(diào)整，以允許所述寡核苷酸雜交 到所述靶序列上而同時(shí)防止不可接受水平的非特異性雜交?；パa(bǔ)性 的程度通過比較構(gòu)成待比較其互補(bǔ)性的兩個(gè)區(qū)域的堿基順序而確 定，并不將所述兩個(gè)核酸之間存在的其它結(jié)構(gòu)差異考慮在內(nèi)，只要 所述結(jié)構(gòu)差異不阻礙互#卜堿基之間的氫鍵鍵合。兩個(gè)核酸之間互補(bǔ) 性程度還可以根據(jù)待比較區(qū)域中存在的堿基錯(cuò)配的數(shù)量而表示，錯(cuò) 酉己范圍可能為0到4， ^尤選0到2個(gè)石咸基。根據(jù)本發(fā)明的"可取得專利的"組合物、過程、機(jī)器或生產(chǎn)的
制品(article of manufacture )意思為所述主體物質(zhì)符合實(shí)施分析時(shí) 所有的法定專利性要求。例如，關(guān)于新穎性、非顯著性等，如果后 來的研究表明一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求包括一個(gè)或多個(gè)不具有新穎性、 非明顯性等的具體實(shí)施方式
，則所述由"可取得專利的"具體實(shí)施 方式限定的權(quán)利要求則明確排除非可取得專利的具體實(shí)施方式
。對(duì) 本文中所附的權(quán)利要求加以解釋，就提供了最寬泛的合理范圍并保 持其有效性。另外，如果一個(gè)或多個(gè)所述法定專利性條件被修訂， 或如果從該申誚 提交或/>開(issue)作為專利的時(shí)間開始至再次分 析所述附加的—又利要求的有效性為止，用于所述評(píng)估特定法定專利 性條件的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生改變，則所述權(quán)利要求將以以下方式解釋(1) 保持其有效性(2)在所述情況下提供最寬泛的合理解釋。
"多個(gè)，，指多于一個(gè)。
術(shù)語"多態(tài)性"指的是在不同基因組或個(gè)體之間存在兩個(gè)或多 個(gè)可替代性基因組序列或等位基因。因此，"多態(tài)的，，指的是一個(gè) 以上基因或其部分(例如，等位基因變異體)共同存在。如果基因 的一部分存在至少兩種不同形式，即兩種不同的核苷酸序列，則稱 為基因的"多態(tài)區(qū)"。多態(tài)區(qū)可以包^"少至只有單個(gè)核苷酸，其身 份在不同等位基因中不同。"單核苷酸多態(tài)性"或"SNP"是單個(gè)堿 基對(duì)的改變。典型地，單核苷酸多態(tài)性在所述多態(tài)位點(diǎn)由于一個(gè)核 香酸凈皮另 一個(gè)核普酸替換而發(fā)生。單個(gè)核苷酸的缺失或插入也可以 引起單核苷酸多態(tài)性。多態(tài)區(qū)可以涉及多個(gè)連續(xù)的核苷酸，如幾個(gè) 核普酸的替換、重排、插入和缺失，盡管這些多態(tài)性比較少見。
"多核苷酸"通常指核苷酸的線性聚合物，盡管如果所述聚合 物除了核香酸或核香之外還含有一個(gè)或多個(gè)石咸基亞單位，為了本發(fā) 明的目的，其仍然凈皮稱為多核苷酸。優(yōu)選的多核苷酸是其中多個(gè)亞 單位通過核苦酸之間的5，-3，磷酸二酯鍵連接的多核苦酸。多核普酸包括單鏈和雙鏈DNA和RNA分子，包括其中一條鏈或兩條鏈通過 重纟且或合成而生成的多4亥普f臾。
"多肽"指的是包括氨基酸殘基(其包括天然和非天然氨基酸 殘基)聚合物的分子。因此，多肽包括肽和蛋白，包括天然和改造 的(engineered)蛋白、酶、抗體、抗體片^殳以及蛋白共輒體。在優(yōu) 選的具體實(shí)施方式
中，多肽為抗體、抗體片l殳、酶、受體、受體配 體、調(diào)節(jié)性蛋白、核酸結(jié)合蛋白、激素或展示方法的蛋白產(chǎn)物例如 p羞菌體展示方法或細(xì)菌展示方法。
術(shù)語"優(yōu)先雜交"意指在嚴(yán)格的雜交分析條件下，互補(bǔ)性核酸 (或還含有非互補(bǔ)區(qū)的核S交互補(bǔ)區(qū))雜交形成穩(wěn)定的雜交體。優(yōu)先 雜交可以利用標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)加以測(cè)定。與非互補(bǔ)性核酸雜交相比，優(yōu)選 核酸種類與其互補(bǔ)性核酸的雜交存在至少約10〗咅的差異，更優(yōu)選 至少約100倍的差異，最優(yōu)選至少約1,000倍的差異。優(yōu)選所述反 應(yīng)條件-使得才企測(cè)樣品中非互補(bǔ)性核酸之間的雜交不高于所述背景 信號(hào)水平。
"探針"指的是最低地含有至少一個(gè)靶結(jié)合基團(tuán)的分子。因此， 探針可能包括兩個(gè)或多個(gè)靶結(jié)合基團(tuán)，其可能被連接形成所述探 針。例如，特定一笨針可能包4舌兩個(gè)寡核苷酸，當(dāng)所述兩個(gè)寡核苷酸 雜交于其各自的耙分子時(shí)，則變?yōu)猷徑模?-使得其可以相連(例如
連接)而形成完整的探針分子。探針(或其組成部分)可能還含有 其它組分包括標(biāo)記和標(biāo)簽，標(biāo)簽作為可允許其所連接的分子與混合 物(例如溶液)中存在的其它分子分離的基團(tuán)。
"啟動(dòng)子"意指足以指導(dǎo)由所述啟動(dòng)子可操作地(有效， operably)連接的DNA分子編碼的多肽進(jìn)行直接轉(zhuǎn)錄的最小DNA 序列，即在所述啟動(dòng)子和所述編碼序列(例如復(fù)合體編碼區(qū))之間 存在功能4建接，使得所述編碼序列可以一皮RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。通常"啟動(dòng)子，，指的是多個(gè)可以指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。如在本
文中使用的，啟動(dòng)子包括必要的核酸序列用于RNA聚合酶結(jié)合、 轉(zhuǎn)錄起始以及延伸。啟動(dòng)子的起源可以為原核或真核的，〗尤選嗟菌 體啟動(dòng)子例如T7、 T3和SP6啟動(dòng)子。在其它的啟動(dòng)子中，真核啟 動(dòng)子還包括來自于CMV、 SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及腺病毒的啟動(dòng)子。 任選啟動(dòng)子還包括位于從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始的多至幾千個(gè)堿基對(duì) 的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制子元件。啟動(dòng)子還包括"通用"啟動(dòng)子 (consensus promoter), 并不是天然存在的，^f旦可以i殳i十，侈'B口通 過比較高水平轉(zhuǎn)錄基因的啟動(dòng)子序列而開發(fā)反映"通用"堿基(典 型的，在所述待比較的序列中特定核苷酸位置^皮最頻繁地代表的核 苦酸)的啟動(dòng)子序列，構(gòu)成所述啟動(dòng)子的石咸基亞單位中的至少 一個(gè)、 ^尤選一些、最〗尤選全部。
術(shù)語"反應(yīng)條件"意指允許彼此間特異性相互作用的分子優(yōu)先 相互作用的反應(yīng)條件。反應(yīng)條件包括溫度、溶質(zhì)濃度、pH、離子濃 度等。嚴(yán)格的雜交條件是在核酸雜交時(shí)代表性的反應(yīng)條件。
術(shù)語"反應(yīng)基團(tuán)(反應(yīng)活性基團(tuán))"指的是利用特異性化學(xué)性 質(zhì)，在較大分子中能夠與另一個(gè)分子的反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)基 團(tuán)。
術(shù)語"單獨(dú)的"、"純化的"、"分離的"以及相似術(shù)語意指裝有 樣品的容器中含有的樣品的 一個(gè)或多個(gè)組分已經(jīng)與從所述容器中 存在的一個(gè)或多個(gè)其它4羊品組分物理地^皮移除，或者在其存在時(shí)進(jìn) 行稀釋。在分離或純化步驟中可^皮移除或稀釋的樣品組分包括蛋 白、糖類、脂類、抑制劑、非靶核酸以及未結(jié)合的探針分子。通過 耙捕獲步驟，結(jié)合于固定的捕獲探針上的靶核酸優(yōu)選在所述分離或 純化步驟過程中保留于樣品中。
27本文中，術(shù)語"種類"在多個(gè)環(huán)境中應(yīng)用，例如復(fù)合體種類、 靶分子種類、核苦酸種類，等等。每個(gè)環(huán)境中，所述術(shù)語指的是在 特定環(huán)境中提到的種類中一群化學(xué)上沒有差別的分子。例如，"復(fù) 合體種類"是一群復(fù)合體，具有相同的化學(xué)組成并因此具有相同質(zhì) 量。當(dāng)然，由于具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子中存在等位基因變異，特 定種類內(nèi)的分子可能質(zhì)量稍有差別，因此實(shí)際上所述特定分子種 類(例如復(fù)合體)的"質(zhì)量"代表一個(gè)小的質(zhì)量范圍。根據(jù)某些因 素，例如在特定分析中的多重化水平、所采用分析系統(tǒng)的每文感性等， 需要乂人同位素確定的亞單位(例如三^粦酸核糖核苷酸)合成復(fù)合 體以更加嚴(yán)格地確定所述特定復(fù)合體小的質(zhì)量范圍，因此增強(qiáng)從所 述樣品分析中得到的質(zhì)譜中出現(xiàn)質(zhì)量峰值的分辨率。
本文中，"穩(wěn)定的"指的是兩個(gè)分子(例如在其互補(bǔ)區(qū)上核 酸二聚體的《連)之間的相互作用足夠穩(wěn)定因此所述分子可以保存用 于預(yù)期目的或才喿作。例如，引物與其同源引物結(jié)合位點(diǎn)之間的"穩(wěn)
的反應(yīng)條件下進(jìn)行延伸。
短語"嚴(yán)格的雜交分析條件"、"雜交分析條件"、"嚴(yán)格的雜交 條件"、"嚴(yán)格的條件"以及相似語意指允許互補(bǔ)性核酸(例如寡 核苷酸或還含有其它區(qū)域的寡核苷酸的耙序列結(jié)合區(qū)以及具有與 其互補(bǔ)堿基序列的核酸)優(yōu)先雜交的反應(yīng)條件。嚴(yán)格的雜交分析條 件可能根據(jù)多種因素而變動(dòng)，包括所述核酸之間互補(bǔ)區(qū)的GC含量 以及長(zhǎng)度、所述互補(bǔ)性序列與所述樣品中可能存在的其它序列之間 的相似性程度。雜交條件包括溫度以及所述雜交試劑或溶液的組 成。
"亞單位"指的是較大分子的一部分。因此，聚合體由兩個(gè)或 多個(gè)亞單位組成。示例性亞單位包括單個(gè)氨基酸、石成基亞單位、DNA 或RNA中的核苷和用來合成核酸或寡核苷酸的單個(gè)核苷酸，以及可以用作例如寡核苦酸或肽合成中間產(chǎn)物的亞單位多聚體(例如， 包4舌兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多亞單^立例如核苦酸的分子)。在其它 環(huán)境下，如果寡核苷酸含有兩個(gè)不同區(qū)域例如把結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體 才莫板，所述不同區(qū)域中每一種均可以稱為所述寡核苷酸的亞單位。
"標(biāo)簽"是可被連接到另 一分子或被包括為其一部分的基團(tuán)， 性示例包括耙檢測(cè)試劑、切割底物以及復(fù)合體。
"耙結(jié)合部分(基團(tuán)，moiety )"指的是能特異性識(shí)別分子的分 子。能特異性識(shí)別分子的分子能夠與其它分子特異結(jié)合性相互作 用。具體而言，靶結(jié)合基團(tuán)是根據(jù)本發(fā)明的靶檢測(cè)試劑中能夠與靶 分子特異性相互作用并與其結(jié)合的部分。優(yōu)選的靶結(jié)合基團(tuán)由多核 香酸(例如寡核苦酸)和多肽(例如抗體和抗體片段)以及核酸適 體(適配體，aptamer)(即特異性結(jié)合于其它分子或以其它方式 與其相互作用的合成核酸分子，所述其它分子包括蛋白和小分子)， 以及小分子(即天然存在或合成的有機(jī)分子，分子質(zhì)量小于約 10,000Da，且特異性結(jié)合于感興趣生物分子種類(例如靶蛋白)或 以其它方式與其相互作用)。
術(shù)語"耙分子"或"耙"指的是其存在、缺乏或其豐度待確定 的分子。優(yōu)選的耙是生物分子包括多肽和核酸分子。
"耙核酸，，指的是含有把核酸序列的核酸分子，典型地，其序 列由核苷酸構(gòu)成。耙核酸可能為單鏈或雙鏈。在雙《連分子中，所述 鏈優(yōu)選在至少包括所述靶核苷酸序列的部分是分離的，以促進(jìn)特異 于所述特定靶核苷酸序列的靶檢測(cè)試劑的靶結(jié)合基團(tuán)雜交。利用"耙核酸序列"、"耙核苷酸序列"、"靶序列"或"靶區(qū)域"
芬酸或纟亥4唐4亥苷g交序列。
"靶序列結(jié)合區(qū)"指的是核酸分子例如寡核苷酸，其具有的石咸
基序列足夠互補(bǔ)于其耙核酸序列以形成例如寡核苷酸^^雜交體， 可在嚴(yán)格的雜交分析條件下用于檢測(cè)。典型地，靶序列結(jié)合區(qū)包括 至少6個(gè)石咸基亞單位，優(yōu)選6到500或1000個(gè)石咸基亞單位。
"轉(zhuǎn)錄單位"指的是編碼才艮據(jù)本發(fā)明的復(fù)合體或切割底物的分 子。轉(zhuǎn)錄單位在所述模板中用于合成根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合體。優(yōu)選復(fù) 合體的合成通過轉(zhuǎn)錄所述轉(zhuǎn)錄單位的復(fù)合體編碼區(qū)而實(shí)現(xiàn)。因此， 優(yōu)選的，轉(zhuǎn)錄單位至少包括一個(gè)功能性啟動(dòng)子和一個(gè)復(fù)合體編碼 區(qū)。
在本發(fā)明中，"、唯一的，，指的是以一種或多種可區(qū)分方式與所 述存在的其它分子種類不同的分子種類。就復(fù)合體而言，特定反應(yīng) 中產(chǎn)生的每個(gè)復(fù)合體種類與所述反應(yīng)中產(chǎn)生的其它復(fù)合體種類中 每一種相比優(yōu)選均是唯一的。因此，即使在一個(gè)特定反應(yīng)中存在的
全部復(fù)合體種類將要才艮據(jù)單個(gè)確定的特征(例如質(zhì)量)而加以分析， 每個(gè)復(fù)合體種類的質(zhì)量(或質(zhì)量范圍)將與存在的其它復(fù)合體種類 足夠不同，而使其可以在所述特定分析環(huán)境中被檢測(cè)和分辨。在靶 分子，"唯一的靶分子，，指的是可以與特定反應(yīng)中所述其它分子種 類的每一種區(qū)分開的靶分子種類。如人們所理解的，單個(gè)基因(或 包括核香酸連續(xù)i 爭(zhēng)距(優(yōu)選約10到約一百萬或更多核苷酸)的其 它遺傳位點(diǎn))可能含有多個(gè)位點(diǎn)可被不同的靶檢測(cè)試劑種類(所述 種類由于不同的革巴4全測(cè)基團(tuán)而4皮此區(qū)分，且優(yōu)選還由于編碼可區(qū)分 復(fù)合體種類的不同復(fù)合體模板種類)所獨(dú)立靶向。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明4是供用于有效分析樣品的試劑和方法，以確定其是否含 有一種或多種不同種類的輩巴分子。4安照本發(fā)明，樣品中一種或多種 特定靶分子種類的4企測(cè)是間接發(fā)生的，因?yàn)樗鰶_企測(cè)步驟不涉及直 接檢測(cè)所述把分子，相反，特定靶是通過檢測(cè)與之相關(guān)的復(fù)合體而 進(jìn)4亍沖企測(cè)。在本發(fā)明中，間4妄;險(xiǎn)測(cè)特定種類的耙分子通過在分析過 程中產(chǎn)生相應(yīng)的復(fù)合體種類而實(shí)現(xiàn)。因此，只要所述樣品中存在與
之相關(guān)的所述靶分子，復(fù)合體種類(species)即可用于4企測(cè)。
每個(gè)復(fù)合體種類均被設(shè)計(jì)成包括聚合的亞單位，可以產(chǎn)生具有 確定特征的分子，例如一種或多種確定的化學(xué)組成、確定的分子式 或確定的質(zhì)量、序列、長(zhǎng)度或結(jié)構(gòu)，可以使其在復(fù)雜混合物中被檢 測(cè)到，因此檢測(cè)到所述復(fù)合體表明所述靶分子存在于樣品中。為了 在分析過程中產(chǎn)生與靶分子相關(guān)的復(fù)合體，編碼所述預(yù)期復(fù)合體的 復(fù)合體模板(或其互補(bǔ)物)作為特異于所述特定種類靶分子的靶檢
測(cè)試劑的 一部分而提供。通過包括一種或多種與所述復(fù)合體模板相 關(guān)的耙結(jié)合基團(tuán)可將耙特異性傳遞至靶4企測(cè)試劑。因此，樣品中是
述樣品而形成試劑耙復(fù)合體來確定。在某些具體實(shí)施方式
中，在 產(chǎn)生復(fù)合體之前，去除那些尚未與其同源的靶分子(例如，因?yàn)樗?述靶不存在于所述樣品中、所述靶分子存在但其濃度由于靶檢測(cè)分 子過量而造成結(jié)合的飽和，等等)發(fā)生相互作用的靶檢測(cè)分子是比 較有益的。在其它具體實(shí)施方式
中，特異于特定靶的完整靶;險(xiǎn)測(cè)試 劑可能僅在存在特定靶分子種類時(shí)形成，因此限制了任何可能通過 中間純化、提取或分離步驟而獲得的優(yōu)勢(shì)。
如果所述樣品中存在靶分子，所述靶檢測(cè)試劑的靶結(jié)合基團(tuán)將 與之結(jié)合。其后，使用所述包括復(fù)合體編碼區(qū)的復(fù)合體模板引導(dǎo)所 述被編碼的復(fù)合體(或包括所述復(fù)合體的較大前體)的生成。由于特定復(fù)合體相關(guān)于特定靶分子，并因此表明其在樣品中存在，所以 檢測(cè)到所述復(fù)合體間接表明相應(yīng)的靶分子存在于所述樣品中。另 外，因?yàn)樘囟◤?fù)合體種類具有確定的特征，可使其與分析中還可能 產(chǎn)生的其它復(fù)合體種類區(qū)分開，可以在單個(gè)分析中才企測(cè)到多個(gè)不同
復(fù)合體種類，因此對(duì)于多種不同的靶分子種類(例如核酸分子、 多肽、脂類和糖類)特別是靶生物分子，可進(jìn)行復(fù)雜樣品(例如生 物樣品)的多重分析
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及可取得專利的靶^r測(cè)試劑，其中 每一種均包括靶結(jié)合基團(tuán)和編碼復(fù)合體的復(fù)合體模板或其互補(bǔ)物， 檢測(cè)到復(fù)合體間接表明存在與所述特定復(fù)合體相關(guān)的特定靶分子。 通常，靶;險(xiǎn)測(cè)基團(tuán)包括特異于靶分子的分子，因此在分析中，所述 耙;險(xiǎn)測(cè)試劑可以特異性結(jié)合于或以其它方式與所述靶分子反應(yīng)。在 某些實(shí)施例中，所述靶結(jié)合基團(tuán)包括多肽，優(yōu)選特異于所述靶分子 的抗體、抗體片段、受體、或受體的配體。在其它實(shí)施例中，所述
分子(例如寡核苷酸)。在另外的實(shí)施例中，所述靶結(jié)合基團(tuán)包括 適配體或小分子。
本發(fā)明的靶檢測(cè)試劑中除了包括耙結(jié)合基團(tuán)，所述耙檢測(cè)試劑 還包括至少一種復(fù)合體模板或其互補(bǔ)物，其可與所述靶結(jié)合基團(tuán)直 接或間接(例如通過連接子)相鍵接。如人們所理解的，復(fù)合體模 板至少編碼一個(gè)復(fù)合體，而檢測(cè)到復(fù)合體則間接表明所研究的樣品 中存在特定靶分子種類。在某些具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體模板編碼 的切割底物是包括復(fù)合體以及至少一個(gè)其它亞單位的分子，所述亞 單位可以/人所述切割底物上釋放以得到復(fù)合體。在優(yōu)選的具體實(shí)施 方式中，復(fù)合體模板為核酸分子，特別是寡核苷酸。
復(fù)合體可以通過任何恰當(dāng)?shù)倪^程乂人復(fù)合體模板產(chǎn)生，所述過程 允許利用所述復(fù)合體模板使亞單位聚合，以引導(dǎo)復(fù)合體(或切割底物)的產(chǎn)生。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體模板(或其互補(bǔ)物) 編碼轉(zhuǎn)錄單位。功能性轉(zhuǎn)錄單位包括的啟動(dòng)子區(qū)與復(fù)合體編碼區(qū)可 操作地連接。從所述轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生復(fù)合體，或者如果所述 復(fù)合體編碼區(qū)編碼其它核苦酸，則可產(chǎn)生切割底物，而隨后釋方文復(fù) 合體。在其它具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體(或切割底物)通過另外的 過程乂人所述復(fù)合體才莫^反產(chǎn)生，例如通過延伸反應(yīng)(例如引物延伸)， 其可由酶促催化或不需要酶促催化。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一類可耳又得專利的分子，命名 為復(fù)合體，在各種化學(xué)分析中非常有用。具體而言，檢測(cè)到復(fù)合體 間接表明所述與其相關(guān)的靶分子(包括生物靶分子)存在于樣品中。 與以前報(bào)道的質(zhì)量標(biāo)簽及其相似物不同，在特定化學(xué)分析過程中，
所述耙一企測(cè)試劑的耙;險(xiǎn)測(cè)基團(tuán)與所述靶分子反應(yīng)或與其結(jié)合之后， 復(fù)合體被合成。其后，復(fù)合體被合成，并根據(jù)其確定的特征例如化 學(xué)組成、分子式、質(zhì)量(例如通過質(zhì)譜分析)、長(zhǎng)度(例如通過電 泳遷移率)、大小(例如通過層析)、亞單位序列(例如通過與寡核
苦酸探針的雜交)等利用恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。所述復(fù)合體的 確定特征可將其與其它復(fù)合體種類區(qū)分開。當(dāng)然，因?yàn)橛脕砗铣蓮?fù) 合體的亞單位的序列和身份(identity)可能不依賴于與其相關(guān)的耙 分子，因此亞單位可以通過其它標(biāo)準(zhǔn)選4奪，例如聚合的難易程度、 費(fèi)用、穩(wěn)定性、檢測(cè)模式等。為了這個(gè)原因，復(fù)合體種類可以進(jìn)行 -沒計(jì)，以優(yōu)化種類之間的差異，有利于例如分辨具體的多重分析過 程中可能同時(shí)產(chǎn)生的多個(gè)復(fù)合體種類。
如人們所理解的，采用復(fù)合體指示樣品中存在特定靶分子的分 析，大大簡(jiǎn)化了分析樣品所需要的生化步驟。而且，因?yàn)樗鰪?fù)合 體的確定特征可以加以設(shè)計(jì)而用于特異性檢測(cè)系統(tǒng)，多個(gè)不同的復(fù) 合體種類可以在單個(gè)分析中產(chǎn)生并分辨，促進(jìn)復(fù)雜樣品(例如生物 樣品)的多重分析。利用耙檢測(cè)試劑的復(fù)合體模板部分作為引導(dǎo)，可從亞單位合成 復(fù)合體(以及切割底物)。如果需要，在包括入任何分析前，用于 產(chǎn)生復(fù)合體的單體亞單位可以組裝成二聚體、三聚體以及其它中間 亞單位聚合體。任何情況下，復(fù)合體模板引導(dǎo)亞單位種類依次加成 到所述正形成的分子上。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體模板包 括具有確定核苷序列的石咸基亞單位聚合體。因此，從這種才莫才反分子 產(chǎn)生的復(fù)合體將具有亞單位(例如，核苷)的相應(yīng)序列，其根據(jù)所 述復(fù)合體才莫板進(jìn)行排列。核苷和核苷酸代表用于復(fù)合體合成的特別 優(yōu)選的亞單位種類，所述復(fù)合體由含有核酸堿基的亞單位構(gòu)成。實(shí)
際上，當(dāng)復(fù)合體/人三石粦酸核香酸(即具有三^N臾基團(tuán)的核苦酸通 過酯鍵連接到糖基的C-5，位置)合成時(shí)，優(yōu)選利用恰當(dāng)?shù)拿复呋?合成。對(duì)該目的特別優(yōu)選的有用酶是DNA確定的RNA聚合酶，例 如T7、 T3以及SP6 RNA聚合酶。例如，對(duì)于通過引物延伸,人引物 產(chǎn)生的復(fù)合體，優(yōu)選的酶包括所述DNA聚合酶Taq、 Klenow片段、 T4、 T7以及E.coli DNA聚合酶I以及逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶。
在其它具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體可能由氨基酸或糖類亞單位構(gòu) 成。在采用氨基酸的具體實(shí)施方式
中，其序列一般由從復(fù)合體模板 (或從之書f生的核酸產(chǎn)物)轉(zhuǎn)錄的RNA分子指導(dǎo)。因此，在這些具體實(shí)施方式
中，從所述復(fù)合體模板(或以其它方式產(chǎn)生)轉(zhuǎn)錄的 RNA作為隨后生成所述復(fù)合體的中間體(即"復(fù)合體中間體")。例 如，轉(zhuǎn)錄后，mRNA可以,皮翻i奪而產(chǎn)生基于肽的復(fù)合體或4交大前體， 復(fù)合體可以隨后從該4交大前體釋放(例如，通過恰當(dāng)?shù)奈锢?、化學(xué) 或酶促技術(shù))并利用適宜的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。在某些具體實(shí)施方 式中，所述復(fù)合體中間體是乂人乂人復(fù)合體才莫才反轉(zhuǎn)錄而來的mRNA翻i奪 出來的肽，優(yōu)選所述肽在體外翻i奪反應(yīng)中乂人mRNA才莫—反合成。
在還有的其它具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體從復(fù)合體才莫板非酶促地 基亞單位。在這種具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體一4殳通過初始聚合物的
34依次延伸而合成，據(jù)此，每一步中， 一個(gè)新的亞單位被聚合到正形 成的聚合物的末端殘基的反應(yīng)基團(tuán)上。通常，這種合成通過多輪去 保護(hù)及偶聯(lián)而進(jìn)行，以確保全部亞單位整合入分析中采用的乾4企測(cè) 試劑所編碼的最大的可能復(fù)合體中。
根據(jù)特定靶檢測(cè)試劑中包括的復(fù)合體模板，某些復(fù)合體可能最 初作為較大前體的一部分而產(chǎn)生，所述前體在復(fù)合體檢測(cè)前需要進(jìn) 一步力口工。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及這種前體。這種前體， 命名為"切割底物"，包括至少兩種不同的單體亞單位種類并含有
至少兩個(gè)區(qū)i或復(fù)合體和沖企測(cè)前可乂人所述復(fù)合體分離的另 一 個(gè)區(qū) 域。當(dāng)采用切割底物時(shí)，優(yōu)選所述復(fù)合體部分缺乏至少一個(gè)存在于 專交大前體分子中的單體亞單位種類。可替代的，切割底物或多個(gè)切 割底物，可能包括一個(gè)元件例如肽鏈內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)。無論哪種 情況，優(yōu)選所述切割底物的末端部分^皮切割以釋力文所述復(fù)合體，隨 后就可以纟企測(cè)其存在。復(fù)合體可以乂人切割底物釋》欠，例如通過4匕學(xué)、 物理或酶促切割。優(yōu)選的，所述切割是亞單位特異的，且靶向于所 述切割底物的復(fù)合體部分所缺乏的一種或多種亞單位種類。復(fù)合體 從專交大前體的分離確保在特定分析中產(chǎn)生的復(fù)合體表現(xiàn)出所述確 定特征，使其隨后被一全測(cè)并與相應(yīng)靶分子發(fā)生相關(guān)作用。從切割底 物切割以產(chǎn)生復(fù)合體的區(qū)域包括單體亞單位的至少 一部分。當(dāng)所述 切割區(qū)域包括多于一個(gè)單體亞單位時(shí)，所述亞單位可能例如為同種 或異種，其中至少一個(gè)其種類不同于所述復(fù)合體中存在的單體亞單
位種類。在其它實(shí)施例中，所述切割區(qū)域可能含有一個(gè)或多個(gè)亞單 位，其種類與構(gòu)成所述復(fù)合體的種類相同。在其它具體實(shí)施方式
中， 所述復(fù)合體不作為4交大前體的一部分而生成。反之，,人所述復(fù)合體 模板(或復(fù)合體中間體)合成可直接得到所述特定復(fù)合體，不存在 任《可在一企測(cè)前必須去除的部分。
典型的，復(fù)合體包括1到約1,000個(gè)單體亞單位(例如單個(gè) 堿基亞單位(特別是核糖核苦酸)、氨基酸等)，盡管由幾種單體亞單位構(gòu)成的較大亞單位也可以采用，特別是當(dāng)采用非酶促的聚合化
學(xué)方法時(shí)。特別優(yōu)選包括約3至約10、 20、 50及100個(gè)單體亞單 位的復(fù)合體。在許多具體實(shí)施方式
中，特別是那些其中多個(gè)復(fù)合體 種類將于檢測(cè)前從相應(yīng)切割底物釋放的實(shí)施例，優(yōu)選所述復(fù)合體區(qū) 域設(shè)計(jì)成包含少于可能用于特定反應(yīng)的全部亞單位種類。例如，當(dāng) 切割底物從核糖核苷S臾酶促合成時(shí)，優(yōu)選所述復(fù)合體部分包括僅一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)亞單位(這里為核外唐核苷酸)種類，而所述切割底 物的其它部分含有一個(gè)或多個(gè)亞單位，其中至少一種不存在于所述 復(fù)合體中且因此可以用來將所述復(fù)合體從所述切割底物釋放。當(dāng) 然，在某些采用切割底物的具體實(shí)施方式
中，所述復(fù)合體不必含有 少于所述前體所包含的特定亞單位，因?yàn)橐部梢圆捎靡蕾囉趦煞N或 更多特定亞單位的存在以實(shí)現(xiàn)釋放的技術(shù)。例如，基于肽的切割底 物可以被設(shè)計(jì)成包含被蛋白酶特異切割的氨基酸序列。在這種具體 實(shí)施方式中，蛋白水解性切割將所述復(fù)合體從所述切割底物的其余 部分分離。
由于單個(gè)復(fù)合體種類纟皮改造成具有至少一個(gè)確定特^正(例如確 定的化學(xué)組成、分子式、質(zhì)量或質(zhì)量范圍、長(zhǎng)度、大小、結(jié)構(gòu)等) 以允許一種復(fù)合體種類與分析中可能產(chǎn)生的其它所有復(fù)合體種類 區(qū)分開，因此，優(yōu)選所述特定復(fù)合體種類的確定特征可以-皮精確定 義。例如，在某些具體實(shí)施方式
中所述確定特征是質(zhì)量，則質(zhì)量的 精確定義指所述種類的質(zhì)量，更可能是質(zhì)量范圍(由于構(gòu)成所述特 定復(fù)合體種類分子的原子之間同位素的差異)較窄。為了將所述復(fù) 合體種類的質(zhì)量范圍降到最小，如在采用基于質(zhì)量才企測(cè)系統(tǒng)(例如 質(zhì)鐠分析)的高度多重化分析中所特別優(yōu)選的，所述復(fù)合體(或切 割底物)可以利用同位素確定的亞單位而產(chǎn)生。當(dāng)然，為了獲得相 當(dāng)?shù)脑噭凰卮_定的亞單位可能花費(fèi)4交高，其中所述試劑由還 未富集或損耗的特定同位素原子構(gòu)成，因此在這種具體實(shí)施方式
中，優(yōu)選所述切割底物包括除所述復(fù)合體區(qū)域之外盡量少的亞單位(優(yōu)選不多于約100個(gè)，優(yōu)選少于約25個(gè)并優(yōu)選10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2或1個(gè))。
因?yàn)閺?fù)合體才艮據(jù)亞單位序列和/或組成進(jìn)行設(shè)計(jì)，以提供一種或 多種確定特征(例如確定的質(zhì)量、化學(xué)組成、分子式或質(zhì)量范圍、 長(zhǎng)度、序列和/或結(jié)構(gòu))，如果需要，可以在一個(gè)特定分析中產(chǎn)生多 種不同的復(fù)合體種類?？梢杂糜谝粋€(gè)特定分析中的復(fù)合體最大數(shù)量 將依賴于多個(gè)因素，包括所述復(fù)合體的亞單位組成、所述復(fù)合體的 部分或全部是否為同<立素確定的(4巴質(zhì)量作為所述確定特4正的具體 實(shí)施方式)、所采用的檢測(cè)系統(tǒng)、可通過例如所采用的檢測(cè)系統(tǒng)精 確檢測(cè)的質(zhì)量范圍(4巴質(zhì)量作為所述確定特征的具體實(shí)施方式
)、 所采用檢測(cè)劑的靈敏度、用來分析所得數(shù)據(jù)的軟件、所分析的靶分 子種類的數(shù)量，等等。
在某些優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，質(zhì)量是用來區(qū)分復(fù)合體種類的 確定特征。因此在這些具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體一般利用基于質(zhì)量 的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，其中優(yōu)選質(zhì)語分析。盡管設(shè)想任何已知的質(zhì) 譜分析法均可用來檢測(cè)復(fù)合體，優(yōu)選的方法是直接激光解吸電離質(zhì) 譜分析(無基質(zhì))、電噴霧離子化質(zhì)譜分析、二次中性粒子質(zhì)譜分 析，其中優(yōu)選二次離子質(zhì)譜分析。特別優(yōu)選的方法是基質(zhì)輔助激光 解吸電離質(zhì)語分析。在其它優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，所述確定特4正 是復(fù)合體長(zhǎng)度。因此，復(fù)合體種類可以通過尺寸分離(size separation ) l支術(shù)而區(qū)分，其優(yōu)選的實(shí)例包括電泳和色i普分析法。在 其它具體實(shí)施方式
中，所述確定特征是化學(xué)組成。
如人們所理解的，可設(shè)計(jì)多個(gè)不同的復(fù)合體種類并在復(fù)合體模 板庫中編碼，根據(jù)某些因素例如將在特定分析中采用的檢測(cè)系統(tǒng)、 在一個(gè)特定分析中可^皮才企測(cè)的靶分子凄t量(以及因此的多重化水 平)、同位素確定的亞單位是否可用以合成復(fù)合體(在采用質(zhì)量檢 測(cè)以檢測(cè)復(fù)合體的分析中)等，在特定反應(yīng)中的復(fù)合體模板數(shù)量是不同。在特定的文庫中，優(yōu)選所述不同復(fù)合體模板種類被設(shè)計(jì)用來 引導(dǎo)產(chǎn)生復(fù)合體種類，其很容易由所采用的特定檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分 辨。在許多具體實(shí)施方式
中，所述復(fù)合體模板將編碼切割底物。因 為包括特定復(fù)合體的亞單位序列不依賴于靶身份，因此由于所述特
定耙;險(xiǎn)測(cè)試劑的靶結(jié)合基團(tuán)決定靶特異性，同 一組復(fù)合體可以用來 檢測(cè)不同組的靶分子。因此，不同的耙斥企測(cè)試劑文庫可以利用單個(gè) 連4妻于不同靶結(jié)合基團(tuán)文庫的復(fù)合體才莫板文庫或其部分進(jìn)行組裝。 如人們所理解的，對(duì)于特定的把檢測(cè)試劑文庫，只要每種靶檢測(cè)試 劑種類的組分已知，就能使復(fù)合體種類與靶相關(guān)，因此檢測(cè)由特定 耙才全測(cè)試劑編碼的復(fù)合體間接表示樣品中存在可被所述靶檢測(cè)試 劑識(shí)別的靶。復(fù)合體才莫板，單獨(dú)或裝配成耙4企測(cè)試劑，均可進(jìn)4亍包 裝并作為試劑盒出售。這種試劑盒可能包括多個(gè)復(fù)合體模板或靶檢 測(cè)試劑種類。當(dāng)包裝多個(gè)不同種類時(shí)，在某些具體實(shí)施方式
中可以
開包裝。而且，優(yōu)選將復(fù)合體才莫板以及靶;險(xiǎn)測(cè)試劑制備成獨(dú)立、純 ^f匕的^式劑，且其可以液體或固態(tài)形式4諸存。
本發(fā)明的另外 一 個(gè)方面涉及利用本發(fā)明的復(fù)合體4莫板生成復(fù) 合體的方法。在某些方法中，靶4企測(cè)試劑的靶結(jié)合基團(tuán)結(jié)合于其相 應(yīng)的靶分子而形成試劑靶復(fù)合物后，所述復(fù)合體模板用來生成由 其復(fù)合體編碼區(qū)編碼的復(fù)合體(或切割底物)。在某些具體實(shí)施方 式中，所述靶檢測(cè)試劑還可以包括一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基團(tuán)，所述基團(tuán) 可用來/人該分析中其它組分純化、^是取或分離試劑耙復(fù)合物(以 及未反應(yīng)的耙檢測(cè)試劑分子)包括還未與耙分子反應(yīng)的靶檢測(cè)試 劑。
在某些具體實(shí)施方式
中，所述靶檢測(cè)試劑包括復(fù)合體模板的互 補(bǔ)物，所述復(fù)合體模板在復(fù)合體生成之前產(chǎn)生。在某些優(yōu)選的實(shí)施 例中，所述復(fù)合體模板包括轉(zhuǎn)錄單位，而且由此編碼的復(fù)合體通過 利用RNA聚合酶(優(yōu)選DNA依賴的RNA聚合酶)轉(zhuǎn)錄所述復(fù)合體編碼區(qū)而生成，其中所述RNA聚合酶可以指導(dǎo)與所述轉(zhuǎn)錄單位 中包括的特定啟動(dòng)子功能性相關(guān)的核酸轉(zhuǎn)錄。在不涉及轉(zhuǎn)錄的其它 具體實(shí)施方案中，例如引物延伸或利用所述復(fù)合體^^莫板指導(dǎo)的亞單 位聚合，提供恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件以生成復(fù)合體(或切割底物)。在復(fù) 合體才莫板編碼切割底物的具體實(shí)施方式
中，所述切割底物產(chǎn)生后，
所述復(fù)合體優(yōu)選與包含于切割底物中^f旦不構(gòu)成復(fù)合體一部分的其 它亞單位發(fā)生分離。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的，本發(fā)明提高了方法精確度、 效率以及可信度，所述方法設(shè)計(jì)用來間接檢測(cè)樣品中存在的一種或 多種類靶分子，特別是在復(fù)雜樣品中，例如為了診斷或預(yù)后篩查的 目的而從病人獲得的生物樣品。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明實(shí)施的分析采用一 個(gè)或多個(gè)對(duì)照分析，以降低假陰性或假陽性結(jié)果的可能性。本發(fā)明 的方法還可以快速實(shí)施(例如，在短至2到3個(gè)小時(shí)內(nèi))且為經(jīng)濟(jì) 有效的，因?yàn)椴恍枰獙I(yè)化試劑(除了根據(jù)本發(fā)明的靶檢測(cè)試劑之 外)。同樣的，其可以在生物科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。因此，本發(fā)明 的其它方面涉及本發(fā)明方法的應(yīng)用。如人們所理解的，所述方法可 以用于多種目的，包括「i貪斷(例如出生前或出生后)遺傳疾病、 對(duì)疾患或病癥(例如肥胖、動(dòng)脈硬化癥或癌癥)的遺傳易感性、病 原體(例如病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌)感染，或者4是供關(guān)于身份、 遺傳性(例如親子關(guān)系)、相容性(例如為了組織移植目的進(jìn)行HLA 表型分型)或?qū)ν扑]藥物或治療方案的反應(yīng)等方面的信息。
上述本發(fā)明的概述是非限定性的，而且本發(fā)明的其它特征和優(yōu) 勢(shì)將在下面的圖形、本發(fā)明的詳細(xì)描述以及權(quán)利要求中變得顯而易 見。


下面的圖形構(gòu)成了本說明書的一部分，將其包括在內(nèi)是為了進(jìn) 一步闡述本發(fā)明的某些方面以及具體實(shí)施方式
。通過參考這些圖形 中的一個(gè)或多個(gè)以及對(duì)本文中給出的具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述，可 以更好的理解本發(fā)明。
圖1以圖解方式闡釋了根據(jù)本發(fā)明的靶檢測(cè)試劑的一般結(jié)構(gòu)。
如所示出的，耙檢測(cè)試劑包括連接于耙結(jié)合基團(tuán)(TBM)的復(fù)合體 模板(CT)。 CT-TBM連接基團(tuán)(X)可能直接位于每個(gè)復(fù)合體模 板與耙結(jié)合基團(tuán)部分之間或通過位于所述復(fù)合體與靶結(jié)合基團(tuán)之 間的連4姿分子(或一組分子)的方式構(gòu)成。優(yōu)選位于不同組分之間 的鍵是共價(jià)的。
圖2以圖解方式闡釋了本發(fā)明中靶檢測(cè)試劑的復(fù)合體模板的一 般結(jié)構(gòu)。在這個(gè)代表性的圖解中，所述復(fù)合體模板包括一個(gè)復(fù)合體 編碼區(qū)以及一個(gè)終止子，然而可以理解終止子區(qū)是可選元件。當(dāng)所 述終止子包括在內(nèi)時(shí)，就可以嚴(yán)格限制被編碼的復(fù)合體的終端。終 止子區(qū)的實(shí)例包括那些包含鏈終止亞單位(以致其它亞單位不能加 成到初始復(fù)合體、切割底物或除了《連終止亞單位以外的其它中間 體，例如雙脫氧核苦酸)、切割石咸基等。優(yōu)選的，包4舌纟冬止子區(qū)的 復(fù)合體才莫板文庫的每一個(gè)成員將編碼相同的終止子，從而促進(jìn)通過
例如切割堿基的切割而將所述終止子區(qū)去除。復(fù)合體模板由可利用 恰當(dāng)化學(xué)方法聚合的亞單位構(gòu)成，包括酶促過程。所述復(fù)合體模板 的亞單位作為^^莫板，用于產(chǎn)生具有確定特征的復(fù)合體。
合體才莫板。在這些具體實(shí)施方式
中，任選所述復(fù)合體模板可能包括 一個(gè)終止子以及一個(gè)位于所述復(fù)合體編碼區(qū)之前的區(qū)域，在圖中標(biāo) 明為"Y"。當(dāng)所述Y區(qū)包4舌在內(nèi)時(shí)，其也包4舌一個(gè)或多個(gè)亞單4立，例如堿基亞單位。如果存在Y區(qū)，優(yōu)選的，這些額外的亞單位屬于 與所述復(fù)合體編碼區(qū)亞單位相同的種類(例如，當(dāng)所述復(fù)合體編碼 區(qū)包括^咸基亞單位時(shí)，則為石威基亞單位)。如人們所理解的，在不 同復(fù)合體模板中，復(fù)合體界定區(qū)之間的差異將彼此區(qū)分開，最終將 所述由此編碼的不同復(fù)合體種類4皮此區(qū)分開。
圖4以圖解方式展示了根據(jù)本發(fā)明建立在圖3舉例說明基礎(chǔ)上 的一類優(yōu)選復(fù)合體模板。這里，描述了其它元件，啟動(dòng)子-或引物結(jié) 合位點(diǎn)編碼區(qū)(或既包括引物結(jié)合位點(diǎn)又包括啟動(dòng)子的區(qū)域)。在 那些所述復(fù)合體才莫^反編碼復(fù)合體的具體實(shí)施方式
中，如有必要所述 才莫才反還編碼轉(zhuǎn)錄開始時(shí)最終所需的其它序列(這里，標(biāo)明為"Y" 區(qū))。
圖5闡述了用于根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合體模板的分子式優(yōu)選的具體 實(shí)施方式，與圖3中示出的那些類似，區(qū)別在于在本圖中所述復(fù)合 體界定區(qū)限定為1到5個(gè)由分子式AxCyGz確定的石咸基亞單位序列 實(shí)例，其中x為0到5，而y和z每一種均獨(dú)立;也為0到10。
圖6闡釋了一個(gè)代表性的實(shí)例，說明來自于已經(jīng)存在的組分庫 中成員的多個(gè)不同靶檢測(cè)試劑種類的組裝。如在本圖中圖示的，單 個(gè)復(fù)合體才莫板文庫包含復(fù)合體才莫板種類1、 2、 3直到n(CTl、 CT2、 CT3直到CTn)，耙結(jié)合基團(tuán)文庫1包含x個(gè)種類的靶結(jié)合基團(tuán)(編 號(hào)為TBM-1、 TBM-2、 TBM-3直到TBM-x )，其中每一種輩巴向于不 同的耙核酸(例如不同的遺傳變異)，靶結(jié)合基團(tuán)文庫2包含y個(gè) 種類的輩巴結(jié)合基團(tuán)(編號(hào)為TBM-1、 TBM-2、 TBM-3直到TBM-y )， 其中每一種輩巴向于不同的多肽種類例如疾病相關(guān)蛋白。至于明卩個(gè)草巴
結(jié)合基團(tuán)包括在示出的5個(gè)靶檢測(cè)試劑種類中，依賴于特定分析中 帶檢測(cè)的耙分子。這里，所述耙分子種類中四種是核酸，第5種則 是多肽。在決定哪種靶結(jié)合基團(tuán)將被采用(根據(jù)待分析的特定靶) 之后，則決定使用哪種復(fù)合體模板，并決定是否采用連接子(L)將特定復(fù)合體模板連接到其所歸屬的靶結(jié)合基團(tuán)上。然后，所述5 種檢測(cè)試劑(TDRl-5)被組合。由于單個(gè)復(fù)合體物種的確定特征不 依賴于特定靶的特性，復(fù)合體模板可以與靶結(jié)合基團(tuán)組合，而不考 慮靶序列、結(jié)構(gòu)等。然而，將特定復(fù)合體模板以及特定靶結(jié)合基團(tuán) 裝入所述靶^r測(cè)試劑，得到的復(fù)合體則與特定靶相關(guān)，反之亦然。
圖7以圖解方式闡釋了根據(jù)本發(fā)明復(fù)合體模板的幾種特別優(yōu)選具體實(shí)施方式
。在這些具體實(shí)施方式
的每一種中，所述復(fù)合體模板 編碼啟動(dòng)子(在三種復(fù)合體模板中為T7啟動(dòng)子，而在其它三種復(fù) 合體模板中為SP6啟動(dòng)子)、轉(zhuǎn)錄起始密碼子、復(fù)合體特異區(qū)(即 多個(gè)復(fù)合體種類中，經(jīng)改造可使所述復(fù)合體種類在所述特定分析的 檢測(cè)階段被區(qū)分開的區(qū)域)以及切割堿基。這種復(fù)合體模板及其編 碼的復(fù)合體，適用于極高水平的多重化、特別是與MALDI檢測(cè)系 統(tǒng)偶聯(lián)時(shí)。本圖闡釋的具體實(shí)施方式
中，每種復(fù)合體包括1到3種 不同的，其中所述切割石咸基包含核苷酸亞單位并未出現(xiàn)在所述復(fù)合
體區(qū)中。在每種復(fù)合體，k、 x、 y、 z是獨(dú)立選擇的整數(shù)，其范圍為 0到1000或更多，典型的0-100，伊乙選0-50,可理解在特定的文庫 中每種復(fù)合體模板種類(及由此編碼的復(fù)合體)的復(fù)合體特異區(qū)將 與所述文庫中其它種類的復(fù)合體特異區(qū)不同。本圖還闡釋了，在某 些優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，得到的復(fù)合體可以被設(shè)計(jì)成包含質(zhì)量修 飾的亞單位(這里，以曱基化C殘基代表性闡釋，"Cme，，)。
圖8描述了根據(jù)本發(fā)明的一組靶檢測(cè)試劑種類，其中每一種包 括第一和第二寡核苷酸。如本實(shí)施例所示，兩種第一寡核苷酸可以
用來區(qū)分基因組DNA中的單核苷酸轉(zhuǎn)變(即把核酸中特定核苷 酸位置的A或G之間的差異)。哪種或哪些等位基因(含有A或G ) 存在于特定樣品中可以通過將所述第二寡核苷酸的5，亞單位連4妄 到第一寡核苷酸3，亞單位而確定，后者互補(bǔ)于含有A或G的等位 基因。當(dāng)所述第一和第二寡核苷酸相連時(shí)(例如，通過連接)，得 到的耙檢測(cè)試劑可以利用互補(bǔ)于所述靶檢測(cè)試劑中存在的引物結(jié)合位點(diǎn)(標(biāo)明為"普適引物2"和"普適引物l")的普適引物對(duì)來擴(kuò)增。
圖9A示出的^^莫擬質(zhì)譜，是通過利用例如線性軸向TOF質(zhì)譜分 析檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的分析中所產(chǎn)生的復(fù)合體而獲得的。如在本代表 性實(shí)施例中示出的，85種易于區(qū)分的復(fù)合體(其分子式、長(zhǎng)度以及 質(zhì)量在圖9B中示出)可以/人具有標(biāo)準(zhǔn)的或天然的同^f立素分布的核 壽唐核*酸而合成。在本示例性文庫中示出的復(fù)合體種類可以通過分 子式(rAxrGy)zrC代表，其中z在3-30之間，且z=x+y。這些復(fù)合體 種類包括rA和rG亞單位中的一種或兩種，且每個(gè)種類均包括切割 石威基(這里，在每種復(fù)合體3，-末端為單個(gè)rC，其切割可以通過例 如RNase A消化而實(shí)現(xiàn))?；赗NA的復(fù)合體如在本實(shí)施例中描述 的，例如，可以通過在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的切割才莫板而生成。 如所描述的，這里闡述的85個(gè)成員的復(fù)合體庫經(jīng)i殳計(jì)用于通過線 性軸向TOF質(zhì)語分析的檢測(cè)，所利用的質(zhì)譜窗在2500 Da到10000 Da之間，450質(zhì)量分辨率(mr)為1500 Da, 650為4000 Da, 850 為6000 Da。 i殳計(jì)所述文庫時(shí)，考慮鹽加成物的位置(Na和K)，且 所述庫經(jīng)設(shè)計(jì)而排除了某些復(fù)合體，因?yàn)槠渌哂宣}加成物的質(zhì)量 而與其它復(fù)合體種類過于類似可能引起對(duì)結(jié)果的曲解。也考慮了雙 電荷質(zhì)量信號(hào)，并在設(shè)計(jì)階段即將那些可能因此而具有令人混淆的 質(zhì)量的復(fù)合體種類排除在外。
圖10闡述了一類耙4全測(cè)試劑，其中所述靶結(jié)合基團(tuán)包4舌抗體， 所述抗體與所述復(fù)合體模板相連。這種鍵可能涉及到連接子，優(yōu)選 為共價(jià)的。另外也示出了具體實(shí)施方式
，其中所述靶^r測(cè)試劑編碼 一個(gè)(圖B)或兩個(gè)(圖C)引物結(jié)合位點(diǎn)，所述位點(diǎn)可以用來在 生成所述編碼復(fù)合體(或切割(分裂，cleavage)底物)之前擴(kuò)增 其鄰近的復(fù)合體模板。
4具體實(shí)施例方式
寬泛地說，本發(fā)明提供的方法用于間接檢測(cè)樣品(例如生物樣 品)中的一個(gè)或多個(gè)特定靶分子種類，例如特定多肽或核酸種類， 通過檢測(cè)與所述靶分子種類特異性相關(guān)的復(fù)合體而間接檢測(cè)特定 種類的靶分子。復(fù)合體為線性聚合物，由亞單位特別是堿基亞單位
板而生成。為了幫助在單個(gè)分析中平行分析多個(gè)靶分子種類，復(fù)合 體種類經(jīng)設(shè)計(jì)可彼此區(qū)分。單獨(dú)識(shí)別可通過一種或多種確定的特征 而實(shí)現(xiàn)，所述特征在復(fù)合體種類之間不同?？杀淮_定的復(fù)合體特征 包括分子質(zhì)量、亞單位序列和長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)、以及任何其它可經(jīng)設(shè)計(jì) 而區(qū)分不同種類的分子特征。4艮據(jù)所述復(fù)合體特定的確定特征，可 采用恰當(dāng)?shù)南到y(tǒng)用于復(fù)合體檢測(cè)。
本發(fā)明的復(fù)合體有益于間接檢測(cè)大量靶分子的存在，其中特別 優(yōu)選生物靶分子?？赏ㄟ^復(fù)合體表示其在樣品中存在的生物分子的 代表性實(shí)例包括基因序列檢測(cè)、等位基因檢測(cè)、等位基因的變異檢 測(cè)、非編碼核苷酸序列檢測(cè)、基因或蛋白序列內(nèi)的突變檢測(cè)、金屬 才企測(cè)、毒素才全測(cè)、多肽4企測(cè)、#唐類4企測(cè)和脂類才全測(cè)。
下面的描述從討論代表性的樣品制備技術(shù)開始，隨后是對(duì)本發(fā) 明的試劑和方法進(jìn)行非限定性以及代表性的詳細(xì)描述。
A.才羊品；纟羊品制備
本發(fā)明適用于對(duì)單個(gè)樣品中 一個(gè)或多個(gè)耙分子同時(shí)進(jìn)行高效 檢測(cè)。可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行分析的樣品包括環(huán)境樣品，其可能包括或 不包括生物材料。特別優(yōu)選的樣品是已知或懷l^其含有感興趣生物 分子種類的生物樣品。用于分析的樣品可從任何恰當(dāng)來源獲得。獲 得樣品后，利用任何恰當(dāng)技術(shù)進(jìn)行處理，使所述靶分子能夠被檢測(cè)，如果其存在于所述樣品或其一部分中，所述部分易于與^4居本發(fā)明
的耙4企測(cè)試劑相互作用。
在含有一種或多種感興趣把分子的生物樣品中，其中感興趣革巴 分子為例如核酸分子、多肽、脂類、金屬、毒素以及糖類，樣品可 從任何已知或懷疑含有待檢測(cè)靶生物分子種類的來源而獲得。這種 樣品可從固態(tài)材料如組織、細(xì)胞團(tuán)和活4企以及液體中制得。生物液 體才羊品包4舌尿'液、血液、p垂液、羊水、》軟口液、'淋巴液、汗液、沖青 液、粘液、淚液等。生物樣品還包括那些從細(xì)胞培養(yǎng)等獲得的樣品。
生物樣品可從任何活的或死的生物體獲得。代表性的實(shí)例包括 植物和動(dòng)物以及從其衍生的細(xì)胞和組織?？梢栽O(shè)想，本發(fā)明將在人 類和動(dòng)物醫(yī)學(xué)中^f尋到特別廣泛的應(yīng)用。
如果需要，生物樣品可利用任何恰當(dāng)步驟進(jìn)行制備而用于分
析。例如，凍-融和堿裂解步驟有利于從固態(tài)材料獲得核酸分子；加 熱和堿裂解步驟有利于從尿液細(xì)胞中獲得核酸分子；而蛋白酶K提 取物可用來從血細(xì)胞獲得核酸。其它恰當(dāng)步驟在本領(lǐng)域中是已知 的，且易于根據(jù)待檢測(cè)的靶分子種類和將要獲得的樣品類型進(jìn)行調(diào) 整而用于實(shí)施本發(fā)明。如果需要，在樣品制備過程中可采用一種或 多種提取和濃縮步驟，以初步純化和/或濃縮待檢測(cè)種類的靶分子。 例如，核酸可利用用多種本領(lǐng)域中已知的恰當(dāng)試劑通過沉淀從細(xì)胞 碎片中提取核酸。其它細(xì)胞組分可利用恰當(dāng)?shù)姆旨?jí)步驟而提取。
為了獲得足夠量的靶分子用于分析，特別是靶核酸分子，預(yù)期 可能有必要進(jìn)行初始擴(kuò)增。用于本發(fā)明的恰當(dāng)擴(kuò)增步驟實(shí)例包括 克隆(見 <列^口 S咖brook o/.， M /ecw/or ^丄a60ra/w7 Cold Spring Harbor
Laboratory Press, l卿)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR )(見例如C, R. Newton and A. Graham,戶C/ , BIOS Publishers, 1994;第 4力g3 1% ; 4 202 ^ 4 800 159. 4,965,188; 5，468，6A 5,604,099^ 5,656,493; 6,040,166以及6,514,736號(hào)美國(guó)專利)、連接酶鏈反應(yīng) (LCR )(見例如 Wiedmann， W a/', (1994)尸O Afe/Acwfe』/ / Z" voi. 3:57-64; Barnay, F. (1991)， Proc, Mj/ZJco^. 5W. WS^， vol. 88:189-93;第5,869,252和6,368,801號(hào)美國(guó) 專利)、鏈耳又代性擴(kuò)增(SDA )( 見例如 Walker," at/, (1994), Nucleic Acids Res" vo!. 22:2670-77; U.S. patent no. 5,455,166 ) 以及變通例，如RT-PCR( 見例如Higuchi，"d (1993),Bio/Technology， voU 1:1026-1030)、等4立基因特異性擴(kuò)增(ASA )、 矛J用Q-p復(fù)制酶才廣土曾(Lizardi' " "' (1992), Bio/Technology， vol. 6:1197-1202:), 以及基于轉(zhuǎn)錄的過程(見例如第5,480,784; 5,824,518; 6,087,133以 及6,214,587號(hào)美國(guó)專利)。
為了有利于分析，靶分子可凈皮固定于固態(tài)載體上，然而優(yōu)選基 于溶液的方法。恰當(dāng)?shù)墓虘B(tài)載體的實(shí)例包括珠子(例如硅膠珠子、 可控孔玻璃珠子、磁化珠子、葡聚糖凝膠/瓊脂糖珠子、纖維素珠子 等)；涂層及未涂層的納米顆粒；平面或芯片(例如玻璃纖維濾器、 玻璃表面、金屬表面(如鋼、金、銀、鋁、銅等))、毛細(xì)管、塑料 (例如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、PVDF膜以及微滴定板)；或者 從類似材料制得的針或梳子，所述材料包括珠子或平面或置于平面 如晶片(例如硅膠晶片)的孔內(nèi)的珠子。
當(dāng)需要或有必要在復(fù)合體(或切割底物)合成前，將尚未結(jié)合 于其所特異的耙分子的靶檢測(cè)試劑從分析中去除時(shí)，優(yōu)選實(shí)施靶分 子的固定。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，利用恰當(dāng)?shù)牟东@試劑可將靶 分子固定于固態(tài)載體上。例如，適用于基于核酸的靶分子環(huán)境中的 捕獲試劑包括結(jié)合于固態(tài)載體的寡核苷酸。優(yōu)選這種寡核苷酸雜交 于所述耙核苷酸序列附近區(qū)域的靶核酸分子。核酸分子^t捕獲后， 可將一種或多種輩巴才企測(cè)試劑加入到所述反應(yīng)中。那些雜交于其各自 靶序列的靶檢測(cè)試劑被保留，而那些未雜交的靶檢測(cè)試劑則被洗 掉。其后，復(fù)合體被生成并進(jìn)行^r測(cè)。B.輩e^企測(cè)^式劑
輩巴檢測(cè)試劑用來檢測(cè)存在于樣品中的感興趣耙分子。輩巴檢測(cè)試 劑是合成的分子，包括靶結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體模板(或其互補(bǔ)物)， 如在圖1中示出的。耙結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體才莫玲反可以在單個(gè)反應(yīng)中合 成，或者其可以通過4吏不同反應(yīng)中的兩個(gè)或多個(gè)亞單4立組合而連 接。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，靶結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體才莫板獨(dú)立合成， 隨后當(dāng)需要或按要求將其連接。復(fù)合體模板和靶結(jié)合基團(tuán)相對(duì)于彼 此的耳又向由熟練^支術(shù)人員判斷，且依賴于4爭(zhēng)定應(yīng)用。由核酸組分構(gòu) 成的耙檢測(cè)試劑的代表性取向包括那些其中所述復(fù)合體模板位于 所述耙結(jié)合基團(tuán)的5，或3'的方向。類似的，其它可選組分例如引物 結(jié)合位點(diǎn)(或其互補(bǔ)物)可能包括在內(nèi)且位于靶結(jié)合基團(tuán)和/或復(fù)合 體才莫板的上游或下游(例如在基于核酸的組分中，分別為5，或3，)。
因?yàn)閺?fù)合體不依賴于靶分子的序列或結(jié)構(gòu)，單個(gè)產(chǎn)生復(fù)合體的 復(fù)合體模板(或其子集)文庫可以連接于多種不同類型靶結(jié)合基團(tuán) 例如那些從核酸和多肽(例如抗體和抗體片^:)制得的基團(tuán)，其中 所述復(fù)合體被優(yōu)化用于通過特定檢測(cè)系統(tǒng)(如MALDI質(zhì)譜分析) 進(jìn)行4企測(cè)。如人們所理解的，所述復(fù)合體模板和耙結(jié)合基團(tuán)可以通 過連接子而相連。另外，所述復(fù)合體模板-靶結(jié)合基團(tuán)的鍵合是共價(jià) 的，盡管也可以采用由高親和性結(jié)合對(duì)(例如抗生物素蛋白鏈菌素 與生物素、抗體與抗原、受體與配體，等等)介導(dǎo)的非共價(jià)鍵。
耙結(jié)合基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，其中每一種特異于特定 種類的靶分子(例如，特定等位基因或多肽)，然而，針對(duì)不同區(qū) 域，兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可能對(duì)同一耙分子都具有特異性。例如，不同抗 體可能抗同一多肽，其中每一種不同種類針對(duì)不同抗原決定簇?？?替代的，兩種寡核苷酸如果靶向于同一基因的不同區(qū)域例如針對(duì)不 同等位基因或同一等位基因內(nèi)的不同區(qū)域，則可將其合并。檢測(cè)核 酸時(shí)，優(yōu)選的靶結(jié)合基團(tuán)是與其特異性反應(yīng)的，且因此能夠選擇性地雜交于感興趣革巴核酸分子中的輩巴核酸序列的寡核苷酸。除了肽、 多肽、核酸等，其它輩巴結(jié)合基團(tuán)種類包括適配體和小分子。
至于檢測(cè)非核酸靶分子，典型地，所述耙檢測(cè)試劑包含至少一 個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，所述反應(yīng)基團(tuán)包括多肽，優(yōu)選抗體、抗體片段(即所 述抗原反應(yīng)活性部分)、受體、其靶分子是受體的配體、或從基于 噬菌體展示的步驟衍生的靶特異性多肽。這種基于多肽的靶結(jié)合分 子可從任何恰當(dāng)來源的生物體獲得，且其可以利用任何恰當(dāng)技術(shù)合
靶結(jié)合基團(tuán)。另外，對(duì)于含有多于25個(gè)氨基酸殘基的多肽，這種 分子優(yōu)選利用重組技術(shù)合成，而較短的多肽則優(yōu)選利用固態(tài)化學(xué)而 合成。
在其它具體實(shí)施方式
中，特別是那些其中所述靶分子是核酸或 者特異性結(jié)合含有特定核苦酸序列的核酸的多肽，所述耙;險(xiǎn)測(cè)試劑 的反應(yīng)基團(tuán)包括核酸分子(例如寡核苷酸)，其特異性靶向于靶核 酸分子中的耙核苷酸序列或者，在某些具體實(shí)施方式
中為核酸結(jié)合 蛋白。在某些具體實(shí)施方式
中，所述靶結(jié)合基團(tuán)由所述靶分子的靶 核香酸序列內(nèi)兩個(gè)彼此特異性鄰近結(jié)合的分子構(gòu)成。優(yōu)選所述分子 結(jié)合于所述靶，致使一個(gè)分子的3，-末端核苷酸相鄰于另一個(gè)分子 的5，末端核普酸， -使得其能夠纟皮連接，優(yōu)選通過連接酶連4妾，以形 成包括所述特定靶檢測(cè)試劑的靶結(jié)合基團(tuán)的單個(gè)分子。
無論特定靶沖企測(cè)試劑中包括的反應(yīng)基團(tuán)(即所述耙結(jié)合基團(tuán)) 是什么，所述試劑還包括至少一個(gè)復(fù)合體模板。復(fù)合體模板或其互 補(bǔ)物，至少編碼可在恰當(dāng)條件下生成的復(fù)合體。在某些優(yōu)選的具體 實(shí)施方式中，復(fù)合體模板編碼轉(zhuǎn)錄單位，能夠指導(dǎo)編碼的復(fù)合體表 達(dá)，例如通過轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，這種情況出現(xiàn)在所述復(fù)合體包括核糖核苷 酸的具體實(shí)施方式
中，或者通過轉(zhuǎn)錄和翻i奪，而這種情況是出現(xiàn)在它具體實(shí)施方式
中，所迷復(fù)合體 模板作為后期復(fù)合體合成(例如通過引物延伸)的模板。
優(yōu)選所述復(fù)合體模板為單鏈核酸，典型地為寡核苦酸，其包括 ^殳計(jì)的核苷酸、核苦或其它含有-咸基的單體亞單位序列。然而，如 有需要，所述復(fù)合體模板可以為雙鏈分子，在這種情況下，采用的 方法和試劑要作相應(yīng)的調(diào)整。如人們所理解的，非酶促途徑可以用 來從復(fù)合體模板生成復(fù)合體，其中所述復(fù)合體模板的組分無需設(shè)計(jì)
就能提供由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的能力。
在優(yōu)選的的具體實(shí)施方式
中，所述復(fù)合體才莫4反編碼轉(zhuǎn)錄單位， 所述4爭(zhēng)錄單^f立至少編石馬一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)和一個(gè)復(fù)合體編碼區(qū)。/人所述 轉(zhuǎn)錄單位進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生復(fù)合體或一皮翻譯以生成基于氨基酸的復(fù) 合體的mRNA。在某些具體實(shí)施方式
中，除了構(gòu)成所述復(fù)合體(或 可被翻譯生成所述復(fù)合體的RNA分子)的核苷酸之外，轉(zhuǎn)錄單位 的復(fù)合體編碼區(qū)還編石馬一個(gè)或多個(gè)其它核苷酸。然后，這種4交大前 體分子或切割底物，可經(jīng)化學(xué)或酶4足處理以釋^L所述特定復(fù)合體。
在某些具體實(shí)施方式
中，其中復(fù)合體作為切割底物的一部分而 合成，專交大前體經(jīng)i殳計(jì)以輔助所述復(fù)合體的隨后釋^:，例如通過化 學(xué)、物理或酶促切割。盡管復(fù)合體釋放可通過任何恰當(dāng)方法而實(shí)現(xiàn)， ^旦現(xiàn)在優(yōu)選通過一種或多種試劑(優(yōu)選單個(gè)試劑種類)處理所述反 應(yīng)而同時(shí)釋放一種、幾種或多種復(fù)合體種類，而所述試劑是在所述
切割底物種類。如人們所理解的，所述切割基團(tuán)可能為不穩(wěn)定基團(tuán)， 適于將復(fù)合體從切割底物釋放。因此，所述切割基團(tuán)可能為可化學(xué) 上可切割的4建或不穩(wěn)定化學(xué)連接4建，并可能位于復(fù)合體的 一端或兩 端。典型地，這種4建可通過本領(lǐng)域中的熟練:技術(shù)人員所熟知的方法 而切割，例如通過酸、石咸、氧化、還原、加熱、光照或金屬離子催 化、耳又代或消除化學(xué)方法。當(dāng)然，切割也可以在包括可由酶切割的
49基團(tuán)或連接基團(tuán)的亞單位發(fā)生。酶促可切割性釋放基團(tuán)包括磷酸二 酯或酰胺連接基團(tuán)，以及限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。
對(duì)于基于多肽的單鏈切割底物，復(fù)合體可以通過例如在所述切 割底物中其它位置包括一個(gè)或多個(gè)在所述復(fù)合體部分不存在的可 切割石咸基亞單位種類。在生成所述切割底物后，用所述切割試劑處 理可切割預(yù)計(jì)與切割試劑反應(yīng)的亞單位，以生成具有預(yù)期質(zhì)量的復(fù) 合體種類，切割所需的特定條件將依賴于所采用的特定切割試劑。 在由核苷酸構(gòu)成的單鏈復(fù)合體中，恰當(dāng)?shù)那懈钤噭┌切┻m用于
核脊酸特異性切割的試劑。這種化合物的實(shí)例包括那些在Maxam
和Gilbert測(cè)序^支術(shù)中(戶7^ Ato'"cod 5W. t/試vo!. 74(2):560-564, 1977 ) ^吏用的
化合物，例如石克酸二甲酯、肼以及旅咬。另外，可采用對(duì)切割易感 或^t切割(其為^匕學(xué)、酶促或物理)的》爹飾核酸石咸基亞單^立(例如
那些含有曱基磷酸酯基團(tuán)的亞單位)。
另一方面，如果一個(gè)或多個(gè)復(fù)合體設(shè)計(jì)為雙《連核酸，可能優(yōu)選 其它切割方法。例如，可在所述切割底物中引入一個(gè)或多個(gè)限制性
內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。特別優(yōu)選的是n型限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，特別是那
些包纟舌四》咸基對(duì)回文結(jié)構(gòu)序列的^t點(diǎn)，其可^f尋到平端切割產(chǎn)物。在 由內(nèi)切酶切割得到單《連突出末端的具體實(shí)施方式
中，外切核酸酶可 以用來去除未配對(duì)的核苷酸。
在由含有石咸基的亞單4立構(gòu)成的優(yōu)選單鏈復(fù)合體和切割底物環(huán) 境中，優(yōu)選所述待檢測(cè)的復(fù)合體種類(如果在特定反應(yīng)容器中合成 的一個(gè)、幾個(gè)或多個(gè)不同復(fù)合體種類作為4交大切割底物一部分而合 成)不含有所述可切割石咸基的亞單位種類。如人們所理解的，當(dāng)生
成多個(gè)不同復(fù)合體時(shí)，優(yōu)選所述復(fù)合體部分均不包含切割亞單位。 以這種方式，僅所述可切割堿基亞單位種類將在所述切割反應(yīng)中被 切割，因此釋放所述復(fù)合體。而且，僅需采用一種切割試劑以實(shí)現(xiàn) 所述切割種類中包含的所有不同復(fù)合體種類的釋》文。優(yōu)選的可切割堿基亞單位種類包括腺。票呤、胞嗜啶、鳥噤呤、次黃噤P令、乳清酸、 胸腺嘧咬、尿嘧咬以及黃噤呤和肌香。當(dāng)一種或多種堿基亞單位整 合入切割底物時(shí)，其可以在本領(lǐng)域已知的條件下用任何恰當(dāng)?shù)幕?學(xué)、酶促或物理一支術(shù)處理而進(jìn)行切割。在特定具體實(shí)施方式
中，所 述可化學(xué)切割的連接基包括修飾的堿基、修飾的糖、二硫鍵、整合 入由核魯酸而合成的核酸的^舞酸主干的可^匕學(xué)切割基團(tuán)或另外的 恰當(dāng)可化學(xué)切割連4妄子?？烧先肓姿嶂鞲傻目苫瘜W(xué)切割基團(tuán)為人
熟知，包括二烷氧基硅烷(dialkoxysilane)、 3'(S)-硫代磷酸酯、5，(S)畫 硫代磷酸酯、3'(N)-氨基磷酸酯或5，(N)-氨基磷酸酯。在另外的具 體實(shí)施方式中，所述可化學(xué)切割鍵可能是修飾的糖例如修飾的核糖 基團(tuán)。
關(guān)于由不含石成基的亞單位種類構(gòu)成的復(fù)合體和切割亞單位，本 發(fā)明的方法可以相應(yīng)調(diào)整。例如，在生成由氨基酸組成的切割底物 (即通過翻詞，乂人一種或多種'除當(dāng)i殳計(jì)的轉(zhuǎn)錄單位而合成的相應(yīng) mRNA)的具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體可通過恰當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)或酶促切割 而釋放，其過程類似于從蛋白裂解去除基于肽的親和性標(biāo)簽。所采
用的特定切割系統(tǒng)將依賴于預(yù)期的特定切割。例如，在某些具體實(shí) 施方式中，切割試劑可用來特異性切割切割底物的復(fù)合體部分中不 包含的氨基酸種類，所述切割底物存在于所述反應(yīng)中?？商娲?， 利用特異性肽鏈外切酶和肽鏈內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)可以_沒計(jì)入所述 切割底物。典型地，利用特定肽《連內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)包括短而唯一 的氨基酸序列。任何位點(diǎn)或序列特異性蛋白酶可以用于該目的，且 本發(fā)明的試劑易于調(diào)整，通過整合用于所述同源蛋白酶的恰當(dāng)識(shí)別 位點(diǎn)，使得這種蛋白酶能夠用于實(shí)施本發(fā)明的方法。例如，已有研 究才艮道利用重組表達(dá)和純化的牛血清蛋白酶腸激酶的催化亞單位 (見，例長(zhǎng)口 Stratagene Cloning Systems, Inc.的網(wǎng)5占)，其中EK處5里 可在所述酶的5殘基切割位點(diǎn)的C末端殘基的緊鄰位置切割融合蛋 白，以產(chǎn)生具有天然序列的蛋白。因it匕，所述EK識(shí)別^立點(diǎn)可以改造入切割亞單位使得所述位點(diǎn)的c末端氨基酸殘基緊鄰于所述復(fù)
合體的第一個(gè)氨基酸殘基之前。因?yàn)樗銮懈钭R(shí)別位點(diǎn)(以及任何
其它可能位于所述位點(diǎn)的N-末端氨基酸之前的氨基酸)的質(zhì)量已 知，在得到的質(zhì)譜中對(duì)應(yīng)于所述位點(diǎn)的信號(hào)易于才企測(cè)。在反應(yīng)中， 合成多個(gè)復(fù)合體種類且每一種均具有這種切割位點(diǎn)，結(jié)果質(zhì)譜圖中 所述分裂的非復(fù)合體片段僅具有單峰。
本發(fā)明還包括一些具體實(shí)施方式
，其中靶檢測(cè)試劑還包含一個(gè) 標(biāo)簽(例如生物素或地高辛)，其能夠被固定于固態(tài)載體上，例如 反應(yīng)容器的表面或溶液中珠子或顆粒的表面。通常，所述標(biāo)簽?zāi)軌?連接于所述固態(tài)載體連接的化合物或被其鍵連。所述標(biāo)簽可能直接 連4妄于所述靶4企測(cè)試劑，例如通過所述標(biāo)簽和所述固態(tài)載體之間的 化學(xué)連4妄基團(tuán)，或者通過位于所述標(biāo)簽和所述固態(tài)載體之間的連接 分子連接。根據(jù)所使用的標(biāo)簽分子，標(biāo)簽分子可以共價(jià)或非共價(jià)鍵 合于所述固態(tài)載體。
本發(fā)明還預(yù)見了包含一種以上靶檢測(cè)試劑的組合物，其耙向于 特定遺傳位點(diǎn)或多肽的特定區(qū)域。以這種方式，例如，特定基因內(nèi) 特定核苷酸4立置的兩種或多種遺傳改變可以在單個(gè)反應(yīng)中沖僉測(cè)，因 為每種變異體將具有與其相關(guān)的不同復(fù)合體。類似的，如果所述遺 傳變異得到具有變異結(jié)構(gòu)的多肽，則這種變異可能利用例如不同的 抗體(或抗體片斷)種類而4企測(cè)，其中所述抗體(或抗體片斷)的 每一種<又<又對(duì)于一種所述變異體具有專一性。為了輔助構(gòu)建這種靶 檢測(cè)試劑，預(yù)期可以以片斷形式合成所述靶結(jié)合基團(tuán)，特別是在所 述輩巴分子是核酸的具體實(shí)施方式
中。當(dāng)以片斷合成時(shí)， 一個(gè)片斷可 能是非變異的，因?yàn)樗霭薪Y(jié)合基團(tuán)的該部分對(duì)全部可能的變異體 均一致。所述其它片斷，可能小至含有單個(gè)石咸基亞單位，用于區(qū)分 變異體。類似的，不同靶4企測(cè)試劑可能耙向于特定基因內(nèi)的不同區(qū)域。
例如，如果已知在不同位點(diǎn)具有幾種不同SNP，預(yù)期可產(chǎn)生特異于 每個(gè)SNP位點(diǎn)的 一種或多種靶檢測(cè)試劑。
盡管次優(yōu)選，本發(fā)明還預(yù)見了一些混合物，其中單個(gè)復(fù)合體模 板種類與兩個(gè)或多個(gè)不同的靶結(jié)合基團(tuán)相關(guān)。因此，檢測(cè)到所述復(fù) 合體表示所述樣品中存在所述幾種靶之一。如果需要，實(shí)際上，存 在哪種革巴分子可以在隨后的分一斤中確定?？?#代的，如果才全測(cè)多個(gè)
不同的復(fù)合體種類，其中每一種與一種或多種不同靶分子相關(guān)，則 其中至少部分分子的存在于否與可在分析中檢測(cè)到的其它靶分子
的存在于否相關(guān)，本領(lǐng)域中已知的多種統(tǒng)計(jì)方法可用來確定哪種耙 分子確實(shí)存在于所分析的樣品中。
對(duì)于特定具體實(shí)施方式
，靶一企測(cè)試劑及其組分(例如靶結(jié)合基 團(tuán)和復(fù)合體模板)的合成利用固態(tài)合成方法實(shí)現(xiàn)，可利用組合方法 產(chǎn)生大量復(fù)合物。在這種具體實(shí)施方式
中，靶結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體模 板可通過在一定的條件下重復(fù)加成活化亞單位(例如活化的核苷 單體種類或活化的氨基酸種類)的步驟而合成，所述條件允許正在 形成的核酸或多肽聚合次數(shù)足夠多地合成所需的分子種類。所述靶 結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體才莫板的合成完成后，可將其連4妄到一起。這種連 接可能是直接的，因?yàn)樗鼍€性復(fù)合體模板的一個(gè)末端利用恰當(dāng)?shù)?化學(xué)性質(zhì)直接連接到預(yù)期的靶結(jié)合基團(tuán)上?？商娲?，所述連接可 能是間接的，因此連接分子用來共價(jià)將復(fù)合體才莫板同時(shí)或依次連接 到所述預(yù)期的靶結(jié)合基團(tuán)上。連接子與復(fù)合體模板的連接可能與所 述連接子與所述靶結(jié)合基團(tuán)的連接相同或不同。任何所需連接子均 可采用。優(yōu)選的連接分子包括包括1到約100或更多個(gè)碳原子的脂 肪鏈。盡管把結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體才莫4反優(yōu)選共價(jià)相連，所述連接還可 以為非共^f介的，其中所述連4妄優(yōu)選通過高親和結(jié)合配對(duì)成員而形 成。在某些具體實(shí)施方式
中，靶沖全測(cè)試劑包括靶結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體 模板，其由利用相容性的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生聚合的亞單位(例如利用
53相同的主干化學(xué)性質(zhì)聚合的堿基)進(jìn)行裝配而成，常常優(yōu)選在一系 列反應(yīng)中合成完整耙檢測(cè)試劑。
C.革e^r測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明還纟是供用于4全測(cè)特定靶分子的方法。這種方法包括以下 步驟(a )獲得包括靶檢測(cè)基團(tuán)和復(fù)合體模板的靶特異性靶檢測(cè)試 劑；(b)用所述耙4企測(cè)試劑4妾觸已知或懷11:含有所述把分子的樣 品，形成試劑耙復(fù)合物；(c)從所述復(fù)合體模板生成復(fù)合體(或 切割底物，才艮據(jù)具體情況而定)；以及(d)利用適用于檢測(cè)所述分 析中生成的復(fù)合體種類的檢測(cè)技術(shù)，并因此間接檢測(cè)所述與特定復(fù) 合體種類相關(guān)的輩巴分子。這種方法的實(shí)施可以用于單個(gè)耙分子種 類、小組不同靶分子種類以及大量不同靶分子種類(以多重方式)， 例如才企測(cè)幾種復(fù)合體中的一種或多種，每一種均與相同耙分子相 關(guān)；檢測(cè)一種或多種復(fù)合體，每一種均與兩種或多種靶分子種類相 關(guān)；利用復(fù)合體種類文庫而間接沖企測(cè)多種不同耙分子物種，每一種 均僅與一種靶分子相關(guān)。如人們所理解的，不同復(fù)合體可以用來在 單個(gè)分析中同時(shí)4全測(cè)凄史十、凄t百甚至凄t千種不同的靶分子種類(例 如輩巴核酸)。
復(fù)合體種類文庫可設(shè)計(jì)用于多種不同分析，或用來間接指示存 在不同耙分子。例如，在某些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的復(fù)合體用 于分析病人樣品以;險(xiǎn)測(cè)存在一種或多種種內(nèi)遺傳變異。在其它具體 實(shí)施方式中，所述由相同復(fù)合體才莫才反編碼的相同復(fù)合體文庫連4妾于 不同靶結(jié)合基團(tuán)，例如特異性結(jié)合于來自其它種類的核酸或多肽的 ^i結(jié)合基團(tuán)，所述其它種類如已知感染特定宿主種類的病原體?？?替代的，所述復(fù)合體^^莫板可以連接于靶結(jié)合基團(tuán)，其靶向于除了核 酸以外的生物分子例如一唐類、脂類、蛋白或多肽。復(fù)合體文庫可i殳計(jì)成具有任何合適的大小，且將包括至少兩種 不同復(fù)合體種類(當(dāng)然，其將作為編碼所述復(fù)合體或切割底物的復(fù) 合體模板)。文庫大小的上限將受到 一 些因素的限制例如所采用監(jiān)
測(cè)系統(tǒng)的分辨率、同位素確定的亞單位的可用性(在某些情況下， 質(zhì)量差別用來區(qū)分復(fù)合體種類)以及構(gòu)成所述文庫的種類之間的增 量差異。^艮顯然，對(duì)于大規(guī)模多重化，優(yōu)選所述靶檢測(cè)試劑適用于 生成多種不同復(fù)合體種類。
因此，本發(fā)明涉及到用于在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)靶分子(常常是多 種不同靶分子種類)的方法。通常，這種多重化方法涉及獲得多種 才艮據(jù)本發(fā)明的靶檢測(cè)試劑。在多數(shù)具體實(shí)施方式
中，每種靶檢測(cè)試 劑種類包括靶結(jié)合基團(tuán)和復(fù)合體模板，后者所編碼的模板適用于直 4妻或間《接生成與特定耙分子相關(guān)的復(fù)合體，所述耙分子對(duì)應(yīng)于所述 靶結(jié)合基團(tuán)的靶向。直接生成復(fù)合體或切割底物是通過利用所述復(fù) 合體模板的復(fù)合體編碼(或切割底物編碼)部分作為引導(dǎo)而化學(xué)或 酶4足生成編碼的復(fù)合體(或切割底物)。在某些優(yōu)選的具體實(shí)施方 式中，復(fù)合體或切割底物的生成來自于復(fù)合體模板中攜帶的轉(zhuǎn)錄單
位的轉(zhuǎn)錄，利用恰當(dāng)?shù)腞NA聚合酶以生成復(fù)合體(或含有復(fù)合體 的切割底物)。在其它具體實(shí)施方式
中，短引物雜交于所述復(fù)合體 模板中堿基的互補(bǔ)區(qū)，然后其在例如引物延伸反應(yīng)中進(jìn)行延伸，其 中所述延伸由恰當(dāng)?shù)木酆厦复呋?。另一方面，間接生成復(fù)合體是指 將一個(gè)或多個(gè)中間步驟包括在例如所述轉(zhuǎn)錄步驟與所述復(fù)合體(或 切割底物)的生成之間。作為例子，在某些具體實(shí)施方式
中，復(fù)合 體在復(fù)合體才莫4反的轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)編碼，所述從所述轉(zhuǎn)錄亞單位生成的 mRNA轉(zhuǎn)錄本可,皮翻i奪成特定多肽，其可以需要或無需進(jìn)一步處理 (例如其中初始多肽是切割底物的情況下需要切割，必須進(jìn)一步處 理以釋放其中包含的復(fù)合體)。
如本領(lǐng)域中4支術(shù)人員所理解的，當(dāng)所述靶分子是核酸分子時(shí)， 為了在生成復(fù)合體前增加樣品中所述靶分子的表示，可能需要擴(kuò)增所述核酸的部分。任何恰當(dāng)?shù)臄U(kuò)增步驟均可采用，其所利用的引物 允許特異性擴(kuò)增待探索的所述靶分子。盡管在某些
具體實(shí)施例方式
中，特異于待檢測(cè)的特定靶分子的靶檢測(cè)試劑于擴(kuò)增后包括在所述 反應(yīng)中，然而也可以于擴(kuò)增前包括于反應(yīng)中。在其它
具體實(shí)施例方式
中，靶區(qū)域的擴(kuò)增由所述輩巴檢測(cè)試劑本身的組分介導(dǎo)，典型地通過 將一種或多種引物結(jié)合位點(diǎn)包括在所述靶檢測(cè)試劑中。優(yōu)選引物結(jié) 合位點(diǎn)位于所述特定檢測(cè)試劑的復(fù)合體模板部分的側(cè)翼或位于其 之外。優(yōu)選引物結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)為對(duì)應(yīng)于所述特定靶檢測(cè)試劑的復(fù)合
體模板的5，或3，位。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，至少兩個(gè)不同 的引物結(jié)合位點(diǎn)(實(shí)際上一個(gè)互補(bǔ)于一個(gè)引物，而另一個(gè)為另一個(gè) 引物的互補(bǔ)物，所述另一個(gè)引物可雜交于/人所述第一個(gè)引物延伸的 鏈)包括在把檢測(cè)試劑內(nèi)。
例如，如在圖8中所闡述的，在某些優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中， 為了隨后生成復(fù)合體，靶檢測(cè)試劑包括必須連接在一起的兩個(gè)或多 個(gè)部分。如在圖8中示出的，兩種不同的靶4全測(cè)試劑可從三種不同 的寡核香酸生成。所述寡核苷酸(每種均為"第一"寡核苷酸)中 的兩種是等位基因特異的，且允許在一個(gè)核苷酸位置的單核苷酸差 異(A或G)可由于每種"第一，，寡核苷酸的3'末端堿基的差異而 區(qū)分開(一個(gè)中為"T"而另一個(gè)中為"C")。所述其它寡核苷酸("第 二"寡核普酸)不是等位基因特異的，且設(shè)計(jì)成含有一個(gè)靶結(jié)合基 團(tuán)部分，其基本互補(bǔ)并優(yōu)選完全互補(bǔ)于所述靶序列的一部分。所述 第一和第二寡核苷酸一旦雜交，所述兩個(gè)第一寡核苷酸中的一個(gè) (即其具有的3，-末端與所述特定耙分子中存在的核苷酸互補(bǔ)的 那個(gè)寡核苷酸)與所述第二寡核苷酸的鄰近，使得所述第一和第二 寡核苷酸一皮連4妄(優(yōu)選通過連4妄反應(yīng))以形成完整的耙一企測(cè)試劑。 考慮到該方面，如在圖8的具體實(shí)施方式
中示出的，所述第一和第 二寡核苷酸的側(cè)翼為通用引物結(jié)合位點(diǎn)，隨后所述特定靶;險(xiǎn)測(cè)試劑 種類(以及其它可能存在于所述反應(yīng)中且包括相同引物結(jié)合位點(diǎn)的種類)可被擴(kuò)增以產(chǎn)生用于生成切割底物(或復(fù)合體)的底物，所
述生成利用RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄從啟動(dòng)子開始。
如人們所理解的，在包括兩個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)(意指 一個(gè)引物 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于第 一 引物，而另 一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)物對(duì)應(yīng)于 第二引物)的耙檢測(cè)試劑的具體實(shí)施方式
中， 一個(gè)(優(yōu)選兩個(gè))位 點(diǎn)經(jīng)設(shè)計(jì)形成通用引物，特別是當(dāng)計(jì)劃用于多重分析中時(shí)。在某些具體實(shí)施方式
中，所述試劑與其所靶向的生物分子相互作用之后， 一對(duì)引物用來擴(kuò)增靶檢測(cè)試劑的部分或全部，或許需要采用引物結(jié) 合位點(diǎn)，其中一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合于通用引物而另一個(gè)位點(diǎn)特異于所述特 定靶;險(xiǎn)測(cè)試劑種類。盡管次優(yōu)選，也可理解本發(fā)明包括一些具體實(shí) 施方式，其中所述引物結(jié)合位點(diǎn)不被通用引物靶向，相反被特異于 所述特定靶檢測(cè)試劑種類的引物而靶向。另外，靶檢測(cè)試劑可被設(shè) 計(jì)為包括兩個(gè)以上引物結(jié)合位點(diǎn)，因此利于利用不同引物擴(kuò)增所述 i式劑的不同部分。
因此，在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，擴(kuò)增(如果實(shí)施了擴(kuò)增)后， 復(fù)合體(或包括復(fù)合體的較大前體)可以從所述復(fù)合體模板生成， 而所述復(fù)合體才莫一反包括于在所述反應(yīng)中所包括的一種或多種靶沖企 測(cè)試劑種類中。本發(fā)明提供了生成復(fù)合體的方法，其包括在適于聚 合的條件下組合相同或不同亞單位種類的亞單位例如含有石成基的 亞單位(例如核苷酸)、氨基酸、糖基等。典型地，核苷酸由聚合 酶聚合，而寡核苷酸由連4妻酶聚合。特別優(yōu)選的方法是復(fù)合體或切 割底物利用酶從相應(yīng)的復(fù)合體^t板的轉(zhuǎn)錄單位生成的那些方法。尤 其優(yōu)選用于聚合核糖核苷酸的酶是RNA聚合酶，特別是T7、 T3 和SP6RNA聚合酶，然而只要所述復(fù)合體模板編碼恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子， 也可采用其它RNA聚合酶。當(dāng)復(fù)合體或切割底物由氨基酸殘基構(gòu) 成時(shí)，優(yōu)選的合成方法也是酶4足方法。優(yōu)選體外翻i奪的方法，其中 轉(zhuǎn)錄的mRNA或以他方式乂人相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄單位生成的mRNA,:帔翻 譯成多肽。引物延伸方法也可被采用以生成復(fù)合體以及切割底物。
57可以i殳想還可采用其它聚合亞單位的方法，如果采用這種方法，單 體亞單位或多個(gè)單體亞單位，可^皮組裝成前體用于隨后組裝成更大 單位，直至包括復(fù)合體、切割底物、轉(zhuǎn)錄單位、復(fù)合體模板、寡核 香酸等。因此在其它具體實(shí)施方式
中，復(fù)合體的聚合由化學(xué)合成介 導(dǎo)。在基于核酸或氨基酸的復(fù)合體中，優(yōu)選的合成方法基本上是那 些分別用于標(biāo)準(zhǔn)合成的核酸和肽合成的方法。在另外的具體實(shí)施方 式中，》咸基亞單位例如包括在復(fù)合體中的核苷酸，可能進(jìn)4亍鏈終止 性修飾。例如，力o成的核香酸可能為鏈終止性的雙脫氧核普酸，從 而阻止其它核苷酸的加成。在其它具體實(shí)施方式
中，加成到復(fù)合體 上的亞單4立可能含有核酸酶阻滯基團(tuán)以防止所述復(fù)合體或切割底 物被核酸酶(例如核糖核酸酶)消化。
如上所述，每個(gè)復(fù)合體種類具有確定的特征使其可與特定分析 中可能生成的其它復(fù)合體種類區(qū)分開。例如，將質(zhì)量作為所述確定 的特征，每個(gè)復(fù)合體種類將被改造使得當(dāng)其在分析中生成時(shí)將具有 ，唯一的質(zhì)量或質(zhì)量范圍，通過特定分析中采用的質(zhì)量4全測(cè)系統(tǒng)可將 其與其它可能的復(fù)合體種類分辨開。因此，檢測(cè)與特定靶分子相關(guān)
的復(fù)合體間接表明所述由靶結(jié)合基團(tuán)靶向的靶分子存在于所分析 的樣品中。
在本發(fā)明的方法中，在適于形成試劑靶復(fù)合物的條件下，用 一種或多種耙檢測(cè)試劑種類接觸已知或懷疑含有所述靶分子的樣 品。如果需要，且所述耙4企測(cè)試劑已經(jīng)經(jīng)過i殳計(jì)而被擴(kuò)增或以其它 方式被擴(kuò)增，則形成試劑靶復(fù)合物的靶檢測(cè)試劑可利用與所述特 定耙檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)相兼容的過程而擴(kuò)增。然后可能生成復(fù)合體或 切割底物，隨后所述反應(yīng)產(chǎn)物的一部分可利用4全測(cè)4支術(shù)進(jìn)行4全測(cè)， 所述技術(shù)根據(jù)設(shè)計(jì)用于該目的的確定特征而能區(qū)分復(fù)合體種類。特 別優(yōu)選的確定特征是質(zhì)量，而優(yōu)選用于根據(jù)質(zhì)量而區(qū)分復(fù)合體種類 (如果存在)的方法是質(zhì)i普分析，特別是MALDI-TOF質(zhì)譜分析。檢測(cè)到復(fù)合體種類表明與所述復(fù)合體相關(guān)的靶分子存在于所述樣 品中。
如本文中其它部分所描述的，可同時(shí)^r測(cè)特定樣品中的 一種以 上革巴分子包括耙核酸分子種類。確實(shí)，不同種類的革巴分子例如核酸、 多肽、脂類、糖類等可通過應(yīng)用本發(fā)明的方法在同一個(gè)分析中間接 才企測(cè)。這種"多重化"可通過利用不同的復(fù)合體種類而實(shí)現(xiàn)，其中 每個(gè)復(fù)合體種類與特定靶分子唯一相關(guān)，因此4企測(cè)所述與其相關(guān)的
復(fù)合體種類在確定特征方面的差異，不同的復(fù)合體種類可在單個(gè)分 析中區(qū)分開。將質(zhì)量差異作為例子，根據(jù)分子質(zhì)量差異的靈敏質(zhì)量 分析可用來區(qū)分不同的復(fù)合體種類。如人們所理解的，復(fù)合體之間 的質(zhì)量差異應(yīng)該優(yōu)選足夠大，以使在單個(gè)分析中能夠進(jìn)行檢測(cè)。不 同復(fù)合體種類之間的質(zhì)量差異足以利用所采用的特定質(zhì)量分析平 臺(tái)(即硬件和軟件)而分辨。在復(fù)合體的情況下，質(zhì)量差異可通過 所述復(fù)合體種類的序列(組成和長(zhǎng)度)而實(shí)現(xiàn)，也可通過將質(zhì)量修 飾基團(tuán)引入一個(gè)或多個(gè)用于合成所述復(fù)合體的構(gòu)建才莫塊(例如在基 于RNA的復(fù)合體中的核糖核苷酸)中而實(shí)現(xiàn)。質(zhì)量修飾基團(tuán)的實(shí) 例包4舌例如卣素(如F、 Cl、 Br和/或I)、疊氮或所述類型的XR， 其中X是連接基團(tuán)而R是質(zhì)量修飾官能團(tuán)。其它有益于特定種類復(fù) 合體設(shè)計(jì)的是同位素確定的核苷酸，因?yàn)榇嬖谟谔囟ê塑账岱N類中 的一種或多種所述重原子種類(即N、 C、 O等)將對(duì)特定同位素 而力o以富集。
不限定本發(fā)明的范圍，在質(zhì)量作為所述確定特4正的具體實(shí)施方 式中，可在復(fù)合體或切割底物生成過程中引入不同增加度的質(zhì)量修 飾，優(yōu)選通過將質(zhì)量1'務(wù)飾的構(gòu)建一莫塊(例如核糖核苷酸)整合入初 始復(fù)合體或切割底物中，特別是當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)復(fù)合體種類將同時(shí)生
成時(shí)，要4吏其各自的質(zhì)量不同而可分辨。質(zhì)量增加可能是相同的， 如當(dāng)單個(gè)質(zhì)量修飾基團(tuán)種類用來修飾 一種或多種不同構(gòu)建模塊的質(zhì)量時(shí)，而所述模塊用來在特定分析中合成所述復(fù)合體?？商娲模?質(zhì)量增加可能是不同的，如當(dāng)采用不同的質(zhì)量修飾基團(tuán)時(shí)。任何恰 當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法均可用來將質(zhì)量修飾基團(tuán)連接到復(fù)合體構(gòu)建模塊上。
例如，如果低聚/聚乙二醇衍生物具有的質(zhì)量增加為44，可通過僅 變化利用這些基團(tuán)中的0到4個(gè)而生成5個(gè)不同質(zhì)量修飾的種類。 低聚/聚乙二醇也可利用低級(jí)烷基例如甲基、乙基、丙基、異丙基、 t-丁基等單烷基化。連接官能團(tuán)也可用來將質(zhì)量修飾基團(tuán)連接到一 種或多種所述復(fù)合體構(gòu)建模塊上。當(dāng)然，也可以選用除了低聚/聚乙 二醇之外的質(zhì)量修飾基團(tuán)，并通過恰當(dāng)?shù)倪B接化學(xué)方法進(jìn)行連接。
因?yàn)橐环N或多種特定靶分子可能僅僅痕量存在于特定樣品中， 因此常常優(yōu)選在復(fù)合體合成前擴(kuò)增所述耙分子或更優(yōu)選所述革巴才全 測(cè)試劑(或其一部分，即所述復(fù)合體才莫板)。假如所述相應(yīng)的靶分 子存在于所述樣品中，這種擴(kuò)增則確保合成足夠數(shù)量的復(fù)合體分子 用于隨后4企測(cè)。
在某些具體實(shí)施方式
中，所述靶分子種類是核酸并預(yù)期在暴露 于所述耙才企測(cè)試劑之前擴(kuò)增所述靶，可采用任何恰當(dāng)?shù)暮怂釘U(kuò)增才支 術(shù)。 一種優(yōu)選的方法是聚合酶鏈反應(yīng)("PCR")及其變通方法，而 另 一個(gè)優(yōu)選的方法是基于轉(zhuǎn)錄的恒溫?cái)U(kuò)增方法。無i侖采用的擴(kuò)增方 法是哪種，典型地，擴(kuò)增每種耙(除非兩種或多種靶包括同一基因 相同區(qū)域的遺傳變異體)需要利用至少兩種不同的擴(kuò)增引物。因此， 高度多重化的反應(yīng)需要利用大量不同的擴(kuò)增引物對(duì)，在多種情況下 這會(huì)造成一種或多種所述靶擴(kuò)增效率的差異。因?yàn)檫@個(gè)原因，優(yōu)選
施擴(kuò)增反應(yīng)。然后利用所述試劑靶復(fù)合物而實(shí)施擴(kuò)增，所述復(fù)合 物可能M旦不必)與擴(kuò)增前的初始反應(yīng)的其它組分分離。由于這個(gè) 原因，所述靶沖全測(cè)試劑中設(shè)計(jì)被擴(kuò)增的部分(即至少所述復(fù)合體才莫 板)可以利用少至一對(duì)擴(kuò)增引物來擴(kuò)增。在這種情況下，所述引物 稱為"通用引物"，因其可以用來在特定的多重?cái)U(kuò)增中擴(kuò)增所有希望擴(kuò)增的核酸。而且，對(duì)于為了實(shí)現(xiàn)高水平的高效擴(kuò)增而設(shè)計(jì)用于 特定分片斤的通用引物對(duì)而言，所述擴(kuò)增反應(yīng)可以進(jìn)4亍優(yōu)化。如本領(lǐng) 域中技術(shù)人員所已知的，待擴(kuò)增的核酸區(qū)域的側(cè)翼為所述擴(kuò)增引物 結(jié)合位點(diǎn)(或其互補(bǔ)物)。
如上所述，對(duì)于多重反應(yīng)，最希望僅利用單對(duì)"通用"引物以 在所述擴(kuò)增過程中引導(dǎo)延伸反應(yīng)。因此， 一對(duì)引物可用來擴(kuò)增由所 述引物結(jié)合位點(diǎn)包括的不同核酸序列中的每一種。當(dāng)然，也可能采 用超過一對(duì)引物，甚至對(duì)每個(gè)待擴(kuò)增核酸種類采用一對(duì)或多對(duì)引 物。在其它具體實(shí)施方式
中，單個(gè)引物種類可用來引導(dǎo)特定擴(kuò)增子 的正向鏈或反向鏈的合成，其中結(jié)合位點(diǎn)(或其互補(bǔ)物)位于每種 不同的待擴(kuò)增核酸種類末端的側(cè)翼。所述引物對(duì)的另 一個(gè)引物對(duì)所 擴(kuò)增的特定核酸具有特異性。類似的，在這種具體實(shí)施方式
中每對(duì) 引物將包括通用引物和特異于特定核酸的引物。如果需要，擴(kuò)增引 物還含有能夠凈皮固定于固態(tài)載體的官能團(tuán)，例如生物素或地高辛。 然后如果需要，得到的擴(kuò)增子則可與其它反應(yīng)組分分離。
如在本文中其它部分所描述的，本發(fā)明的方法優(yōu)選用于多重才莫 式。在這種模式的優(yōu)選實(shí)例中，每種待檢測(cè)的靶分子與不同的復(fù)合 體種類相關(guān)，即在特定反應(yīng)中每種復(fù)合體唯一識(shí)別一種特定耙分 子。類似的，作為互相比較目的，每個(gè)靶檢測(cè)試劑種類包括不同的 靶結(jié)合基團(tuán)以及不同的復(fù)合體模板。因此，隨后檢測(cè)特定復(fù)合體就 間接表示樣品中存在與所述復(fù)合體相關(guān)的靶分子。
當(dāng)然，除了這種單個(gè)靶/1單個(gè)復(fù)合體的具體實(shí)施方式
，還設(shè)想 了其它具體實(shí)施方式
。例如，本發(fā)明還設(shè)想了一些具體實(shí)施方式
， 其中包含一個(gè)或多個(gè)把分子種類的樣品用多種耙檢測(cè)試劑接觸，兩 種或多種所述耙;險(xiǎn)測(cè)試劑包括的復(fù)合體才莫板編碼所述耙分子種類 的同一復(fù)合體種類。因此，隨后檢測(cè)特定復(fù)合體種類表示幾種與所 述復(fù)合體相關(guān)的把中的 一種或多種存在于正檢測(cè)的樣品中。這些結(jié)果可通過進(jìn)一步的試—瞼或統(tǒng)計(jì)分析而推算，以確定哪種革巴分子存在 于所述樣品中。在其它具體實(shí)施方式
中，所述方法涉及利用針對(duì)特 定靶的多種不同靶檢測(cè)試劑檢測(cè)一個(gè)樣品，所述把檢測(cè)試劑的區(qū)別 不在于其靶結(jié)合基團(tuán)，而在于其復(fù)合體模板。因此，所述靶檢測(cè)試 劑靶向于相同靶分子，隨后檢測(cè)到任何、 一些或所有與所述特定耙 相關(guān)的復(fù)合體表明所述靶存在于樣品中。
D.復(fù)合體檢測(cè)
合體種類的檢測(cè)過程進(jìn)行檢測(cè)，然而特定分析中可能的多重化水平 可能變動(dòng)。用于該目的的檢測(cè)系統(tǒng)的代表性實(shí)例包括質(zhì)譜分析、電
泳、色i普、核S吏雜交以及NMR。當(dāng)所述有益于區(qū)分復(fù)合體種類的 確定特征涉及質(zhì)量時(shí)，特別優(yōu)選的檢測(cè)是質(zhì)譜分析；然而，如本領(lǐng) 域中的4支術(shù)人員所能理解的，本領(lǐng)域中已知的其它沖企測(cè)系統(tǒng)也易于 根據(jù)本說明書而調(diào)整用于實(shí)施本發(fā)明?？紤]到這點(diǎn)，下面的描述集 中于質(zhì)量，然而可理解本發(fā)明的范圍不限于基于質(zhì)量的4企測(cè)系統(tǒng)和 技術(shù)。優(yōu)選用于本發(fā)明的的質(zhì)譜儀模式是電噴霧(ES)、基質(zhì)輔助 激光解吸電離(MALDI)、離子回旋共才展(ICR)以及傅立葉轉(zhuǎn)換
(Fourier Transform )。對(duì)于ES,溶解于水或揮發(fā)性緩沖液的樣品連 續(xù)或間斷注射入常壓電離4妄口 (interface),然后進(jìn)4亍四才及質(zhì)量分才斤。 生成多個(gè)利用ES質(zhì)譜分析獲得的離子峰，可增加所述質(zhì)量測(cè)定的 準(zhǔn)確4生。關(guān)于所述4爭(zhēng)定結(jié)構(gòu)的更詳細(xì)4言息可利用MS/MS四才及結(jié)構(gòu)
(configuration )獲得。在MALDI質(zhì)譜分析中，可采用多種質(zhì)量分 析器，例如單或三倍四極模式中的扇形磁場(chǎng)/磁偏轉(zhuǎn)檢觀'J儀器
(MS/MS)、 4專立葉轉(zhuǎn)換以及飛4亍時(shí)間(TOF)結(jié)構(gòu)。對(duì)于所述解
吸/電離過程，可以采用任何恰當(dāng)?shù)幕|(zhì)/激光組合。也可采用離子
捕獲和反射結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在最優(yōu)選MADLI-TOF質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析以
及他檢測(cè)復(fù)合體的方法， 在例如第 5,118,937; 5,202,561; 5，楊4,985; 5,547,835;5,605,798; 5,622,824; 5,691,141; 5,777,324;5,864,137; 5,869,242; 5,919,646; 5,922,542; 5,928，卯6; 6,024,925; 6,043,031; 6,051,378; 6,0卯,558; 6,104,028; (5,111,251; 6,194,〗44; 6,197,498; 6,207,370; 6'22〗，60〗；6,221,605; 6,225,450; 6,235,478 6,238,871; 6,258,538; 6,268,131; 6,268,144; 6'277，5，3; 6，300，076; 6,322,970; 6，379，9n; 6,387,628; 6,423,966; 6,428,955; 6,436,635; 6,440,705; 6,458,945; 6,468,748; 6,475,736; 6,500,621; 6,500,650; 6，558，卯2; 6,566,055; 6,566,059;《582,923; 6,589,485; 6,602,662; 6,6t0，492; 6,635,452; 6,660,229; 6,706,530; 以 及
6,723,564號(hào)美國(guó)專利以及序歹'J號(hào)為 09/839,629 (公開號(hào) 20020155587 )以及10/128,680 ( 乂>開號(hào)20030033091 )的美國(guó)乂>開 專利申i青中加以描述。
質(zhì)量分析之前(例如通過質(zhì)譜分析)，"調(diào)整，，核酸分子以降低 揮發(fā)所需的激光能量和/或?qū)嗔呀档阶畹停容^有用。優(yōu)選在靶檢 測(cè)位點(diǎn)被固定時(shí)進(jìn)行調(diào)整。調(diào)整的實(shí)例是修飾所述核酸分子的磷酸 二酯主干(例如陽離子交換)，這有益于消除由于每個(gè)核苷酸單位 結(jié)合的陽離子異質(zhì)性造成的峰展寬。用烷化劑例如硪代烷、碘代乙 酰胺、P-石輿乙醇或者2,3-環(huán)氧-1-丙醇等接觸核酸分子，可以將核酸 分子的單硫代磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化為磷酸三酯鍵。可替代的，利用氯化
三烷基石圭烷可將磷酸二酯4t轉(zhuǎn)化為不帶電荷的衍生物。進(jìn)一步的調(diào) 整涉及到引入核苷酸降低脫嘌呤作用的靈敏度，例如N7-或N9-氮 雜噤口令(deazapurine )核苷Si或RNA構(gòu)建才莫塊，或者利用寡核苷 酸三酯或者引入烷化的石危代磷酸酯官能團(tuán)或者采用寡核苷酸類似 物例如肽核酸(PNA)。
E.應(yīng)用
耙才企測(cè)試劑及其編碼的復(fù)合體具有多種用途。例如，靶結(jié)合基 團(tuán)可以耙向于特定的已知生物分子包括蛋白和核酸。尤其優(yōu)選的靶 分子是那些已知與特定病癥相關(guān)(如果不是其病因的話)的分子， 例如疾病或功能障礙。特異于靶分子的靶檢測(cè)試劑結(jié)合于所述靶分 子之后，復(fù)合體可以/人所述復(fù)合體才莫4反生成，隨后可利用相容性才企 測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行4全測(cè)，從而間接表明所述特定耙分子的存在。在某些具體實(shí)施方式
中，可采用本文中描述的方法，例如去枱r 測(cè)任何已知的遺傳變異包括多于4000種現(xiàn)在已知的可遺傳的遺傳 性疾病(例^o:血友病、；也中；每貧血、Duchenne型月幾營(yíng)養(yǎng)不良 (DMD )、亨廷頓癥(HD )、阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease ) 以及嚢性纖維化(CF))。已知某些遺傳變異例如某些SNPs與特定 疾病相關(guān)。除了4企測(cè)SNP和點(diǎn)突變，其部分與例^^十凈爭(zhēng)定疾病的 易感性、對(duì)特定藥物無反應(yīng)或幅反應(yīng)等，還可以利用本發(fā)明的方法 才企測(cè)其它遺傳變異，包括21三倍體、13三倍體、18倍三體、X單 倍體以及其它性染色體異倍體例如克萊里菲爾特綜合征 (Klinefelter's Syndrome)。其它可根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)的遺傳變異包括 缺失、重復(fù)、插入以及重排。另外，可對(duì)染色體和超凄t染色體元件 的基因和非編碼區(qū)進(jìn)行修飾(例如化學(xué)修飾如甲基化)。也可利用 本發(fā)明的方法研究RNA加工和基因轉(zhuǎn)錄的差異。
病毒、細(xì)菌、真菌以及其它病原體含有的核酸序列可以與宿主 生物體的核酸序列區(qū)分開。 一企測(cè)或定量核酸序列或其它特異于傳染 性生物體的生物分子(例如蛋白、酶、細(xì)胞壁組分等)對(duì)于"i貪斷或 檢測(cè)感染的治療非常重要。感染人和動(dòng)物？l起疾病的病毒實(shí)例包括 逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如人免疫缺陷病毒如HIV-1和HIV-2，以及貓白血 病病毒)；小RNA病毒(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、A型肝炎病毒、腸 病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒和埃可病毒)；杯狀病毒(例如引起 胃腸炎的病毒林)；嚢膜病毒(例如馬腦炎病毒、風(fēng)滲病毒)；黃病 毒(例如登革病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒；桿狀病毒 (例如水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；絲狀病毒(例如埃博拉病毒)； 副粘病毒(例如副流感病毒、膽、^炎病毒、麻滲病毒、呼吸道合胞 病毒)；正粘病毒(例如流感病毒)；野恭病毒(例如漢坦病毒、野 恭病毒、白蟲令熱病毒以及內(nèi)羅病毒)；嵌妙、樣病毒(例如出血熱病 毒)；《瓜病毒(例如J瓜病毒、環(huán)狀病毒以及4侖狀病毒)；雙股核^唐核 酉臾病毒；肝病毒(例力口 B型肝炎病毒)、細(xì)小病毒；乳頭^l犬瘤多
64型空泡形病毒(例如乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒；皰滲病毒 (例如單純皰滲病毒(HSV) 1和2、水痘-帶狀皰滲病毒、巨細(xì)胞 病毒(CMV)、皰療病毒)；痘病毒(例》。天花病毒、痘苗病毒、痘 病毒)；虹彩病毒(例如非洲豬瘟病毒)；5-肝炎因子(theagentof delta hepatitis); C型肝炎病毒；i若瓦克以及相關(guān)病毒；以及星習(xí)犬 病毒。
傳染性細(xì)菌的實(shí)例包括幽門螺旋桿菌、伯格多費(fèi)螺旋體、嗜 肺軍團(tuán)菌、各種分歧桿菌(例如結(jié)核桿菌、禽分歧桿菌、胞內(nèi)分 歧桿菌、M. KaA7sa/'/'、戈氏分歧桿菌)、金黃色葡萄球菌、淋病奈 瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、化膿性鏈球菌(A 組鏈球菌)、無乳鏈球菌(B組鏈球菌)、鏈球菌(綠色組)、腸球 菌、牛鏈球菌、鏈球菌(厭氧種屬)、肺炎鏈球菌、致病性彎曲菌 屬、腸球菌屬、流感嗜血菌、炭疽芽孢桿菌、白喉?xiàng)U菌、丹毒絲菌、 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎 克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、擬桿菌屬、具核梭桿菌、念珠狀鏈桿 菌、對(duì)每毒螺旋體、雅司螺旋體、螺旋體菌屬以及以色列方丈線菌。
傳染性真菌的實(shí)例包括新生隱5求菌、組織胞漿菌、厭酷球孑包 子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原體、白色念珠菌。其他傳染性生物體 (例如原生生物)包4舌惡性疾原蟲和剛;也弓形蟲。
本發(fā)明的靶檢測(cè)試劑包括對(duì)待檢測(cè)靶生物分子的靶結(jié)合基團(tuán)。 如人們所理解的，所述耙結(jié)合基團(tuán)將依賴于待檢測(cè)的耙分子。例如 當(dāng)所述靶分子是核酸分子時(shí)，優(yōu)選所述耙分子的靶結(jié)合基團(tuán)還可以 為聚核苷酸(例如合成的寡核苷酸或其它由能夠》咸基特異性雜交于 核苦酸》威基的亞單位構(gòu)成的分子，所述核香酸構(gòu)成所述耙核酸的尋皮 靶向區(qū)域)?？商娲?，在具體實(shí)施方式
中，其中所述把分子是蛋 白，可從之獲得恰當(dāng)耙結(jié)合基團(tuán)的優(yōu)選分子種類是抗體(或其抗原 結(jié)合部分)。
65如上所述，某些優(yōu)選的本發(fā)明具體實(shí)施方式
涉及到4企測(cè)特定草巴 核酸分子。檢測(cè)特定核酸有多種原因，包括檢測(cè)臨床樣品內(nèi)的傳染
性因子、才企測(cè)從基因組DNA或RNA或信使RNA起源的擴(kuò)增產(chǎn)物、 檢測(cè)克隆內(nèi)的基因(cDNA)插入、檢測(cè)對(duì)核酸分子的曱基化或其 它《務(wù)飾、4企測(cè)分化mRNA剪4妄和/或編輯等。如人們所理解的，乾i 核酸檢測(cè)可利用本文中描述的用于制備所述耙檢測(cè)試劑以及釋放 和^r測(cè)所述編碼的復(fù)合體的方法中的 一種或任何組合。如果需要， 人們還可以對(duì)所檢測(cè)復(fù)合體的量進(jìn)行定量，其在本發(fā)明的其它具體 實(shí)施方式中可能也如此，例如利用靶檢測(cè)試劑檢測(cè)靶多肽，所述靶 檢測(cè)試劑包括復(fù)合體模板以及靶結(jié)合基團(tuán)，而靶結(jié)合基團(tuán)包括在反 應(yīng)條件下與所述輩巴多肽特異性反應(yīng)的抗體。在核酸4全測(cè)環(huán)境中，這 些方法中多數(shù)涉及使用靶特異性探針(即把檢測(cè)基團(tuán))作為所述復(fù) 合體(其由耙檢測(cè)試劑的復(fù)合體模板編碼，而所述靶檢測(cè)試劑還包 括所述特定靶檢測(cè)基團(tuán))合成的首要條件。某些情況下，樣品中可 能Y又存在少量革巴物質(zhì)，或者如果^l少量才羊品可用時(shí)，則可以采用擴(kuò) 增技術(shù)增加復(fù)合體才莫板的數(shù)量。
如上所述，使用可應(yīng)用復(fù)合體的耙檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于同時(shí)分 析多種耙分子種類的存在。由于熒光生色團(tuán)產(chǎn)生的光譜有較寬的交 迭，熒光多重化的上限最可能為約10種不同標(biāo)記。利用MALDI-TOF 質(zhì)譜儀或者直接激光解吸質(zhì)譜儀或電噴霧質(zhì)譜儀，可能多重化數(shù) 十、數(shù)百甚至^t千種不同復(fù)合體。
態(tài)性或SNPs，其通常需要很高的靈敏度。這種方法包括檢測(cè)"熱 區(qū)，，點(diǎn)突變以及識(shí)別已知SNP位點(diǎn)的石成基。可以制備雜交于這種位 點(diǎn)的靶特異性探針。為了確保高保真性，優(yōu)選的SNP特異性靶結(jié)合
香酸的基團(tuán)。例如，所述4罙針中的一個(gè)結(jié)合于所述耙的一部分4吏得另一個(gè)寡核苷酸也雜交于所述靶，優(yōu)選使得其5，-末端殘基可以連 接于所述第一寡核苷酸的3，-末端殘基。如此雜交于靶核酸的寡核 苦酸據(jù)稱是平行的。以這種方式，可以沖是供一種或多種第一寡核普 酸以區(qū)分靶核酸分子中特定核苷酸位置的不同多態(tài)性，然而所述第 二寡核苷酸，盡管對(duì)其靶序列具有專一性，但對(duì)特定的遺傳變異并 不具有專一性。當(dāng)然除了其中應(yīng)用三種或多種能夠在^^核酸上相鄰 位置雜交的寡核苷酸外的其它具體實(shí)施方式
也可以采用。其它具體 實(shí)施方式涉及寡核香酸對(duì)(或較大基團(tuán))，其中包括所述基團(tuán)的寡 核苷酸雜交后形成^爭(zhēng)越一個(gè)或多個(gè)核苷酸的空隙。在這種具體實(shí)時(shí) 方式中，優(yōu)選在擴(kuò)增之后，實(shí)施空隙填充反應(yīng)以填充所述空隙并連 接所述寡核苷酸，形成可用于生成復(fù)合體的底物。
SNP檢測(cè)的優(yōu)選具體實(shí)施方式
包括大量不同靶檢測(cè)試劑的多 重化，以同時(shí)沖全測(cè)多種遺傳變異(例如SNP)。優(yōu)選復(fù)合體的存在 可唯一表示才企測(cè)到一種或多種所述不同變異體，其中所述變異體可 利用所述特定耙一全測(cè)試劑組或特定耙檢測(cè)試劑庫來檢測(cè)。
才艮據(jù)特定分析情況，本發(fā)明的方法可以在出生前或出生后實(shí) 施，甚至于死后實(shí)施。
除了僅僅檢測(cè)樣品中是否存在 一 種或多種靶檢測(cè)試劑分子之 外，本發(fā)明的方法還具有多種應(yīng)用，包括個(gè)體基因分型以及確定同 一性或遺傳性(例如親子關(guān)系)。如圖8所示，可以評(píng)估特定核苷 酸位點(diǎn)的遺傳變異，包括對(duì)于特定等位基因變異而言，確定特定二 倍體基因組(如果其相關(guān)位置存在于樣品中)是純合的還是雜合的。
另一種應(yīng)用涉及的本發(fā)明實(shí)施例是關(guān)于監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的。在這 種具體實(shí)施方式
中，不同的靶檢測(cè)試劑用來檢測(cè)代表特定細(xì)胞培養(yǎng)
中所表達(dá)基因的復(fù)合體，其存在濃度與所述特定基因的mRNA豐度 水平相關(guān)。草巴核酸一關(guān)S:含有mRNA或第 一鏈cDNA,以及擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物。類似的，所述耙核酸的存在濃度應(yīng)該與其mRNA豐度水平 相關(guān)。如果需要，擴(kuò)增可用來選擇性擴(kuò)增來自細(xì)胞樣品的mRNA 庫的一部分，以增強(qiáng)那些基因的^r測(cè)信號(hào)并降^f氐來自所述擴(kuò)增部分 之外基因的背景。如本發(fā)明的其它方法，典型地這種方法采用針對(duì) 每種感興趣基因(或其部分)的靶;險(xiǎn)測(cè)試劑，致使隨后檢測(cè)與所述 特定靶分子相關(guān)的復(fù)合體種類間接表明所述基因在所述樣品中具 有表達(dá)。
無需根據(jù)本公開進(jìn)行過多試驗(yàn)，即可制備并執(zhí)行本發(fā)明中公開 和主張權(quán)利的所有組合物及方法。盡管本發(fā)明的組合物及方法是4安 照優(yōu)選具體實(shí)施方式
進(jìn)行描述的，對(duì)于本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員而 言，顯而易見，在不偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍的前提下，可 對(duì)所述組合物和方法進(jìn)4于變動(dòng)，以及對(duì)本文中所描述方法的步驟或 步驟的次序進(jìn)行變動(dòng)。更具體而言，顯而易見，某些化學(xué)上以及生 理上相關(guān)的試劑可以代替本文中描述的試劑，而得到相同或相似的 結(jié)果?？梢哉J(rèn)為，所有這些替代物以及對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來 說顯而易見的調(diào)整，均在由附加的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精 神、范圍以及扭X念之內(nèi)。
本說明書中提到的所有專利和公開申請(qǐng)，表示本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域 中普通技術(shù)人員的水平。本文中所有專利和公開申請(qǐng)均結(jié)合于此供 參考，正如同每一個(gè)公開申請(qǐng)?zhí)貏e單獨(dú)指明結(jié)合于此供參考。
本文中舉例闡釋性地恰當(dāng)描述的本發(fā)明，可以在缺乏本文中未 特別公開的任何元件時(shí)實(shí)施。因此，例如在本文中每一種情況下，
術(shù)語"包括"、"基本上包括"、"由...組成"中任^r一個(gè)均可由另外 兩個(gè)術(shù)語中任何一個(gè)來代替。被采用的術(shù)語和習(xí)語用作說明而非限 制本發(fā)明，且不意圖使用這些術(shù)語和習(xí)語而排除表示及描述所述特 征或其部分的等<介用語， <旦應(yīng)該認(rèn)識(shí)到所作的各種調(diào)整可能在本發(fā) 明所聲明的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明通過優(yōu)選具體實(shí)施方式
和4壬選的特征進(jìn)行了具體 >開， <旦可由本領(lǐng)域中的熟練4支術(shù) 人員對(duì)本文中所公開的概念作調(diào)整和變動(dòng)，且把這些調(diào)整和變動(dòng)當(dāng) 作屬于由附加的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種靶檢測(cè)試劑，包括a. 與靶分子特異性反應(yīng)的靶結(jié)合部分；以及b. 與所述靶結(jié)合部分相連的復(fù)合體模板或其互補(bǔ)物，其中所述復(fù)合體模板編碼與所述靶分子相關(guān)的復(fù)合體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述靶結(jié)合部分特異 性地與耙生物分子反應(yīng)，而所述耙生物分子選自核S臾分子、多 肽、脂類以及^唐類。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述耙結(jié)合部分包括 含有耙序列結(jié)合區(qū)的核酸分子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述靶序列結(jié)合區(qū)包 括至少約6個(gè)含核酸堿基的亞單位。
5. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述靶結(jié)合部分是寡 核香酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述復(fù)合體模板包 括核酸分子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述耙結(jié)合部分的耙 序列結(jié)合區(qū)分布在所述復(fù)合體模板的5，或3，。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶檢測(cè)試劑，還包括一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增引 物結(jié)合位點(diǎn)，用于所述復(fù)合體模板的擴(kuò)增。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述草巴檢測(cè)試劑包括 至少兩個(gè)擴(kuò)增？I物結(jié)合位點(diǎn)，其中至少一個(gè)是通用引物的結(jié)合 ^f立點(diǎn)或其互才卜凈勿。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述靶結(jié)合部分選自 多肽、適配體以及小分子。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述靶結(jié)合部分是選 自抗體、抗體片段、受體以及受體配體的多肽。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的輩巴檢測(cè)試劑，其中所述復(fù)合體模板包括 寡核苷酸。
13. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述復(fù)合體模板包括 含有轉(zhuǎn)錄單位的核酸分子，其中所述轉(zhuǎn)錄單位包括可4喿作地連 接于編碼所述復(fù)合體的編碼區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述啟動(dòng)子區(qū)編碼 啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自細(xì)菌啟動(dòng)子、嗟菌體啟動(dòng)子、通用啟 動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子以及真核啟動(dòng)子。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述啟動(dòng)子區(qū)編碼 噬菌體啟動(dòng)子，所述噬菌體啟動(dòng)子選自T7啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng) 子以及T3啟動(dòng)子。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述復(fù)合體模板編碼 切割底物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述復(fù)合體包括至少 一個(gè)亞單位以及一種可實(shí)現(xiàn)所述復(fù)合體4全測(cè)的確定特征。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述確定特征選自 確定的4t學(xué)組成、確定的分子式、確定的質(zhì)量、確定的亞單^立 序列、確定的長(zhǎng)度以及確定的結(jié)構(gòu)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述耙結(jié)合部分包括第一靶特異性寡核苷酸和第二靶特異性寡核苷酸，其中第一和 第二革巴特異性寡核香酸中每一個(gè)均包括所述耙序列結(jié)合區(qū)的部分，因此一旦所述第一和第二靶特異性寡核普酸與所述靶分 子雜交，所述第一靶特異性寡核苷酸的3'末端核酸石咸基亞單 位與所述第二^fe特異性核普酸的5，末端核酸石咸基亞單位并列， 因此所述第一^^特異性寡核苦酸可以共〗介連接到所述第二靶 特異性寡核苦酸上，形成包含所述靶結(jié)合部分的核酸分子。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的把檢測(cè)試劑，其中所述并列的第一和 第二草巴特異性寡核普酸的共〗介連4妄可以通過連4妻酶實(shí)現(xiàn)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述靶分子是核酸分 子，所述核酸分子選自同 一種屬成員之間的遺傳變異源以及化 學(xué)^務(wù)飾的核酸分子。
22. 4艮據(jù)一又利要求21所述的耙片企測(cè)試劑，其中所述遺傳變異是等 位基因變異。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述遺傳變異對(duì)應(yīng) 的變異選自單核苷酸多態(tài)性、缺失、重復(fù)、插入以及重排。
24. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的耙檢測(cè)試劑，其中所述把核酸分子內(nèi) 的遺傳變異或化學(xué)^f奮飾與疾病相關(guān)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的靶檢測(cè)試劑，其中所述疾病選自癌癥、 可遺傳的遺傳性疾病以及由病原體感染引起的疾病。
26. —種包括多種不同種類靶檢測(cè)試劑的組合物，其中所述耙檢測(cè) 試劑種類中至少一種是根據(jù)權(quán)利要求1的把檢測(cè)試劑。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述不同華巴檢測(cè)試劑種 類中每一種均為才艮據(jù)權(quán)利要求1的靶沖企測(cè)試劑。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中每種靶檢測(cè)試劑種類都 耙向于不同耙分子種類和/或同 一耙分子的不同區(qū)域。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述由每一種靶檢測(cè)試 劑種類編石馬的復(fù)合體可以沖艮據(jù)確定的特4正而與由所述其它輩巴 沖企測(cè)試劑種類編碼的復(fù)合體區(qū)分開。
30. —種包括多種不同種類靶;險(xiǎn)測(cè)試劑的文庫，其中所述靶片會(huì)測(cè)試 劑種類中至少一種是根據(jù)權(quán)利要求1的耙檢測(cè)試劑。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的文庫，其中所述不同靶檢測(cè)試劑種類 中每一種均包括a. 與耙分子特異性反應(yīng)的耙結(jié)合部分；以及b. 連接于所述靶結(jié)合部分的復(fù)合體一莫板或其互補(bǔ)物，其 中所述復(fù)合體模板編碼與所述靶分子相關(guān)的復(fù)合體。
32. 4艮據(jù)權(quán)利要求31所述的文庫，包括2至約10,000種不同的靶 檢測(cè)試劑種類，其中每一種均靶向于不同的靶分子種類。
33. —種包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的耙檢測(cè)試劑的試劑盒，其中所 述靶4全測(cè)試劑加以包裝，以〗更在應(yīng)用于分析之前運(yùn)輸和保存。
34. —種包括多種根據(jù)權(quán)利要求1的靶檢測(cè)試劑種類中不同種類 的試劑盒，其中每一種耙4企測(cè)試劑種類特異于不同的耙分子和 /或同一靶分子的不同區(qū)域，而且其中所述由每一種耙4全測(cè)試劑種類編碼的復(fù)合體可以根據(jù)能夠檢測(cè)并區(qū)分所述復(fù)合體種類的確定特4正而與由所述其它耙;f企測(cè)試劑種類編碼的復(fù)合體 區(qū)分開。
35. —種確定樣品是否含有靶分子的方法，所述方法包括a. 在反應(yīng)條件下，用靶檢測(cè)試劑接觸懷疑含有所述靶分 子的樣品，以形成試劑耙復(fù)合物，其中所述耙檢測(cè)試劑是根 據(jù)4又利要求1的革e4企測(cè)試劑；b. 如果存在試劑靶復(fù)合物，則利用它從所述復(fù)合體模 板生成復(fù)合體；以及c. 確定是否生成了復(fù)合體，乂人而確定所述樣品是否含有 所述耙分子。
36. 沖艮據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述靶分子是生物分子。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述生物分子選自核酸分 子、多肽、脂類以及^f唐類。
38. 4艮據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述靶分子是含有靶核苷 酸序列的核酸分子，且所述靶結(jié)合部分是寡核苷酸，所述寡核 甘酸含有約6至約1,000個(gè)核酸力咸基亞單位并含有基本互補(bǔ)于 所述耙分子的把核苷酸序列的核酸堿基序列。
39. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述核酸分子選自DNA 分子和腦A分子。
40. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述復(fù)合體編碼區(qū)編碼切 割底物。
41. 4艮據(jù)一又利要求41所述的方法，其中所述復(fù)合體通過切割所述 切割亞單〗立而/人所述切割底物釋》文，采用的切割過禾呈選自^f匕 學(xué)、物理以及酶4足過禾呈。
42. 4艮據(jù)片又利要求35所述的方法，其中所述確定是否生成復(fù)合體 通過分析利用檢測(cè)方法收集的數(shù)據(jù)而實(shí)現(xiàn)，其中所述檢測(cè)方法 選自質(zhì)i普分4斤、電泳、色i普、雜交以及NMR。
43. 根據(jù)權(quán)利要求35的方法，用于利用針對(duì)每種待檢測(cè)靶分子種 類的不同耙檢測(cè)試劑種類而檢測(cè)多種不同靶分子種類，其中在 所述不同靶檢測(cè)試劑種類的每一種中，所述復(fù)合體模板編碼與 特定靶分子種類相關(guān)的復(fù)合體種類。
44. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述樣品是生物樣品。
45. —種生成復(fù)合體的方法，所述方法包4舌a. 在反應(yīng)條件下，用根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶檢測(cè)試劑接觸含有耙分子的樣品，以形成試劑把復(fù)合物，其中所述復(fù) 合體模板包括編碼與所述靶分子相關(guān)的復(fù)合體的復(fù)合體編碼區(qū)；以及b. 利用所述復(fù)合體模板合成由所述復(fù)合體模板編碼的復(fù) 合體。
46. —種生成復(fù)合體的方法，所述方法包4舌a.在選4奪的雜交條件下，通過用才艮據(jù)權(quán)利要求1的所述品，形成試劑靶復(fù)合物，其中所述復(fù)合體模板包括轉(zhuǎn)錄單位， 所述轉(zhuǎn)錄單位包括可，喿作地連4妄于編碼與所述草a核酸分子相 關(guān)的復(fù)合體的復(fù)合體編碼區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)；以及b.轉(zhuǎn)錄由所述復(fù)合體編碼區(qū)編碼的復(fù)合體。
47. —種生成切割底物的方法，所述方法包才舌a. 在反應(yīng)條件下，用根據(jù)權(quán)利要求1所述的耙檢測(cè)試劑 接觸含有靶分子的樣品，以形成試劑靶復(fù)合物，其中所述復(fù) 合體模板編碼包括與所述靶分子相關(guān)的復(fù)合體以及至少 一個(gè) 切割亞單位的切割底物；以及b. 利用所述復(fù)合體才莫玲反合成由所述復(fù)合體才莫才反編碼的切 割底物。
48. 根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，還包括切割所述切割亞單位以 /人所述切割底物釋i丈所述復(fù)合體。
49. 一種生成+刀割底物的方法，所述方法包4舌a. 在選擇性雜交條件下，通過用根據(jù)權(quán)利要求1所述特 異于所述靶分子的靶檢測(cè)試劑來接觸含有靶核酸分子的樣品， 形成試劑靶雙鏈體，其中所述復(fù)合體模板包括轉(zhuǎn)錄單位，所 述轉(zhuǎn)錄單位包括與可纟喿作地連接于編碼切割底物的區(qū)域的啟 動(dòng)子區(qū)，其中所述切割底物包括與所述靶分子相關(guān)的復(fù)合體和 至少一個(gè)切割亞單^i;以及b. 轉(zhuǎn)錄所述編碼切割底物的區(qū)域，以生成由所述復(fù)合體 才莫才反編碼的切割底物。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，還包括切割所述切割亞單位以 從所述切割底物釋放所述復(fù)合體。
51. 才艮據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述復(fù)合體包括從1至約 1000個(gè)核酸《咸基亞單位。
52. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，還包括檢測(cè)所述復(fù)合體。
53. —種生成根據(jù)權(quán)利要求1所述的耙檢測(cè)試劑的方法，包括連接 耙結(jié)合部分和與所述耙結(jié)合部分相關(guān)的復(fù)合體才莫板或其互補(bǔ)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可以間接檢測(cè)靶分子的新型分子(命名為“復(fù)合體”)，以及新型靶檢測(cè)試劑和用于編碼復(fù)合體的復(fù)合體模板。復(fù)合體是分析過程中從靶檢測(cè)試劑的復(fù)合體模板部分生成的線性聚合物。在特定分析中，每一種復(fù)合體種類與不同的靶分子相關(guān)，例如糖類、脂類、多肽或靶核酸尤其是靶核酸分子內(nèi)的特定核苷酸序列。例如，當(dāng)分析中存在靶核酸時(shí)，與特定靶(例如已知的SNP或其它遺傳學(xué)變異體)特異且唯一相關(guān)的復(fù)合體種類直接從靶特異性檢測(cè)試劑生成(或間接來自于由所述復(fù)合體模板編碼的較大前體，其隨后從該模板釋放)，之后該復(fù)合體可以很容易檢測(cè)到，甚至一個(gè)分析中可能生成數(shù)十、數(shù)百或數(shù)千不同的復(fù)合體種類，因?yàn)槊恳环N復(fù)合體種類經(jīng)設(shè)計(jì)后可通過小而可分辨的確定特征而與其它復(fù)合體區(qū)分(例如質(zhì)量增加，亞單位組成、序列、大小、長(zhǎng)度等的差異)。當(dāng)與高度敏感的檢測(cè)技術(shù)(例如MALDI-TOF質(zhì)譜分析、核酸雜交、核磁共振等)耦聯(lián)時(shí)，可在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到大量不同的復(fù)合體種類，從而利于復(fù)雜樣品的高度多重分析。
文檔編號(hào)G01N33/58GK101426932SQ200580021007
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2005年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月23日
發(fā)明者迪爾克·約翰內(nèi)斯·范德博姆, 馬蒂亞斯·埃里希 申請(qǐng)人:斯昆諾有限公司