專利名稱：變應(yīng)原(過敏原)蛋白芯片檢測技術(shù)的制作方法
發(fā)明所屬領(lǐng)域生物領(lǐng)域發(fā)明目的提供高通量變應(yīng)原快速篩選和檢測技術(shù)。
本發(fā)明涉及一種變應(yīng)原(過敏原)蛋白芯片快速檢測技術(shù)，包括高通量熒光檢測技術(shù)和低通量膠體金層析技術(shù)，是根據(jù)陣列固定變應(yīng)原檢測血清中IgE的原理設(shè)計的。高通量檢測芯片可以同時測定血清中數(shù)個至數(shù)千特異性的IgE抗體，可應(yīng)用于臨床上過敏性疾病過敏原的篩查。特別是低通量膠體金層析技術(shù)，可以在15分鐘內(nèi)獲得結(jié)果，不需特殊儀器設(shè)備，適宜于基層醫(yī)院的普及檢查。
變應(yīng)原(Allergens)也稱變態(tài)反應(yīng)(Allergy)原或過敏原，是一類可以引發(fā)機體變態(tài)反應(yīng)的外源性物質(zhì)。而變態(tài)反應(yīng)則是機體組織病理性損害的免疫反應(yīng)。就是說，當機體再次接觸同一抗原時，機體發(fā)生的反應(yīng)不是保護性的免疫，而是不同形式的免疫病理損傷過程，甚至可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
變應(yīng)原大都是蛋白質(zhì)性質(zhì)，對于機體而言是屬于外源性的蛋白質(zhì)，對機體免疫系統(tǒng)具有致敏的作用，產(chǎn)生相應(yīng)的IgE抗體(I型變態(tài)反應(yīng))。當人體對某致敏物(變應(yīng)原)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)后，機體免疫系統(tǒng)具有記憶效應(yīng)，當該致敏物再次浸入時，便誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)。檢測有無變態(tài)反應(yīng)，只要檢測致敏個體內(nèi)有無相應(yīng)的IgE存在就可以了。這種檢測方法可以采用直接法或夾心法，固定變應(yīng)原，然后根據(jù)蛋白質(zhì)之間相互職別的原理檢測血清中是否存在相應(yīng)的IgE抗體。
變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生主要涉及兩方面的因素一為抗原物質(zhì)(變應(yīng)原)的性質(zhì)；另一方面是機體對抗原的應(yīng)答性(特定性，過敏體質(zhì))。變應(yīng)原大都是含有蛋白質(zhì)一類的物質(zhì)，在室內(nèi)外環(huán)境中經(jīng)常能接觸到的常有下列幾種。
(1)吸入性變應(yīng)原 常常是一種或幾種微細的顆粒，如家禽或家畜身上皮屑、羊毛毯、絨線衫或羽絨衣上脫落的毳毛，花蕊中飄落的花粉、細菌、真菌塵螨等。塵螨個體極小，與灰塵混在一起，躲藏在木門窗或木椅桌的縫隙、沙發(fā)、枕頭里，并可隨灰塵到處飄揚，成為和哮喘病人纏繞在一起的″終身變應(yīng)原″。
(2)攝入性變應(yīng)原 是從口腔進入，例如牛奶、雞蛋、魚、蝦、蟹及海鮮等。
(3)接觸性變應(yīng)原 是指某些日用化妝品，如美膚霜、護膚霜等，涂擦于皮膚吸收到體內(nèi)也可引起過敏反應(yīng)，輕者有接觸性皮炎，重者亦可導(dǎo)致哮喘發(fā)作。
大約有20％以上的人患過過敏，其中2～5％必需去醫(yī)院進行診療。在美國、日本和歐洲等國家，變應(yīng)原的檢測已相當普遍，已經(jīng)作為變態(tài)反應(yīng)性疾病的常規(guī)檢測項目。但在我國，變應(yīng)原的檢測尚未得到應(yīng)有的重視，而仍在采用傳統(tǒng)的診斷模式，這并不利于臨床上變態(tài)反應(yīng)性疾病的及時確診和治療，也給病人帶來額外的痛苦。現(xiàn)有變應(yīng)原的診斷方法有2類1.利用病人身體所做的檢測
1)刺皮試驗 一般采用小針輕輕刺破前臂皮膚，并滴一滴含已知變應(yīng)原的液體，可以很快看到結(jié)果。陽性結(jié)果為針刺部位紅腫、皮丘。一般15-20分鐘達到最大，幾小時后褪去。過敏性皮炎多數(shù)采用該技術(shù)進行變應(yīng)原篩查。
2)斑貼試驗這種試驗主要用于延緩型變態(tài)反應(yīng)的診斷，如接觸性皮炎等，測試方法是將變應(yīng)原以斑點的方式貼敷在皮膚上保持48小時。這類試驗可以測試象橡膠、鎳金屬、羊毛脂、染料、化妝品、溶劑、防腐劑以及藥物等。
3)激發(fā)試驗在醫(yī)院，醫(yī)生通常把懷疑的變應(yīng)原拿來進行直接激發(fā)試驗，比如食物雙盲試驗，讓病人吞服含有懷疑食品的膠囊，醫(yī)生觀察病人對食品的反應(yīng)。這種試驗只能在有指定專業(yè)醫(yī)師和特定解除設(shè)備的情況下才可進行。
2.體外血液學檢驗1)放射變應(yīng)原吸附試驗(RAST)RAST是將純化的變應(yīng)原與固相載體結(jié)合，加入待檢血清及參考對照，再與同位素標記的抗IgE抗體反應(yīng)，然后測定固相的放射活性，通過標準曲線求出待檢血清中特異性IgE的含量。
2)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)試驗酶聯(lián)免疫測定法試驗原理及步驟基本同RAST，僅是最后加入酶標記的抗IgE，利用酶底物進行顯色。除了ELISA技術(shù)外，還有采用熒光檢測的方法。ELISA技術(shù)一般都是單個變應(yīng)原的檢測，要做完整的變應(yīng)原篩選，需做幾十個試驗?，F(xiàn)有變應(yīng)原檢測技術(shù)存在以下不足1)利用病人身體做變應(yīng)原檢測 利用病人身體做變應(yīng)原檢測仍然是臨床在用的方法，這類方法存在效率低，需病人到現(xiàn)場，針刺疼痛、測試時間長、存在激發(fā)變態(tài)反應(yīng)及交叉污染的可能等缺點。
2)一次檢測一個變應(yīng)原 RAST技術(shù)、ELISA技術(shù)一般都是單個變應(yīng)原的檢測，要做完整的變應(yīng)原篩選，需做幾十個試驗。目前雖有96孔微板格式的測試方法，可以同時測試96個病人，但對變應(yīng)原篩選毫無幫助。
3)操作煩瑣 利用病人身體所做的測試，均存在操作煩瑣的缺陷。
4)操作費時 皮試試驗、斑貼試驗和體內(nèi)激發(fā)試驗，均需檢測人員在現(xiàn)場相陪，監(jiān)視整個檢測過程和陽性結(jié)果的出現(xiàn)，特別是過敏原的超敏反應(yīng)，可誘發(fā)嚴重的休克甚至致命，因此醫(yī)生承擔著很大的心里壓力。
5)檢測成本高 由于現(xiàn)有方法均為單個變應(yīng)原的檢測，收費也高，若要進行多變應(yīng)原的篩選，檢測成本大幅上升。
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺陷和不足，采用高集成度的蛋白芯片檢測技術(shù)，同時檢測幾十甚至幾千個變應(yīng)原，當采用高密度玻片構(gòu)建高通量高集成蛋白芯片時，采用熒光標記技術(shù)，可以高靈敏地同時檢測所有已知的變應(yīng)原；當采用層析技術(shù)和膠體金標記技術(shù)時，可以實現(xiàn)快速的檢測。具體實現(xiàn)方法如下I.高通量變應(yīng)原蛋白芯片熒光檢測方法1.變應(yīng)原浸液的制備變應(yīng)原浸液的制備，包括下列各項步驟粉碎、凈化、去脂、提取、過濾與分離、透析、濃縮、酸堿度的測定及校正、除菌過濾、分裝、滅菌檢查、毒性試驗、標準化、貼標簽及填寫制備記錄單、冷藏等步驟。以上步驟適用于所有變應(yīng)原浸液的制備。但并非所有材料均一成不變地依上列程序處理。例如一些不含脂肪的材料(如蔬菜、水果等)則不需要去脂；顆粒細小的物質(zhì)不需要再研磨或打碎。需要透析和濃縮的也只有少數(shù)制劑。
2.重組變應(yīng)原蛋白變應(yīng)原浸液的缺陷是其中含有許多雜蛋白，重組變應(yīng)原蛋白可以克服這個缺陷。制備時將相應(yīng)變應(yīng)原DNA(見附件)構(gòu)建原核細胞表達質(zhì)?；蛘婧思毎磉_質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到大腸桿菌或哺乳動物細胞進行表達，采用一定的方法如6×His技術(shù)純化變應(yīng)原蛋白，用作芯片的探針之用。
3.變應(yīng)原陣列設(shè)計現(xiàn)在明確能夠引起變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì)或蛋白質(zhì)有400多種，氨基酸序列也已弄清。由于這是高通量蛋白芯片，可以根據(jù)變應(yīng)原的來源情況以及本地區(qū)的流行病發(fā)生情況，決定選擇變應(yīng)原組合構(gòu)建蛋白芯片。
使用純化的變應(yīng)原，可以提高實驗的準確性和敏感性。若使用粗制變應(yīng)原，其蛋白質(zhì)含量應(yīng)先測出。測定方法可采用微量凱氏定氮法，測出蛋白氮單位/毫升?？筛鶕?jù)100 000個蛋白氮單位為1毫克氮，換算成每毫升變應(yīng)原蛋白質(zhì)含量(以微克計量)。絕大部分變應(yīng)原均適用于本法。大多數(shù)變應(yīng)原經(jīng)凍干或干燥后，可保存數(shù)月不失其活性。
4.變應(yīng)原點樣構(gòu)建蛋白芯片應(yīng)用三維點樣機器人點樣法是將預(yù)先制備好的變應(yīng)原，通過由陣列點樣機(arrayer)，準確、快速地將不同變應(yīng)原樣品定量點樣于經(jīng)過醛基修飾過的玻片或硅片上，再經(jīng)封閉、漂洗、干燥等過程制成變應(yīng)原蛋白芯片。
點樣的方式分兩種，其一為接觸式點樣，即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將變應(yīng)原樣品留在固相支持物上；其二為非接觸式點樣，即噴點，它是以壓電原理將蛋白質(zhì)樣品通過毛細管直接噴至固相支持物表面。點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置、多個打印/噴印頭、一個減震底座，上面可放內(nèi)盛蛋白探針的多孔板(384孔)和多個芯片。
根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。
標準化的變應(yīng)原，1∶50稀釋，一般用50mM PBS稀釋即可。稀釋后將變應(yīng)原(3-10μl)加到微孔板內(nèi)，啟動點樣機器人進行點樣。高密度點樣機(如Cartesian Technology公司的MicroSys 5100小型臺式芯片工作站；PixSys 5500 PA Workstation)可以制造每平方厘米2500探針的芯片；而中密度點樣機(噴印機)可以在每平方厘米上排列400個探針。為了防止點樣的誤差，一般每變應(yīng)原需點樣2-3次。
用于制作芯片的玻片必須特別清潔和平滑，表面包被醛基功能基團，能與蛋白質(zhì)分子中的氨基基團反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵。玻片具有不浸潤性，可以制作密度很高的蛋白芯片(2500點/cm2)，同時還可使反應(yīng)體積降低到最小；玻片的熒光信號本底低，不會造成很強的背景干擾；玻璃芯片可使用雙熒光甚至多熒光雜交系統(tǒng)，可在一個反應(yīng)中同時對兩個以上的樣本進行平行處理。
然而，玻片的缺點是表面結(jié)合的蛋白容量有限，蛋白質(zhì)的活性不容易保持。S&S公司的CAST Slides(Cat.No.10484181)將SuperCharge正電荷尼龍膜附著在玻片上，這種特殊的玻片綜合了尼龍膜的高親和力和玻片剛性的優(yōu)點，而FAST Slides(Cat.No.10484182)則是在玻片表面包被一種硝酸纖維膜材料，能與蛋白質(zhì)以非共價但是不可逆的方式結(jié)合。由于表面包被層的多孔性和厚度使單位面積的蛋白質(zhì)結(jié)合能力比常規(guī)化學表面處理玻片要高得多，使得檢測更加靈敏。適用的檢測方法包括同位素檢測、化學發(fā)光法和熒光檢測--由于包被的多聚物有效降低對入射光的散射，F(xiàn)AST Slide同樣適合用激光共聚焦成像系統(tǒng)進行熒光掃描檢測。
5.芯片與血清的孵育病人血清含有特定的抗變應(yīng)原的IgE抗體，可以與芯片上相應(yīng)的變應(yīng)原結(jié)合，再應(yīng)用熒光標記的兔、羊、馬等抗人IgE抗體與之反應(yīng)，若體內(nèi)有相應(yīng)的IgE存在，便在相應(yīng)的變應(yīng)原位點出現(xiàn)熒光。具體檢測方法是1)加待測血清。取待測血清和陰性參考血清，用10％小牛血清PBS-T(1000ml含氯化鈉8.0g；磷酸二氫鉀0.2g；磷酸氫二鈉2.9g；氯化鈣0.2g；Tween-20 0.5g；pH7.4)稀釋成1∶20濃度，加到芯片變應(yīng)原探針區(qū)域，每片加200微升，于保濕盒內(nèi)，37℃下保溫1-2小時。
2)PBS-T洗芯片，每次3分鐘，共3次。
3)加結(jié)合物。取FITC標記的羊抗人IgE結(jié)合物，用PBS-T稀釋成1∶200。然后加到芯片上，每片加200微升，于保濕盒內(nèi)，37℃下保溫1-2小時。。
4)PBS-T洗芯片，每次3分鐘，共3次。
5)晾干掃描。
6.熒光掃描，結(jié)果報告。
采用激光掃描儀掃描，根據(jù)所標記的熒光物質(zhì)，選擇適當?shù)牟ㄩL，掃描。
激光掃描技術(shù)，是目前最敏感也是最復(fù)雜的檢測技術(shù)，需要昂貴的掃描儀(例如ScanArray 5000)，這些掃描儀具有很高的分辨率，可用于高密度蛋白芯片的檢測。
II.多變應(yīng)原快速層析芯片在既定的環(huán)境下，比如一定的季節(jié)，常見的過敏原一般為數(shù)不是很多，前20個常見過敏原可以涵蓋95％的病人，因此，可以設(shè)計適用于不同季節(jié)、不同地區(qū)的變應(yīng)原檢測芯片。這類芯片可以采取層析技術(shù)進行快速檢測，檢測過程非常簡單，不須任何專業(yè)訓(xùn)練，不需任何設(shè)備，整個檢測過程可以在15-30分鐘內(nèi)完成。膠體金層析法是將多個試劑組合在一個約6mm×70mm的塑料板條(附圖)上，成為單一試劑條，試劑條上端和下端分別粘貼吸水材料和玻璃纖維樣本墊，免疫金復(fù)合物干片粘貼在近下端處，緊貼其上為硝酸纖維素膜條。硝酸纖維素膜條上有數(shù)個測試區(qū)，測試區(qū)包被有各種變應(yīng)原，對照區(qū)包被有IgE的抗體。其制備、檢測過程如下1.變應(yīng)原浸液的制備根據(jù)不同的變應(yīng)原材料，進行下列全部或部分步驟的操作粉碎、凈化、去脂、提取、過濾與分離、透析、濃縮、酸堿度的測定及校正、除菌過濾、分裝、滅菌檢查、毒性試驗、標準化、貼標簽及填寫制備記錄單、冷藏等步驟。
2.膜條準備采用Millipore公司的中等流速的硝酸纖維素濾膜。試劑墊、樣本墊、吸收墊等均可采用Millipore或Whatman公司的產(chǎn)品。與玻片相比，膜的優(yōu)點是與蛋白親和力強，檢測技術(shù)成熟，通常無需另外修飾。硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF膜等都是帶有微孔的濾膜，其孔徑一般在0.45μm～15μm左右，在顯微鏡下這種膜就是一個立體的纖維網(wǎng)絡(luò)，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)探針，使檢測更加靈敏。同時，這種多孔結(jié)構(gòu)可使液體在其中進行自由擴散，當在膜的一端給以液體擴散壓力時，液體將沿一定方向擴散，例如沿條狀膜條的單方向擴散。因此硝酸纖維素膜及其他層析膜，既是立體的網(wǎng)絡(luò)固定載體，又是層析的良好材料，是制作低密度層析蛋白芯片的最佳支撐載體。
3.噴樣標準化的變應(yīng)原，1∶50稀釋，蛋白濃度1-3mg/ml左右，一般用50mM PBS稀釋即可。稀釋后將變應(yīng)原(100μl)加到噴樣儲液瓶內(nèi)，應(yīng)用微量噴膜機(BioDot)，將變應(yīng)原溶液噴線于膜的相應(yīng)位置，噴膜的體積控制在1μl/cm，噴樣結(jié)束后，室溫真空抽干，或37℃干燥2小時，使抗體探針牢固地固定于硝酸纖維素膜的表面。噴樣后的膜應(yīng)保存于干燥和4℃環(huán)境。封閉時用5％BSA封閉液，于保濕盒內(nèi)，37℃下保溫1小時。
標準層析膜條一般有20-25mm長，可以噴線2-20條，也可以進行噴點，密度較高，但制備效率顯著降低。在膜的兩端須設(shè)質(zhì)量控制線。
4.膠體金制備技術(shù)制備方法膠體金的制備多采用還原法。將HauCl4先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。攪動下準確加入1.5ml的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液。繼續(xù)加熱煮沸15分鐘。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2～3分鐘。冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。
5.膠體金標記羊抗人IgE抗體用膠體金標記蛋白質(zhì)，就是指蛋白質(zhì)吸附到膠體金顆粒表面。膠體金表面帶有負電荷，能與蛋白質(zhì)的正電荷靜電吸引而形成牢固的結(jié)合。由于這種結(jié)合主要是物理作用，所以不會引起蛋白質(zhì)活性的改變。標記前，需確定膠體金與待標記蛋白質(zhì)的比例和將pH值調(diào)節(jié)到標記蛋白質(zhì)IgG的等電點或略高(pH8.0)。標記時，將待標記羊抗人IgE抗體1mg加15ml膠體金溶液(1OD)，混合，室溫攪拌15分鐘，加入10mg BSA，混合5分鐘，離心，再通過離心法或凝膠層析法純化標記的羊抗人IgE抗體。
6.切割與芯片裝配采用切割機將復(fù)合好的膜片切成所需的規(guī)格和形狀，即成單人用檢測試劑膜條。將單人份試劑膜條及干燥劑裝入鋁薄膜小袋并封閉。
7.層析檢測測定時將膜條下端(附圖)1浸入被檢液體標本中，由于層析效應(yīng)，液體向上端吸水纖維處7移動，流經(jīng)膠體金試劑墊2處時使干片上的免疫金復(fù)合物(羊抗人IgE抗體9包被的膠體金顆粒10)復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。若標本中有待測特異性IgE抗體11存在，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體9結(jié)合，此抗體復(fù)合物流至測試區(qū)4即被相應(yīng)的固相變應(yīng)原所浮獲，在膜條上顯出紅色反應(yīng)沉淀線。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)5與固相IgE抗體11結(jié)合，而顯出紅色質(zhì)控線條。反之，陰性標本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
8.ELISA技術(shù)檢測其操作方法是，將純化的變應(yīng)原與固相載體結(jié)合，加入待檢血清及參考對照，再與酶標記的抗IgE抗體反應(yīng)，然后測定固相的酶底物生色反應(yīng)，通過標準曲線求出待檢血清中特異性IgE的含量。
9.結(jié)果分析此試驗以膠體金等有色微粒作為標記物，減少了操作步驟，可以直接用肉眼觀察結(jié)果，而試劑可以在室溫長期保存。這樣一來就簡化成一個試劑，一步完成的快速診斷試驗，試驗的特異性與ELISA相同，敏感性接近ELISA。膠體金免疫層析法的突出優(yōu)點是敏感，特異，簡便，快捷，不需要任何特殊的儀器設(shè)備。因此適合基層單位普遍使用，另外特別適用于急診，可方便地立時得知檢測結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點本變應(yīng)原檢測蛋白芯片產(chǎn)品，則將需篩查的變應(yīng)原制成陣列，多至數(shù)千個，因此一次檢測可以得到幾乎所有變應(yīng)原的致敏信息。該產(chǎn)品特點是A)高通量測定利用高密度蛋白芯片制作技術(shù)，可以一次同時檢測所有已知甚至未知的變應(yīng)原，其檢測數(shù)量不受限制。
B)并行數(shù)據(jù)處理通過一次檢測得到的信息，可以進行數(shù)據(jù)處理，具有高度的可比性，避免了現(xiàn)有技術(shù)的多次檢測出現(xiàn)的結(jié)果誤差。
C)微型化由于是高密度技術(shù)，所需的檢測血清樣本很少，100μl血清可以完成所有變應(yīng)原的檢測。
D)定量測定可以直接通過熒光掃描進行變應(yīng)原的半定量?；蛴梅瓷湮舛扔媽Π唿c顏色(膠體金層析方法)的強度進行測定，可得到半定量的結(jié)果，用于膠體金層析半定量的多種簡便精確的專用儀器已有供應(yīng)。
E)快速測定膠體金層析檢測多變應(yīng)原(3-20個)，可以在15-30分鐘內(nèi)得到結(jié)果。還可在同一裝置上測試多個標本，以便于對常用檢驗作多份測定，這種形式也有利于定量，可同時作標準品對照。
F)分組測定根據(jù)許多變應(yīng)原相似性的原理，可以采用混合變應(yīng)原分組定位，然后再應(yīng)用特異變應(yīng)原篩選陽性變應(yīng)原，這種方法最適合采用膠體金技術(shù)分層檢測，為臨床提供更大的方便。
以下結(jié)合實例和


本發(fā)明的操作方法。
附圖.變應(yīng)原膠體金層析裝置1 樣本墊(加樣區(qū)) 7 吸水墊
2 膠體金試劑墊 8 固定的變應(yīng)原探針3 硝酸纖維膜層析區(qū) 9 包被在膠體金表面的抗IgE抗體4 測試區(qū)(固定各種變應(yīng) 10 膠體金顆粒原)5 對照區(qū)(固定有人IgE) 11 人IgE抗體(對照)6 支撐膜實例1花粉變應(yīng)原的抽提1.花粉的收集及處理1)于授粉季節(jié)，將花序采回實驗室，攤開在潔凈的紙上晾曬，花粉即逐漸脫落。榆、白蠟、胡桃、楊、樺木、榿木、櫟等花序，應(yīng)先用清水洗去浮塵，再攤開晾曬。在晾曬中至不斷翻動，促使盡快干燥。
2)將干燥的花序放入高速組織搗碎機中打碎，然后先用3號篩篩除顆粒較大的雜質(zhì)，再通過7號或8號篩。篩出花粉。
3)將落下的花粉收集一起，通過8號或9號篩，去除雜質(zhì)；4)苯、甲苯、乙醚各去脂一次，約4-5小時。乙醚用量以沒過花粉2-3倍為宜。
2.變應(yīng)原浸液的制備方法1)去脂花粉按1∶25比例加入碳酸氫鹽—鹽水提取液(Coca｀s solution，pH8.2；1000ml中含有氯化鈉2.5g；碳酸氫鈉2.75g；結(jié)晶酚4.0g)；在4℃冰箱內(nèi)提取72小時，提取過程中每天振蕩或攪拌2小時。
2)常壓過濾澄清液體，如液體較粘稠，可先使用離心法分離。再用常壓過濾。
3)用1N HCl調(diào)整pH至7.0。
4)經(jīng)消毒蔡氏濾器除菌過濾后，于無菌操作下分裝于滅菌疫苗瓶中。
5)抽取少量原液，進行蛋白濃度測定，一般應(yīng)達到1-3mg/ml蛋白質(zhì)。
6)貼好標簽，打上批號，填寫好制備記錄單，放入4℃冰箱冷藏備用。實例2塵螨變應(yīng)原浸液的制備螨是屬于蛛形綱的一類微小動物，大約有5萬種之多。與變態(tài)反應(yīng)有關(guān)的主要為麥食螨科(Pyroglyphidae)的塵螨屬(Dermataphagoides Bogdanov)和嗜霉螨屬(Eurolyphus Fain)。這幾種螨都是強烈的變應(yīng)原。螨體的各部分及其分泌物和排泄物等，均可引起致敏。這些物質(zhì)隨著鋪床、疊被、掃地時飛揚于空氣中，當被體質(zhì)過敏的人吸入到支氣管和毛細支氣管中，即引起發(fā)病。塵螨變應(yīng)原活性部分分子量在10000-60000之間，活性最強者為酸性蛋白，分子量在20000-50000之間。
1.塵螨的收集方法1)粉塵螨的繁殖高峰在每年的春秋5-6月初9-10月，收集應(yīng)在這兩個季節(jié)內(nèi)進行。從糧店、面粉廠的地面及騰空的米、面袋內(nèi)收集下腳粉塵，帶回實驗室。
2)將粉塵過2號分樣篩，去除雜質(zhì)；再過4號分樣篩，去掉顆粒細小的粉塵。中間一層即為含螨粉塵。
3)將上述含螨粉塵倒入平底搪瓷盒或飯盒內(nèi)，鋪成薄層，再用玻片將其理平。
由于螨的活動破壞了粉塵光滑的表面，出現(xiàn)小突起，由此即可查出螨類，并進行人工培養(yǎng)，獲得大量的純螨材料。
2.塵螨的處理方法1)丙酮滅活、清洗后.用多層紗布濾除丙酮。留在紗布中的含螨材料，涂片鏡檢，以螨的含量在80％以上為合格。
2)將經(jīng)鏡檢合格的材料，加入乙醚去脂一次(約4小時)，即可密閉貯存?zhèn)溆谩?br> 3.塵螨變應(yīng)原浸液的制備方法1)取去脂塵螨干粉按1∶50比例(w/v)加入碳酸氫鹽-鹽水提取液(參見實例1)。
2)在冰箱內(nèi)提取72小時。提取過程中，每天振蕩或攪拌2小時。
3)常壓過濾澄清液體。
4)用1N HCl調(diào)整pH至7.0。
5)除菌過濾，分裝于無菌疫苗瓶中。
6)抽取樣品，進行蛋白濃度測定?？刹扇CA蛋白定量法，最終蛋白濃度調(diào)節(jié)到1-3mg/ml。
7)貼好標簽，打上批號，填寫好制備記錄單。
8)冰箱冷藏備用。
實例3全變應(yīng)原蛋白芯片制作與檢測1.全變應(yīng)原的材料目前已知是蛋白質(zhì)及氨基酸序列的變應(yīng)原已超過280多種(見附件)。
2.全變應(yīng)原的收集參見實例1和實例2的變應(yīng)原浸液制備。
3.變應(yīng)原制備將被提取的材料按重量比容積(w/v)浸泡在相應(yīng)的提取液內(nèi)48-72小時。提取過程中每日攪拌或振蕩2小時左右，以促使材料中活性成分的浸出。
為避免微生物的侵襲，在停止攪拌或振蕩時，應(yīng)將材料放入冰箱冷藏。如放置室溫下，則需加防腐劑，通常加入0.1％毫升甲苯即可。但在除菌過濾前，應(yīng)將提取材料中的甲苯去除干凈，方法可采用電扇吹拂，促使其揮發(fā)。
為了將材料中的蛋白質(zhì)盡可能地提取出來，可應(yīng)用反復(fù)提取法提取。方法是將每次提取后的沉淀物，再加入少許提取液反復(fù)浸泡提取幾次，直到被提取的材料中不再含有或僅含微量蛋白質(zhì)為止。這可以根據(jù)提取液中不發(fā)生縮脲反應(yīng)來識別；也可以根據(jù)用醋酸溶液酸化之后，加熱時沒有沉淀形成來識別。但進行反復(fù)攝取后獲得的溶液，必須濃縮至第一次提取后所得到的浸液總量。例如屋塵經(jīng)提取后，所得濾液為500塞升，再經(jīng)反復(fù)提取，濾液總量必然要超過500毫升，但無論超過多少，最后要求均濃縮至500毫升。
4.變應(yīng)原點樣芯片支撐物為醛基玻片。
將標準化的變應(yīng)原1∶50稀釋，一般用50mM PBS稀釋即可。稀釋后將變應(yīng)原(3-10μl)加到384微孔板內(nèi)，啟動點樣機器人進行點樣。高密度點樣機(如MicroSys 5100小型臺式芯片工作站)可以制造每平方厘米2500探針的芯片；而中密度點樣機(噴印機)可以在每平方厘米上排列400個探針。為了防止點樣的誤差，一般每變應(yīng)原需點樣2-3次。
5.芯片封閉、保存變應(yīng)原全部點到玻片上以后，室溫晾干，放置至少2小時，然后直接浸入1％BSA(10mM PBS，pH7.4)液中半小時，冷蒸餾水沖洗、晾干，置于放置干燥劑的密封玻片盒內(nèi)，4℃保存。用前取出，并在室溫下使溫度上升至室溫，取出玻片，進行檢測。
6.檢測過程1)加待測血清。取待測血清和陰性參考血清，用含10％小牛血清PBS-T(1000ml含氯化鈉8.0g；磷酸二氫鉀0.2g；磷酸氫二鈉2.9g；氯化鈣0.2g；Tween-20 0.5g；pH7.4)稀釋成1∶20濃度，加到芯片變應(yīng)原探針區(qū)域，每片加200微升，于保濕盒內(nèi)，37℃下保溫1-2小時。
2)PBS-T洗芯片，每次3分鐘，共3次。
3)加結(jié)合物。取FITC標記的羊抗人IgE結(jié)合物，用PBS-T稀釋成1∶200。然后加到芯片上，每片加200微升，于保濕盒內(nèi)，37℃下保溫1-2小時。
4)PBS-T洗芯片，每次3分鐘，共3次。
5)晾干掃描。
7.結(jié)果分析根據(jù)羊抗人IgE抗體標記的熒光素類型，選擇適當?shù)募す獠ㄩL，進行掃描。
如ScanArray 5000的氬離子激光，選用波長488激光掃描。
實例4吸入類變應(yīng)原蛋白層析芯片的制作與檢測1.常見吸入類變應(yīng)原材料的收集1〕常見室內(nèi)變應(yīng)原貓毛發(fā)皮屑(Cat epithelium)；粉塵螨(D.farinae)；點青霉菌(Penicillum not.)；煙曲霉菌(Aspergillus fum)；交鏈孢霉菌(Alternariatenuis)；狗毛發(fā)皮屑(Dog dander)；屋塵螨(D.pteonyssinus)；芽枝霉菌(Cladosporium)；蟑螂(Cockroach)；鵝毛(Goose feather)。
2〕常見花粉變應(yīng)原樺樹(Birch)；楊樹(Cottonwood)；柳樹(Willow)；杞木(Alder)；榆樹(Elm)；牧草(Timothy)；豚草(Ragweed)；野苣(Lam′s Quarter)；藜草(Pigweed)；蕁麻(Nettle)。
2.變應(yīng)原制備參見實例1和實例2。
3.膠體金抗體包被采用商用供應(yīng)的膠體金溶液，顆粒直徑為20nm。標記前，需確定膠體金與待標記蛋白質(zhì)的比例和將pH值調(diào)節(jié)到標記蛋白質(zhì)IgG(抗人IgE)的等電點或略高(pH8.0)。標記時，將待標記羊抗人IgE抗體1mg加15ml膠體金溶液(1OD)，混合，室溫攪拌15分鐘，加入10mg BSA，混合5分鐘，離心，再通過離心法或凝膠層析法純化標記的羊抗人IgE抗體。
4.噴樣選用Millipore公司的中等流速的硝酸纖維膜。試劑墊、樣本墊、吸收墊等均采用Millipore公司的產(chǎn)品。
標準化的變應(yīng)原，1∶50稀釋，蛋白濃度1-3mg/ml左右，一般用50mM PBS稀釋即可。稀釋后將變應(yīng)原(100μl)加到噴樣儲液瓶內(nèi)，應(yīng)用微量噴膜機(BioDot)，將變應(yīng)原溶液噴線于膜的相應(yīng)位置，噴膜的體積控制在1μl/cm，噴樣結(jié)束后，室溫真空抽干，或37℃干燥2小時，使抗體探針牢固地固定于硝酸纖維素膜的表面。噴樣后的膜應(yīng)保存于干燥和4℃環(huán)境。封閉時用5％BSA封閉液，于保濕盒內(nèi)，37℃下保溫1小時。
標準層析膜條一般有20-25mm長，可以噴線10-20條，也可以進行噴點，密度較高，但制備效率顯著降低。在膜的兩端須設(shè)質(zhì)量控制線。
5.包裝變應(yīng)原噴樣結(jié)束后，先后貼上樣本墊、膠體金試劑墊、吸水墊等后，采用切割機將復(fù)合好的膜片切成所需的規(guī)格和形狀，制成完整的檢測裝置，然后將檢測裝置放置在干燥袋內(nèi)。
6.層析檢測病人血樣(200μl)采集后，離心去除血細胞，收集血清進行下列層析檢測。測定時將膜條下端(附圖)1浸入被檢液體標本中，由于層析效應(yīng)，液體向上端吸水纖維處7移動，流經(jīng)膠體金試劑墊2處時使干片上的免疫金復(fù)合物(羊抗人IgE抗體9包被的膠體金顆粒10)復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。
若標本中有待測特異性IgE抗體11存在，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體9結(jié)合，此抗體復(fù)合物流至測試區(qū)4即被固相變應(yīng)原所浮獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)5與固相IgE抗體11結(jié)合，而顯出紅色質(zhì)控線條。反之，陰性標本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
7.結(jié)果分析直接用肉眼即可判斷結(jié)果，陽性者，在相應(yīng)的變應(yīng)原線上有紅色物質(zhì)沉積，同時控制線也為陽性反應(yīng)。如果需要進行定量，可用膠體金專用檢測儀讀取數(shù)據(jù)，或?qū)⒛l置于一般掃描儀上掃描，讓電腦進行相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。
附件 已知序列的部分蛋白質(zhì)過敏原
權(quán)利要求
1.一種變應(yīng)原蛋白芯片快速檢測技術(shù)，包括高通量熒光檢測技術(shù)和低通量膠體金層析技術(shù)，是根據(jù)陣列固定變應(yīng)原檢測血清中IgE的原理設(shè)計的，具體制作和檢測過程如下A)候選變應(yīng)原的選擇，及變應(yīng)原浸液或變應(yīng)原蛋白抗原的制備；B)變應(yīng)原陣列設(shè)計和變應(yīng)原固定，如是高通量檢測方法，則采用修飾玻片和機器人點樣技術(shù)，將變應(yīng)原蛋白陣列于玻片表面；如是低通量檢測方法，則采用多孔濾膜類材料和噴線或噴點方法制成多變應(yīng)原層析檢測膜條；C)高通量芯片的檢測方法，是將芯片與被檢血清孵育，讓IgE與特異性的變應(yīng)原結(jié)合，再用熒光物質(zhì)標記的兔、羊、馬等抗人IgE抗體與之反應(yīng)，若被檢血清中有相應(yīng)的IgE存在，便在相應(yīng)的變應(yīng)原位點出現(xiàn)熒光信號；D)低通量膠體金層析檢測方法，是預(yù)先將抗人IgE抗體包被的膠體金預(yù)置在層析膜條的一端的試劑墊，檢測時將膜條的一端直接浸入被檢樣本血清，血清經(jīng)層析效應(yīng)流經(jīng)膠體金試劑墊處使之復(fù)溶，并向變應(yīng)原陣列線滲移，特異性IgE被俘獲固定，出現(xiàn)紅色沉淀。E)結(jié)果分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的候選變應(yīng)原的選擇，其特征在于到目前為止的所有的變應(yīng)原均可應(yīng)用本發(fā)明的方法加以檢測，變應(yīng)原可以是從可疑物質(zhì)制備的變應(yīng)原浸液，也可以是重組蛋白變應(yīng)原，可根據(jù)需要選擇其中一部分或任意組合制備變應(yīng)原蛋白芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的變應(yīng)原固定，其特征是將各種變應(yīng)原直接陣列固定于修飾玻片或多孔濾膜表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和3所描述的變應(yīng)原固定，其特征在于采用修飾玻片固定變應(yīng)原，修飾玻片包括醛基修飾玻片、epoxy修飾玻片以及硝酸纖維膜包被的玻片。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和3所描述的多孔濾膜材料，其特征在于多孔濾膜材料具有液體層析滲移效應(yīng)，這些濾膜包括硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的高通量檢測方法，其特征在于固定的變應(yīng)原的數(shù)量在20至2500個之間，以熒光物質(zhì)標記的抗IgE抗體檢測為主。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的低通量膠體金層析檢測方法，其特征在于一個檢測膜條上固定2-20個變應(yīng)原，以膠體金包被的抗IgE抗體檢測為主。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種變應(yīng)原蛋白芯片檢測技術(shù)，包括高通量熒光檢測技術(shù)和低通量膠體金層析技術(shù)，是根據(jù)陣列固定變應(yīng)原檢測血清中IgE的原理設(shè)計的。高通量檢測芯片可以同時測定血清中數(shù)個至數(shù)百特異性的IgE抗體，可應(yīng)用于臨床上過敏性疾病過敏原的篩查。特別是低通量膠體金層析技術(shù)，可以在15分鐘內(nèi)獲得結(jié)果，不需特殊儀器設(shè)備，適宜于基層醫(yī)院的普及檢查。
文檔編號G01N33/68GK1485619SQ02137158
公開日2004年3月31日 申請日期2002年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月26日
發(fā)明者繆金明 申請人:繆金明