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一種蛋白芯片的檢測方法

文檔序號:6101344閱讀:510來源:國知局
專利名稱:一種蛋白芯片的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及蛋白芯片的檢測方法。
背景技術(shù)
生物芯片是近年來發(fā)展起來的一種新的生物檢測技術(shù),包括基因芯片、蛋白芯片、組織芯片等,具有高速度、高通量、高效率等優(yōu)點。與基因芯片檢測技術(shù)相比,蛋白芯片的檢測具有以下幾個難點不同蛋白質(zhì)之間從電荷狀況到空間結(jié)構(gòu)均有較大的差異,給樣品標記帶來較大困難;蛋白質(zhì)無法擴增放大的特點使得檢測靈敏度要求很高;反應模式的復雜多樣給芯片的平行檢測造成困難。目前,蛋白芯片的常用檢測方法主要有如下幾種1、熒光檢測法這種方法相對成熟,大部分基因芯片均采用這種方法進行檢測。但是,該方法需要激發(fā)光源和高精度的分光系統(tǒng),所用的儀器和熒光染料價格昂貴,運行成本高。
2、化學發(fā)光檢測法這也是蛋白芯片常用的一種檢測方法,但是,一般所檢測的蛋白樣品的濃度低,需要高靈敏度的CCD(電耦合器件),同時化學發(fā)光的標記物價格也相當昂貴。
3、金屬標記物檢測法也有文獻(CN 1390955A)報道了一種金屬標記物檢測蛋白芯片的方法,在該檢測方法中蛋白樣品采用金屬直接標記,其缺點是蛋白樣品易于失活且標記率較低,標記操作比較復雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、簡單、通用的蛋白芯片檢測方法。
本發(fā)明所提供的蛋白芯片的檢測方法,包括如下步驟1)用生物素標記的待測蛋白二抗、待測蛋白與蛋白芯片進行雜交;或者直接以生物素標記的待測蛋白與蛋白芯片進行雜交;2)加入膠體金標記的親和素與蛋白芯片進行雜交,然后,再加入銀顯色增強試劑進行反應,檢測反應生成的銀顆粒。
其中,生物素標記的待測蛋白二抗或生物素標記的待測蛋白按如下步驟進行制備在待測蛋白二抗或待測蛋白的溶液中加入生物素,混勻反應,反應后透析得到生物素標記的待測蛋白二抗或生物素標記的待測蛋白。
所述標記過程中,待測蛋白二抗或待測蛋白的溶液濃度為1~10mg/ml,所述生物素的終濃度為0.1~5mg/ml。標記可在室溫下進行。
本發(fā)明方法能應用于肝臟疾病診斷的蛋白芯片檢測,此時待測蛋白可為肝炎病毒抗原、肝癌抗原或與肝臟疾病相關(guān)的抗原蛋白等。所用的蛋白芯片含有肝炎病毒的抗體,肝癌抗原的抗體或與肝臟疾病相關(guān)的抗原蛋白的抗體等。
生物素是一種有機小分子,它具有性質(zhì)穩(wěn)定,標記后對蛋白所產(chǎn)生的空間阻礙作用小,標記率高等特點。本發(fā)明利用生物素作為聯(lián)系蛋白/抗體與信號分子的橋梁,與采用將納米金屬直接標記蛋白方法相比,生物素法能使蛋白保持更好的活性,從而達到高的檢測靈敏度;利用生物素能與親和素產(chǎn)生很強的特異性作用的特性,使用膠體金標記的親和素將膠體金試劑特異性地結(jié)合至目標物上,而且由于生物素對蛋白質(zhì)的高標記率使得目標物可以同時結(jié)合多個膠體金分子,可以大大提高銀增強劑的顯色效果,從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的高靈敏檢測,檢測限可達到1ng/ml以下。本發(fā)明方法操作簡單,可以采用直接標記待測物的方法或者采用夾心法(先標記二抗,再進行雜交),能同時對多個抗原實現(xiàn)直接的檢測。本發(fā)明的檢測靈敏度已達到、部分已超過熒光檢測的靈敏度,而無需采用昂貴的熒光檢測設(shè)備和熒光標記物,成本低廉。


圖1為熒光檢測法的檢測結(jié)果照片;圖2為本發(fā)明方法的檢測結(jié)果照片;圖3為CEA抗原檢測的灰度值與濃度的關(guān)系圖;圖4為AFP抗原檢測的灰度值與濃度的關(guān)系圖;圖5為HBsAg抗原檢測灰度值與濃度的關(guān)系圖;圖6A-圖6G分別為人鐵蛋白、觸球蛋白、銅藍蛋白、纖連蛋白、α-抗胰蛋白、IgA和IgM的相對灰度值與蛋白濃度的關(guān)系圖。
具體實施例方式
實施例1、本發(fā)明方法與熒光法檢測的對照實驗一、實驗方法1、蛋白芯片制備蛋白芯片的制備方法參見文獻(何為,許丹科,劉志紅等。分析化學,2005,3337-40),所用抗人白蛋白單克隆抗體購自于南方醫(yī)科大學。
2、待測樣品的生物素標記待測人白蛋白(人白蛋白為南方醫(yī)科大學提供)用PBS緩沖液配制成1mg/ml濃度,在此溶液中加入生物素并使其終濃度為0.5mg/mL。混均后反應4小時后加入NH4Cl,濃度為50mmol/L,室溫下放置10分鐘。取100微升溶液放入透析器中,室溫下攪拌透析7小時后,樣品取出備用。反應時所需各種不同濃度的人白蛋白樣品由此儲存液稀釋配制。
3、芯片雜交將抗體蛋白芯片放入芯片反應盒中,加入各種濃度的生物素標記待測人白蛋白樣品100微升,與芯片反應1小時。清洗后加入膠體金標記的親合素試劑(Sigma公司,美國)50μL,在芯片上形成膠體金-抗原-抗體復合物。
4、實驗結(jié)果檢測芯片清洗后,加入銀顯色增強試劑與抗體蛋白芯片反應15分鐘,利用金顆??纱呋y離子還原成金屬銀原理,在膠體金表面形成可通過目測法觀察到的銀顆粒,并用CCD攝像裝置檢測圖像,數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點的灰度值。
同時,以熒光檢測法作為對照實驗在熒光檢測法對照實驗中,以Cy5親和素熒光標記物(Sigma公司,美國)取代膠體金標記的親合素試劑,其余步驟同于上述實驗。在芯片上形成Cy5-抗原-抗體復合物。反應結(jié)果采用熒光掃描檢測儀(PE公司,美國)檢測其熒光值。
二、實驗結(jié)果熒光檢測法的檢測結(jié)果照片如圖1所示該蛋白芯片分為8個獨立的反應區(qū)域,每個區(qū)域含有三排固定的蛋白抗體上排為陰性對照點,中間為抗白蛋白抗體,下排為陽性對照點;8個反應區(qū)加入的樣品濃度分別為A100ug/ml;B20ug/ml;C4ug/ml;D800ng/ml;E160ng/ml;F32ng/ml;G6.4ng/ml;H1.28ng/ml。
本發(fā)明方法檢測結(jié)果照片如圖2所示蛋白芯片分為8個獨立的反應區(qū)域,每個區(qū)域含有五排固定蛋白抗體第一排為陽性對照點,第二排陰性對照點,第三至第五排為抗白蛋白抗體;8個反應區(qū)加入的樣品濃度分別為A125ng/ml;B63ng/ml;C32ng/ml;D16ng/ml;E8ng/ml;F4ng/ml;G2ng/ml;H1ng/ml。
對比兩個實驗結(jié)果表明本發(fā)明方法通過生物素直接標記樣品,并通過銀增強途徑可以使蛋白芯片具有很高的檢測靈敏度,對于所測試的人白蛋白最低檢測濃度可達到0.1ng/mL;而對照的熒光法檢測實驗顯示,其最低檢測濃度約為6ng/ml左右。
實施例2、甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的同時檢測1、制備抗體蛋白芯片蛋白芯片的制備方法參見文獻(何為,許丹科,劉志紅等,分析化學,2005,3337-40),所用的抗癌胚抗原(anti-CEA)及抗甲胎蛋白(anti-AFP)抗體均購自US Biological公司(美國)。
2、二抗的生物素標記將甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的二抗蛋白(抗癌胚抗原及抗甲胎蛋白二抗均購自US Biological公司)用PBS緩沖液配制成濃度為10mg/ml的待標記溶液。在此溶液中加入生物素使其終濃度為0.5mg/mL,混均后反應4小時。反應完成后加入NH4Cl,濃度為50mmol/L。室溫下放置10分鐘。取100微升溶液放入透析器中,室穩(wěn)下攪拌透析7小時后,樣品取出備用。
3、芯片雜交將抗體蛋白芯片放入芯片反應盒內(nèi),加入不同濃度待測的甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)樣品(US Biological公司)100微升(CEA濃度為0、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml;AFP濃度為0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5ng/ml)。與芯片反應1小時后,加入生物素標記的二抗50μL,孵育1小時;用PBS緩沖液清洗后加入膠體金標記的親合素試劑(Sigma公司,美國)50μL,在芯片上形成膠體金-抗原-抗體復合物。
4、實驗結(jié)果檢測用PBS緩沖液清洗芯片后,加入銀顯色增強試劑50μL與抗體蛋白芯片反應15分鐘,利用金顆??纱呋y離子還原成金屬銀原理,在膠體金表面形成可通過目測法觀察到的銀顆粒,并用CCD攝像裝置檢測圖像,數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點的灰度值各檢測點的灰度與添加樣品的濃度關(guān)系分別如圖3和圖4所示,圖3為CEA抗原檢測的灰度值與濃度的關(guān)系圖,圖4為AFP抗原檢測的灰度值與濃度的關(guān)系圖。由圖可見,利用生物素標記的二抗,采用夾芯式雜交方式,本發(fā)明方法具有較高的檢測靈敏度,對癌胚抗原(CEA)及甲胎蛋白(AFP)的檢測限能分別達到0.1ng/ml與0.5ng/ml。實驗中顯示兩者同時具有很好的特異性。
實施例3、乙型肝炎病毒的檢測1、制備乙型肝炎病毒抗體芯片蛋白芯片的制備方法參見文獻(何為,許丹科,劉志紅等。分析化學,2005,3337-40),所用的乙肝表面抗原(HBsAg)及抗乙肝表面抗原(anti-HBsAg)購自北京科衛(wèi)試劑公司。
2、乙肝表面抗原二抗的生物素標記將乙肝表面抗原二抗(anti-HBsAg,購自北京科衛(wèi)試劑公司)用PBS緩沖液配制成濃度為4mg/ml的待標記溶液,在此溶液中加入生物素并使其終濃度為2mg/mL,混均后反應4小時。反應完成后加入NH4Cl濃度為50mmol/L,室溫下放置10分鐘。取100微升溶液放入透析器中,室穩(wěn)下攪拌透析7小時后,樣品取出備用。
3、芯片雜交將抗體蛋白芯片放入芯片反應盒中,加入不同濃度的待測乙肝病毒表面抗原(HBsAg)樣品(北京科衛(wèi)試劑公司)100微升(濃度為0、0.1、1、10、100、1000ng/ml),與芯片反應1小時后,加入生物素標記的二抗孵育1小時。芯片清洗后加入膠體金標記的親合素試劑(Sigma公司,美國)50μL。在芯片上形成膠體金-抗原-抗體復合物。
4、檢測清洗芯片后,加入銀顯色增強試劑與抗體蛋白芯片反應15分鐘,利用金顆??纱呋y離子還原成金屬銀原理,在膠體金表面形成可通過目測法觀察到的銀顆粒。并用CCD攝像裝置檢測圖像,數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點的灰度值。
HBsAg抗原檢測灰度值與濃度的關(guān)系圖如圖5所示。實驗結(jié)果表明,利用生物素標記的二抗,采用夾芯式雜交方式,本發(fā)明方法建立的金屬銀增強方法具有較高的檢測靈敏度,對乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的檢測限達到0.5ng/ml。
實施例4、與肝臟疾病相關(guān)的其他標志物(人鐵蛋白、α-抗胰蛋白、銅藍蛋白、IgM、IgA、纖連蛋白和觸球蛋白等)的直接標記檢測法一、實驗方法1、蛋白芯片制備抗人鐵蛋白、抗α-抗胰蛋白、抗銅藍蛋白、抗IgM、抗IgA、抗纖連蛋白和抗觸球蛋白等抗體購自US Biological公司(美國),蛋白芯片的制備方法參見文獻何為,許丹科,劉志紅等。分析化學,2005,33(1)37-40.
2、待測樣品的生物素標記待測樣品人鐵蛋白、α-抗胰蛋白、銅藍蛋白、IgM、IgA、纖連蛋白和觸球蛋白等購自Sigma公司(美國)。待測樣品用PBS緩沖液配制,在此溶液中加入生物素使其終濃度為0.5mg/mL?;炀蠓磻?小時,反應完成后加入NH4Cl濃度為50mmol/L,室溫下放置10分鐘。取100微升溶液放入透析器中,室穩(wěn)下攪拌透析7小時后,樣品取出備用。
3、芯片雜交將抗體蛋白芯片放入自制的芯片反應盒中,加入不同濃度的生物素標記待測樣品100微升(樣品中各個蛋白的濃度值見圖6A-圖6G數(shù)據(jù)),與芯片反應1小時;清洗后加入膠體金標記的親合素試劑(Sigma公司,美國),在芯片上形成膠體金-抗原-抗體復合物。
4、實驗結(jié)果檢測清洗芯片后,加入銀顯色增強試劑與抗體蛋白芯片反應15分鐘,利用金顆??纱呋y離子還原成金屬銀原理,在膠體金表面形成可通過目測法觀察到的銀顆粒,并用CCD攝像裝置檢測圖像,數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點的灰度值。
二、實驗結(jié)果人鐵蛋白、觸球蛋白、銅藍蛋白、纖連蛋白、α-抗胰蛋白、IgA和IgM的相對灰度值與蛋白濃度的關(guān)系分別如圖6A-圖6G所示。本發(fā)明方法對上述蛋白的檢測靈敏度如表1所示。
表1.本發(fā)明方法對蛋白的檢測靈敏度

結(jié)果表明,在采用生物素直接標記蛋白,并用金屬銀增強檢測的方法能較為靈敏地檢測多種與肝臟疾病相關(guān)的蛋白抗原,顯示了本方法的簡便、靈敏、通用等諸多優(yōu)勢。
權(quán)利要求
1.一種蛋白芯片的檢測方法,包括如下步驟1)用生物素標記的待測蛋白二抗、待測蛋白與蛋白芯片進行雜交;或者直接以生物素標記的待測蛋白與蛋白芯片進行雜交;2)加入膠體金標記的親和素與蛋白芯片進行雜交,然后,再加入銀顯色增強試劑進行反應,檢測反應生成的銀顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法,其特征在于所述生物素標記的待測蛋白二抗或生物素標記的待測蛋白按如下步驟進行制備在待測蛋白二抗或待測蛋白的溶液中加入生物素,混勻反應,反應后透析得到生物素標記的待測蛋白二抗或生物素標記的待測蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法,其特征在于所述標記過程中,待測蛋白二抗或待測蛋白的溶液濃度為1~10mg/ml,所述生物素的終濃度為0.1~5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法,其特征在于所述待測蛋白為肝炎病毒抗原、肝癌抗原或與肝臟疾病相關(guān)的抗原蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法,其特征在于所述能檢測待測蛋白的蛋白芯片含有肝炎病毒的抗體,肝癌抗原的抗體或與肝臟疾病相關(guān)的抗原蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白芯片的檢測方法。本發(fā)明所提供的蛋白芯片的檢測方法,包括如下步驟1)用生物素標記的待測蛋白二抗、待測蛋白與蛋白芯片進行雜交;或者直接以生物素標記的待測蛋白與蛋白芯片進行雜交;2)加入膠體金標記的親和素再與蛋白芯片進行雜交,加入銀顯色增強試劑進行反應,檢測反應生成的銀顆粒。本發(fā)明方法的檢測靈敏度已達到、部分已超過熒光檢測的靈敏度,而無需采用昂貴的熒光檢測設(shè)備和熒光標記物,成本低廉。
文檔編號G01N33/576GK1743845SQ20051009367
公開日2006年3月8日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者許丹科, 劉志紅, 何為, 韓歡歡 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所
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