專利名稱：一種經(jīng)過表面修飾活化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，特別是涉及一種經(jīng)過表面修飾活化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料及其作為生物標(biāo)記物在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(Up-Converting Phosphor，下稱UCP，見附圖1)是一種可對(duì)能量進(jìn)行上轉(zhuǎn)的無機(jī)合成物，即UCP可吸收低能量的(長(zhǎng)波長(zhǎng))紅外光，但卻發(fā)射高能量的(短波長(zhǎng))可見光。UCP是由幾種稀土金屬元素?fù)诫s于某些晶體的晶格中構(gòu)成的。在這種材料中有三種主要的成分主基質(zhì)、吸收子和發(fā)射子。
采用合成法可以制得含有不同主基質(zhì)、吸收子、發(fā)射子的UCP。然而，UCP的主基質(zhì)一般是氧硫化物、氟化物、鎵酸鹽以及硅酸鹽等，這幾種物質(zhì)的表面均沒有可以利用的基團(tuán)，使生物活性分子無法直接共價(jià)固定于UCP表面。至于UCP連接生物活性分子的方法，已有技術(shù)均存在一定的缺陷，例如UCP未經(jīng)任何處理，而只是憑借其納米級(jí)顆粒表面帶靜電的特性，直接吸附生物活性分子，這使得UCP在生物分析過程中穩(wěn)定性、重現(xiàn)性無法得到保證；即使在對(duì)UCP表面進(jìn)行了硅化與修飾的實(shí)驗(yàn)中，由于連接生物活性分子時(shí)，未對(duì)不穩(wěn)定的Schiff堿(-CH＝N-)進(jìn)行進(jìn)一步的處理，使得UCP與生物活性分子的連接產(chǎn)物由于Schiff堿(-CH＝N-)不穩(wěn)定、易水解，而無法長(zhǎng)期保存。如何實(shí)現(xiàn)UCP表面活化的高效率、高穩(wěn)定性及重現(xiàn)性，并與此同時(shí)最大限度地保持生物活性分子的活性不受損傷，已有技術(shù)中并未明確教導(dǎo)相應(yīng)的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種經(jīng)過表面修飾處理的UCP。具體地說，該UCP的表面覆蓋有一層薄而均勻的SiO2。有利地，SiO2層上進(jìn)一步包含經(jīng)硅烷化試劑衍生物修飾而得到的活性游離基團(tuán)，所述硅烷化試劑衍生物優(yōu)選為三乙氧基-3-氨基丙基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，APES)，所述活性游離基團(tuán)包括-NH2、-COOH、-OH，優(yōu)選為-NH2。
本發(fā)明的另一目的是提供一種生物標(biāo)記物，包括經(jīng)表面硅化和表面功能化處理的UCP和生物活性分子，其中UCP與生物活性分子是通過雙功能交聯(lián)劑連接的，所述雙功能交聯(lián)劑包括葡聚糖(dextran linker)、NH2-PEG-COOH(PEG＝聚乙二醇)、NH2-PEG-NH2、戊二醛、對(duì)二苯甲醛，所述生物活性分子包括但不限于抗體、酶、寡核苷酸、蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種生物檢測(cè)裝置，其特征在于包括上述生物標(biāo)記物。本發(fā)明修飾活化的UCP作為生物標(biāo)記物在生物分析中，以無本底干擾、無粹滅、適于多重分析和定量分析等顯著優(yōu)勢(shì)，從本質(zhì)上有別于傳統(tǒng)標(biāo)記物。其在快速免疫分析、微點(diǎn)陣、高通量藥物篩選、基因組學(xué)研究、外科手術(shù)組織成像、食品環(huán)境檢測(cè)以及生化戰(zhàn)防御等方面都將得到廣泛地應(yīng)用。
在另一方面，本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明經(jīng)表面修飾處理UCP的方法。在現(xiàn)有的一些技術(shù)中，UCP表面硅化與氨基化后，立即采用高速離心的方法將UCP從反應(yīng)體系中分離，實(shí)驗(yàn)證明由于此時(shí)UCP表面的硅層并未完全硬化，高速離心的過程中會(huì)使大量的顆粒牢固地粘于一起，并隨著硅層的硬化既使超聲也無法分離，這為后期UCP標(biāo)記物在生物分析中的應(yīng)用帶來潛在的障礙；而本發(fā)明所采取的硅化與氨基化分開進(jìn)行、以蒸餾結(jié)束反應(yīng)分離UCP的方法，對(duì)這一問題予以了針對(duì)性的解決A.本發(fā)明中在硅化反應(yīng)完全后，采用蒸干體系的方法分離出已硅化好、但硅層尚未硬化的UCP顆粒，這樣一來保證了UCP顆粒形態(tài)的完整性以及顆粒之間的獨(dú)立性；B.硅化完成后，在硅層硬化老化之前立即進(jìn)行氨基化反應(yīng)，由此可最大程度地保護(hù)與利用UCP表面硅層上的-OH，提高氨基化效率。因?yàn)?，硅層硬化老化的過程實(shí)際就是兩分子-OH失去一分子H2O結(jié)合成-O-，即-OH急劇減少的過程；C.氨基化后，最終的高溫老化過程使硅層在UCP的表面徹底硬化，保證了UCP表面修飾后的穩(wěn)定性。
具體地說，本發(fā)明所述方法包括(1)UCP表面硅化將UCP的表面覆蓋一層薄而均勻的SiO2，通過Si(OC2H5)4在含有NH3的液相中水解就可以實(shí)現(xiàn)。具體反應(yīng)如下
(2)UCP的表面功能化UCP表面硅化所形成的SiO2層，與硅烷化試劑的衍生物反應(yīng)，便可以在UCP的SiO2層上修飾活性游離基團(tuán)-NH2、-COOH、-OH等，使UCP可進(jìn)行后續(xù)的連接反應(yīng)。
三乙氧基-3-氨基丙基硅烷 一氯-十二酰氯-二甲基硅烷 一氯-癸酰甲氧基-二甲基硅烷三乙氧基-3-巰基丙基硅烷優(yōu)選地，本發(fā)明利用三乙氧基-3-氨基丙基硅烷(APES)在UCP的硅層表面修飾-NH2，
具體反應(yīng)如下 本發(fā)明UCP硅化以及APES修飾的過程均在有機(jī)相中進(jìn)行，并且以蒸干體系結(jié)束反應(yīng)，藉此提高了UCP表面硅化以及修飾的效率，同時(shí)具備產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
在另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供制備本發(fā)明生物標(biāo)記物的方法，包括在上述步驟(1)和(2)之后進(jìn)行以下操作(3)UCP連接生物活性分子經(jīng)過功能化的UCP通過它表面所帶有的活性游離基團(tuán)(例如-NH2)，經(jīng)雙功能交聯(lián)劑與生物活性分子相連接。在本發(fā)明中，可采用戊二醛、碳二亞胺(EDC)或物理吸附法，在UCP表面連接生物活性分子(見圖4、圖5、圖6、圖7、圖8)。
具體地說，本發(fā)明生物標(biāo)記物的制備方法包含如下步驟上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面硅化100體積份異丙醇中加入2-3體積份氨水和3-4體積份H2O3，混合均勻；稱量100重量份UCP，將混合液反應(yīng)體系加入其中，用超聲波處理30s將反應(yīng)體系充分混合均勻；放入磁轉(zhuǎn)子，在30-50℃水浴中，磁力攪拌，平衡20-40min；懸濁液反應(yīng)體系，加入0.3-0.5體積份正硅酸乙脂；30-50℃磁力攪拌器攪拌反應(yīng)3-5h；上口改為蒸餾系統(tǒng)，將水浴升溫至80-100℃左右，磁力攪拌，蒸干燒瓶中的混合液反應(yīng)體系；即得本發(fā)明表面硅化的UCP；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面氨基化上一步得到的UCP中加入100體積份三氯甲烷，用超聲波處理30s將燒瓶中的體系充分混合均勻，并倒入在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中處理好的燒瓶中；燒瓶中的懸濁液反應(yīng)體系，加入0.1-0.3體積份APES，并放入磁轉(zhuǎn)子，上口接蒸餾系統(tǒng)；將燒瓶放入60-80℃左右水浴中磁力攪拌，蒸干混合液反應(yīng)體系；將UCP連同燒瓶放入100-120℃烘箱中老化5-8h；老化的UCP中加入20體積份水，超聲波處理30s將燒瓶中的體系充分混合均勻；將懸濁液倒入離心管中，用少量水清洗燒瓶，洗液合并入離心管中；用水作為清洗液進(jìn)行12000r/min離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，超聲30s混勻后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；離心管中的UCP沉降物中加入少量水，用超聲波處理30s將其充分混合均勻；將UCP懸濁液倒入蒸發(fā)皿中，100-120℃蒸干；即得本發(fā)明表面氨基化的UCP；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面醛基化將100重量份氨基化UCP加入圓底磨口燒瓶中；將85-90體積份pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，加入盛有氨基化UCP的圓底磨口燒瓶中，用超聲波處理30s將燒瓶中的反應(yīng)體系充分混合均勻；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入10-15體積份50％戊二醛，磁力攪拌，常溫反應(yīng)1-2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系分別倒入離心管中，用少量pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共4次，超聲30s混勻后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；即得本發(fā)明表面醛基化的UCP；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料連接抗體100重量份醛基化UCP中，加入99-99.2體積份3-5℃預(yù)冷的pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入0.8-1體積份1-3mg/ml抗體(人抗體、牛抗體、羊抗體、馬抗體、兔抗體、鼠抗體等，以上抗體均由北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心提供)，3-5℃，攪拌反應(yīng)3-5h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液配制)，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4重量份NaBH4，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB緩沖液中，含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100體積份UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB緩沖液中，含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹颍瑢覞嵋旱谷肽タ谠噭┢恐?；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；將UCP-抗體標(biāo)記物保存于3-5℃?zhèn)溆?；即得本發(fā)明UCP-抗體標(biāo)記物；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料連接親合素100重量份醛基化UCP中，加入100體積份3-5℃預(yù)冷的pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入1-3重量份親合素，3-5℃，攪拌反應(yīng)3-5h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液配制)，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4重量份NaBH4，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100體積份UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；將UCP-生物素標(biāo)記物保存于3-5℃?zhèn)溆?；即得本發(fā)明UCP-親合素標(biāo)記物；本發(fā)明生物標(biāo)記物還可以用EDC還原法制備，其中包含如下步驟上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面羧基化1000-1100重量份琥珀酸酐，加入100體積份pH＝10-12，0.1-1.0mol/l PB緩沖液中，水浴加熱使溶解；將混合液反應(yīng)體系，加入盛有100重量份氨基化UCP的圓底磨口燒瓶中，用超聲波處理30s將燒瓶中的反應(yīng)體系充分混合均勻；磁力攪拌，室溫反應(yīng)7-9h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，pH＝3-5，0.01-0.05mol/L的PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用pH＝3-5，0.01-0.05mol/LPB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共4次，超聲處理30s后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；即得本發(fā)明表面羧基化的UCP；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面羧基的EDC活化盛有羧基化UCP沉降物的離心管中，加入60體積份pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻，將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；共用40體積份pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB緩沖液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入90-110重量份EDC，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)1-2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用pH＝3-5，0.01-0.05mol/LPB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心10-15min，共2次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；即得本發(fā)明表面羧基被EDC所活化的UCP；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料連接抗體99體積份3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，加入1-3mg/ml抗體(人抗體、?？贵w、羊抗體、馬抗體、兔抗體、鼠抗體等，以上抗體均由北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心提供)1體積份，混合均勻；60體積份上述反應(yīng)混合液加入盛有UCP(羧基被活化)沉降物的離心管中，超聲波處理30s充分混勻，將懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；用剩余的40體積份3-5℃預(yù)冷的反應(yīng)混合液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)3-5h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB緩沖液)，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100體積份UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液分多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液合并入磨口試劑瓶中；將UCP-抗體標(biāo)記物保存于3-5℃?zhèn)溆?；即得本發(fā)明UCP-抗體標(biāo)記物；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料連接親合素100體積份3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB緩沖液中，加入1-3重量份親合素，混合均勻；60體積份上述反應(yīng)混合液加入盛有UCP(羧基被活化)沉降物的離心管中，超聲波處理30s充分混勻，將懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；用剩余的40體積份3-5℃預(yù)冷的反應(yīng)混合液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)3-5h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4m1 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/l PB緩沖液配制)，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100體積份UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹颍瑢覞嵋旱谷肽タ谠噭┢恐?；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；將UCP-親合素標(biāo)記物保存于3-5℃?zhèn)溆?；即得本發(fā)明UCP-親合素標(biāo)記物；上述保存溫度3-5℃，其中優(yōu)選4℃。
上述方法解決了已有技術(shù)UCP表面修飾與活化過程中穩(wěn)定性、重復(fù)性差以及效率低的缺點(diǎn)，同時(shí)具有以下特點(diǎn)A.本發(fā)明中戊二醛還原法中雖然是使用了與脂肪鏈相連接的醛基，即戊二醛作為雙功能交聯(lián)劑，但在使用戊二醛的同時(shí)采用了NaBH4作為還原劑，對(duì)生成的Schiff堿(-CH＝N-)進(jìn)行還原；同時(shí)低濃度的NaBH4確保了對(duì)生物活性分子極低的損傷；且反應(yīng)環(huán)境選用堿性緩沖體系提高了Schiff堿(-CH＝N-)的暫時(shí)穩(wěn)定性；B.與傳統(tǒng)的單一體系法相比，我們?cè)贓DC法中采用了多種變換的反應(yīng)環(huán)境，既保證了中間活化產(chǎn)物的穩(wěn)定性，同時(shí)又使得生物活性分子的活性不受損傷；C.UCP完成了與生物活性分子的連接后，以BSA與Tween 20進(jìn)行封閉，保證下一步以UCP作為標(biāo)記物的生物分析過程具有極低的非特異；本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了UCP表面活化的高效率及高穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，并與此同時(shí)最大限度的保持生物活性分子的活性不受損傷。為后續(xù)的UCP在多種生物分析中的應(yīng)用，打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
因此，惰性的無機(jī)合成材料UCP在經(jīng)過本發(fā)明一系列表面修飾與活化后，其絕無僅有的能量上轉(zhuǎn)現(xiàn)象在生物分析中得到充分地發(fā)揮。其作為生物標(biāo)記物擁有放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、膠體金等傳統(tǒng)標(biāo)記物所無法比擬的優(yōu)勢(shì)A.UCP中吸收子與發(fā)射子均摻雜于主晶體中，屬于內(nèi)致發(fā)光，這使它的發(fā)光信號(hào)不會(huì)受到檢測(cè)環(huán)境(溫度、被檢物所處基質(zhì)等因素)影響。這意味著在野外環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)全血、尿液、唾液、組織勻漿等可進(jìn)行同樣高靈敏地分析，而無需顧及標(biāo)記物的穩(wěn)定性。
B.不同組成的UCP可具有不同的激發(fā)光譜和(或)發(fā)射光譜，且反STOKES位移大，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄。這就為UCP進(jìn)行多重分析提供了基礎(chǔ)。
C.UCP獨(dú)有的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象決定了它不存在背景干擾，從而造就了UCP高靈敏度的特性。
D.用紫外光對(duì)熒光標(biāo)記物進(jìn)行激發(fā)時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞、DNA等被檢測(cè)的生物樣品產(chǎn)生損傷，而UCP采用紅外光源為激發(fā)光，所以用UCP作為標(biāo)記物可對(duì)細(xì)胞或活體進(jìn)行無損傷的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
E.一些熒光標(biāo)記物在檢測(cè)過程中會(huì)產(chǎn)生熒光淬滅，使得時(shí)間分辨檢測(cè)(time-resolved assay)無法準(zhǔn)確進(jìn)行，而UCP發(fā)光性能穩(wěn)定，因而用它做標(biāo)記物使實(shí)驗(yàn)方法更為靈活，不受標(biāo)記物的限制。
F.酶、放射性同位素等標(biāo)記物在應(yīng)用的過程中通常都會(huì)產(chǎn)生一些對(duì)環(huán)境有害的物質(zhì)，而UCP吸收紅外光、發(fā)射可見光、自身性質(zhì)又極穩(wěn)定，因而使用安全。
G.與膠體金技術(shù)相比，UCP突出地顯示了它能夠準(zhǔn)確靈活地進(jìn)行定量分析、多重分析的優(yōu)勢(shì)。修飾活化的UCP通過與多種生物活性分子相連接在高通量藥物篩選、基因組學(xué)研究、外科手術(shù)組織成像、食品環(huán)境檢測(cè)以及生化戰(zhàn)的防御中都將發(fā)揮不可估量的作用。實(shí)驗(yàn)部分材料本發(fā)明所用UCP由上?？蒲坠怆娂夹g(shù)有限公司提供。
實(shí)驗(yàn)例1.UCP表面氨基化效率檢測(cè)說明在本實(shí)驗(yàn)中利用化學(xué)物質(zhì)茚三酮可與游離氨基反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)(該藍(lán)色物質(zhì)的特征吸收峰為563nm、564nm、565nm)的特性對(duì)UCP表面修飾的氨基進(jìn)行鑒定。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)UCP表面修飾過程中的氨基化效率進(jìn)行檢測(cè)(即，對(duì)氨基進(jìn)行定量測(cè)定)，首先便是繪制氨基濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。利用一分子氨基與兩分子茚三酮反應(yīng)，生成一分子藍(lán)色物質(zhì)的檢測(cè)反應(yīng)化學(xué)計(jì)量關(guān)系，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程中，使用含有一個(gè)氨基的甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品代替UCP表面的游離氨基與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)。
通過將濃度準(zhǔn)確控制的產(chǎn)物系列稀釋，并測(cè)量其在特征峰處的吸光度便可完成氨基濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)濃度工作曲線的繪制。利用該曲線所求得的斜率便可對(duì)UCP表面氨基化效率進(jìn)行精確計(jì)算。
A.標(biāo)準(zhǔn)濃度工作曲線繪制準(zhǔn)確稱量30mg甘氨酸；甘氨酸中加入4mg/m1的茚三酮2ml，沸水浴30s使其充分反應(yīng)；(甘氨酸過量，終濃度藍(lán)色物質(zhì)1.12×10-2mol/L，甘氨酸0.189mol/L)以“b”中含藍(lán)色物質(zhì)1.12×10-2mol/L的溶液作為母液，將其用蒸餾水系列稀釋至藍(lán)色物質(zhì)終濃度為1.40×10-4mol/L、1.25×10-4mol/L、1.12×10-4mol/L、1.02×10-4mol/L、9.36×10-5mol/L、8.64×10-5mol/L、8.02×10-5mol/L、7.48×10-5mol/L、7.02×10-5mol/L、6.24×10-5mol/L、5.61×10-5mol/L、5.10×10-5mol/L、4.68×10-5mol/L、4.32×10-5mol/L、4.01×10-5mol/L、3.74×10-5mol/L、3.51×10-5mol/L、3.12×10-5mol/L、2.81×10-5mol/L、2.55×10-5mol/L、2.34×10-5mol/L、2.16×10-5mol/L、2.00×10-5mol/L、1.87×10-5mol/L、1.75×10-5mol/L、1.56×10-5mol/L、1.40×10-5mol/L、1.28×10-5mol/L、1.17×10-5mol/L、1.08×10-5mol/L、1.00×10-5mol/L、9.36×10-6mol/L、5.01×10-6mol/L、4.68×10-6mol/L；各溶液分別于563nm、564nm、565nm處測(cè)吸光度；以藍(lán)色物質(zhì)濃度(也即是參加反應(yīng)氨基的濃度)作為橫坐標(biāo)，以各濃度對(duì)應(yīng)的563nm、564nm、565nm處吸光度平均值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)濃度工作曲線(見圖9)；根據(jù)曲線可得曲線斜率為K＝1.023×10-4。
B.UCP表面氨基化效率測(cè)定 準(zhǔn)確稱量30mg氨基化UCP；UCP中加入4mg/ml茚三酮1ml，超聲混勻，沸水浴5min使其充分反應(yīng)(見圖10)；將UCP反應(yīng)后的藍(lán)色懸濁液以12000r/min離心5min；離心后的上清液取出，利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)其在563nm、564nm、565nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)量，并得出吸光度平均值A(chǔ)；利用公式UCP表面修飾氨基化效率＝(1.023×10-4A)×1×10-3/30(mol/mg)。
C.UCP表面氨基化效率變異系數(shù)測(cè)定 將UCP表面硅化與氨基化實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)10次；分別測(cè)定其吸光度-氨基化效率(mol/mg)為1.5088-5.15×10-9、1.2408-4.23×10-9、1.6934-5.77×10-9、1.3596-4.64×10-9、1.4326-4.89×10-9、1.2014-4.10×10-9、1. 1303-3.85×10-9、1.5436-5.26×10-9、1.2594-4.29×10-9、1.4023-4.78×10-9；經(jīng)過計(jì)算UCP表面氨基化效率變異系數(shù)為12.64％。
實(shí)驗(yàn)例2.UCP表面醛基檢測(cè)A.檢測(cè)試劑-品紅-醛基試劑(Fuchsin-Aldehyde Reagent，F(xiàn)-A Reagent)的配制0.05g堿性品紅溶于50ml水中；磁力攪拌下，加入2ml飽和NaHSO3溶液，反應(yīng)1h；磁力攪拌下，加入1ml濃HCl，磁力攪拌反應(yīng)過夜。
B.UCP表面醛基檢測(cè)氨基化后經(jīng)過清洗的少量UCP粉末加入1ml F-A試劑中；醛基化后經(jīng)過清洗的少量UCP懸濁液加入1ml F-A試劑中；比較“a”與“b”的現(xiàn)象(見圖11)。
結(jié)論通過比較氨基化UCP(左)和醛基化UCP(右)與醛基檢測(cè)試劑反應(yīng)的現(xiàn)象，可以證實(shí)通過本發(fā)明可在UCP表面氨基化的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)UCP表面醛基化。
實(shí)驗(yàn)例3.UCP表面抗體檢測(cè)(以UCP標(biāo)記羊抗炭疽芽孢抗體為例進(jìn)行說明)說明羊抗炭疽芽孢抗體可與其所對(duì)應(yīng)的二抗-堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體發(fā)生特異的免疫結(jié)合反應(yīng)，最終生成的免疫復(fù)合物UCP-羊抗炭疽芽孢抗體-兔抗羊IgG-堿性磷酸酶在加入堿性磷酸酶的顯色底物后，以顏色的變化間接的揭示了UCP表面羊抗炭疽芽孢抗體的存在；而羊抗炭疽芽孢抗體與與其同源的羊抗兔IgG抗體之間則無任何反應(yīng)，因而可以使用UCP-羊抗炭疽芽孢抗體與AP-羊抗兔IgG抗體反應(yīng)作為上述特異性反應(yīng)的空白對(duì)照。
A.抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)取5ml 4℃保存的UCP-羊抗炭疽芽孢抗體懸濁液；懸濁液中加入5μl堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體(AP-兔抗羊IgG)，4C攪拌反應(yīng)1h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/LPB緩沖液含0.05％Tween20)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的UCP清洗液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-5次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；UCP沉降中加入1m1 UCP清洗液，攪拌震蕩充分混勻；7次清洗后的離心上清(1#-7#)，以及UCP懸濁液共8個(gè)樣品，各取1ml；每個(gè)樣品中各加入200μl pNPP(堿性磷酸酶的反應(yīng)底物，與AP反應(yīng)可生成在405nm有特征吸收峰的黃色物質(zhì))，室溫反應(yīng)30min；每個(gè)樣品中分別加入200μl 1mol/L NaOH終止催化反應(yīng)(見圖12)；(注1#清洗上清變?yōu)辄S色表示在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，UCP復(fù)合物周圍有游離的AP-兔抗羊IgG；7#清洗上清為無色，而經(jīng)過7次清洗的UCP懸濁液為極其明顯黃色，表示UCP表面實(shí)現(xiàn)了與羊抗炭疽芽孢抗體的連接，而通過羊抗炭疽芽孢抗體，AP-兔抗羊IgG結(jié)合于UCP表面，因而顯色。)將UCP反應(yīng)后的懸濁液以12000r/min離心5min；離心后的上清液取出，利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)其在405nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)量得X。
B.抗體標(biāo)記物空白對(duì)照檢測(cè)取5ml 4℃保存的UCP-羊抗炭疽芽孢抗體懸濁液；懸濁液中加入5μl堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(AP-羊抗兔IgG)，4℃攪拌反應(yīng)1h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/LPB緩沖液含0.05％Tween 20)清洗燒瓶，洗液合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的UCP清洗液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-5次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；UCP沉降中加入1ml UCP清洗液，攪拌震蕩充分混勻；上述的7次清洗后的離心上清(1#-7#)，以及上述UCP懸濁液共8個(gè)樣品，各取1ml；每個(gè)樣品各加入200μl pNPP(堿性磷酸酶的反應(yīng)底物，與AP反應(yīng)可生成在405nm有特征吸收峰的黃色物質(zhì))，室溫反應(yīng)30min；每個(gè)樣品分別加入200μl 1mol/L NaOH終止催化反應(yīng)(見圖13)；(注1#清洗上清變?yōu)辄S色表示在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，UCP復(fù)合物周圍有游離的AP-羊抗兔IgG；7#清洗上清為無色，而經(jīng)過7次清洗的UCP懸濁液也為無色，表示UCP表面除了免疫反應(yīng)沒有物理吸附作用可使AP-羊抗兔IgG結(jié)合于UCP表面，因而無色。由此也證明了抗體特異性檢測(cè)中結(jié)論的可靠性。)將UCP反應(yīng)后的懸濁液12000r/min離心5min；離心后的上清液取出，利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)其在405nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)量得Y。
C.UCP表面抗體檢測(cè)說明“A”與“B”中通過顏色變化已經(jīng)說明了兩個(gè)問題①UCP表面已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了抗體的連接；②UCP標(biāo)記抗體在將來的應(yīng)用中，不會(huì)產(chǎn)生顆粒本身性質(zhì)導(dǎo)致的物理吸附(即，與其它蛋白的非特異結(jié)合)。為了進(jìn)一步說明這個(gè)問題，我們使用“A”與“B”中得到的吸光度具體數(shù)值X與Y代替顏色進(jìn)行論證。
大批量制備一批氨基化UCP，按照本發(fā)明中所描述的EDC法完全平行重復(fù)進(jìn)行10次羊抗炭疽芽孢抗體標(biāo)記；每一批UCP-羊抗炭疽芽孢抗體分別按照“抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)”與“抗體標(biāo)記物空白對(duì)照檢測(cè)”中的方法步驟進(jìn)行檢測(cè)，共得到10組一一對(duì)應(yīng)的X與Y值；(X代表UCP-羊抗炭疽芽孢抗體與AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即特異性檢測(cè)中得到的吸光度；Y代表UCP-羊抗炭疽芽孢抗體與AP-羊抗兔IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即空白對(duì)照檢測(cè)中得到的吸光度，見表1)；上文所述同一批制備的氨基化UCP，按照本發(fā)明中所描述的戊二醛法完全平行重復(fù)進(jìn)行10次羊抗炭疽芽孢抗體標(biāo)記；每一批UCP-羊抗炭疽芽孢抗體分別按照“抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)”與“抗體標(biāo)記物空白對(duì)照檢測(cè)”中的方法步驟進(jìn)行檢測(cè)，共得到10組一對(duì)應(yīng)的X與Y值；(X代表UCP-羊抗炭疽芽孢抗體與AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即特異性檢測(cè)中得到的吸光度；Y代表UCP-羊抗炭疽芽孢抗體與AP-羊抗兔IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即空白對(duì)照檢測(cè)中得到的吸光度)，見表2；將EDC法與戊二醛法制備的UCP-抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)吸光度進(jìn)行比較，見圖14。
EDC法與戊二醛法標(biāo)記抗體標(biāo)記效率比較結(jié)論通過上述的抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)以及空白對(duì)照檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)顏色現(xiàn)象以及具體數(shù)據(jù)證據(jù)充分證明無論是EDC法還是戊二醛法均可在UCP表面連接抗體；戊二醛法的抗體標(biāo)記效率高于EDC法；這種經(jīng)過修飾與活化的UCP顆粒表面已經(jīng)不存在任何可對(duì)蛋白產(chǎn)生非特異性物理吸附的位點(diǎn)。
表1 EDC法制備的UCP-抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)與空白對(duì)照檢測(cè)吸光度序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10空白對(duì)照Y 0.0770 0.0414 0.0598 0.0265 0.0653 0.0324 0.0256 0.0543 0.0672 0.0387特異檢測(cè)X 2.5412 2.4989 2.4587 2.5793 2.3010 2.5173 2.4001 2.5379 2.3924 2.4781表2戊二醛法制備的UCP-抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)與空白對(duì)照檢測(cè)吸光度序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10空白對(duì)照Y 0.0287 0.0565 0.0735 0.0419 0.0574 0.0263 0.0791 0.0511 0.0437 0.0629特異檢測(cè)X 3.0792 2.9987 2.9812 3.0441 3.0171 2.9578 2.9910 2.9762 3.0524 2.9847實(shí)驗(yàn)例4.UCP表面親合素檢測(cè)說明親合素可與生物素化羊抗兔IgG抗體中的生物素發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，而生物素化羊抗兔IgG中的羊抗兔IgG又可與其所對(duì)應(yīng)的二抗——堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體中的兔抗羊IgG發(fā)生特異的免疫結(jié)合反應(yīng)；最終生成的免疫復(fù)合物UCP-親合素-生物素-羊抗兔IgG-兔抗羊IgG-堿性磷酸酶在加入堿性磷酸酶的顯色底物后，以顏色的變化間接的揭示UCP表面親合素的存在。而在沒有生物素-羊抗兔IgG的存在下UCP-親合素與堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗羊IgG之間則無任何反應(yīng)，可以此來作為上述特異性反應(yīng)的空白對(duì)照。
A.親合素標(biāo)記物特異性檢測(cè)取5ml 4℃保存的UCP-親合素懸濁液；濁液中加入5μl生物素化羊抗兔IgG抗體，4℃攪拌反應(yīng)1h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液含0.05％Tween20)清洗燒瓶，洗液合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的UCP清洗液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；UCP沉降中加入1ml UCP保存液，攪拌震蕩充分混勻，取出放入燒瓶中；再用4ml UCP保存液分次清洗離心管，洗液也合并入燒瓶中；懸濁液中加入5μl堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體(AP-兔抗羊IgG)，4℃攪拌反應(yīng)1h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入20ml離心管，用4℃預(yù)冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液含0.05％Tween20)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的UCP清洗液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-5次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；UCP沉降中加入1ml UCP清洗液，攪拌震蕩充分混勻；上述7次清洗后的離心上清(1#-7#)，以及上述的UCP懸濁液共8個(gè)樣品，各取1ml；每個(gè)樣品中各加入200μl pNPP(堿性磷酸酶的反應(yīng)底物，與AP反應(yīng)可生成在405nm有特征吸收峰的黃色物質(zhì))，室溫反應(yīng)30min；每個(gè)樣品中分別加入200μl 1mol/L NaOH終止催化反應(yīng)，見圖15(注1#清洗上清變?yōu)辄S色表示反應(yīng)結(jié)束時(shí)，UCP復(fù)合物周圍有游離AP-兔抗羊IgG；7#清洗上清為無色，經(jīng)過7次清洗的UCP懸濁液為極其明顯黃色，表示UCP表面實(shí)現(xiàn)了與親合素的連接，而通過生物素化羊抗兔IgG，AP-兔抗羊IgG結(jié)合于UCP表面，因而顯色。)；將UCP反應(yīng)后的懸濁液以12000r/min離心5min；離心后的上清液取出，利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)其在405nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)量得X。
B.親合素標(biāo)記物空白對(duì)照檢測(cè)取5ml 4℃保存的UCP-親合素懸濁液；懸濁液中加入5μl堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體(AP-兔抗羊IgG)，4℃攪拌反應(yīng)1h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液含0.05％Tween20)清洗燒瓶，洗液合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的UCP清洗液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-5次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；在UCP沉降中加入1ml UCP清洗液，攪拌震蕩充分混勻；上述7次清洗后的離心上清(1#-7#)，及上述的UCP懸濁液共8個(gè)樣品，各取1ml；每個(gè)樣品中各加入200μl pNPP(堿性磷酸酶的反應(yīng)底物，與AP反應(yīng)可生成在405nm有特征吸收峰的黃色物質(zhì))，室溫反應(yīng)30min每個(gè)樣品中分別加入200μl 1mol/L NaOH終止催化反應(yīng)(見圖16)(注1#清洗上清變?yōu)辄S色表示在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，UCP復(fù)合物周圍有游離的AP-兔抗羊IgG；7#清洗上清為無色，而經(jīng)過7次清洗的UCP懸濁液也為無色，表示UCP表面除了免疫反應(yīng)沒有物理吸附作用可使AP-兔抗羊IgG結(jié)合于UCP表面，因而無色。由此也證明了親合素特異性檢測(cè)中結(jié)論的可靠性)；將UCP反應(yīng)后的懸濁液以12000r/min離心5min；離心后的上清液取出，利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)其在405nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)量得Y；C.UCP表面親合素檢測(cè)說明“A”與“B”中通過顏色變化已經(jīng)說明了兩個(gè)問題①UCP表面已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了親合素的連接；②UCP標(biāo)記親合素在將來的應(yīng)用中，不會(huì)產(chǎn)生顆粒本身性質(zhì)導(dǎo)致的物理吸附(即，與其它蛋白之間的非特異結(jié)合)。為了進(jìn)一步說明這個(gè)問題，我們使用“A”與“B”中得到的吸光度具體數(shù)值X與Y代替顏色進(jìn)行論證。
上文所述同一批制備的氨基化UCP，按照本發(fā)明所描述的EDC法完全平行重復(fù)進(jìn)行10次親合素標(biāo)記；每一批UCP-親合素分別按照“親合素標(biāo)記物特異性檢測(cè)”與“親合素標(biāo)記物空白對(duì)照檢測(cè)”中的方法步驟進(jìn)行特異性檢測(cè)與空白對(duì)照檢測(cè)，共得到10組一對(duì)應(yīng)的X與Y值，見表3；(X代表UCP-親合素依次與生物素化羊抗兔IgG、AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即特異性檢測(cè)中得到的吸光度；Y代表UCP-親合素與AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即空白對(duì)照檢測(cè)中得到的吸光度；)上文所述同一批制備的氨基化UCP，按照本發(fā)明所描述的戊二醛法完全平行重復(fù)進(jìn)行10次親合素標(biāo)記；每一批UCP-親合素分別按照“親合素標(biāo)記物特異性檢測(cè)”與“親合素標(biāo)記物空白對(duì)照檢測(cè)”中的方法步驟進(jìn)行特異性檢測(cè)與空白對(duì)照檢測(cè)，共得到10組一對(duì)應(yīng)的X與Y值，見表4；(X代表UCP-親合素依次與生物素化羊抗兔IgG、AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即特異性檢測(cè)中得到的吸光度；Y代表UCP-親合素與AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即空白對(duì)照檢測(cè)中得到的吸光度)；將EDC法與戊二醛法制備的UCP-親合素標(biāo)記物特異性檢測(cè)吸光度進(jìn)行比較，見圖17，結(jié)論通過上述的親合素標(biāo)記物特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)以及空白對(duì)照檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)顏色現(xiàn)象以及具體數(shù)據(jù)證據(jù)充分證明了無論是EDC法還是戊二醛法均可在UCP表面連接親合素；這種經(jīng)過修飾與活化的UCP顆粒表面已經(jīng)不存在任何可對(duì)蛋白產(chǎn)生非特異性物理吸附的位點(diǎn)。戊二醛法的親合素標(biāo)記效率高于EDC法。
表3EDC法制備的UCP-親合素標(biāo)記物特異性檢測(cè)與空白對(duì)照檢測(cè)吸光度序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10空白對(duì)照Y 0.0642 0.0327 0.0584 0.0721 0.0451 0.0487 0.0661 0.0579 0.0216 0.0489特異檢測(cè)X 2.7469 2.7312 2.6949 2.6831 2.7079 2.7254 2.6657 2.6943 2.7398 2.7138表4戊二醛法制備的UCP-生物素標(biāo)記物特異性檢測(cè)與空白對(duì)照檢測(cè)吸光度序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10空白對(duì)照Y 0.0575 0.0497 0.0399 0.0631 0.0759 0.0245 0.0672 0.0311 0.0658 0.0519特異檢測(cè)X 3.3483 3.3010 3.2742 3.2936 3.3387 3.2887 3.3148 3.3212 3.2729 3.3059實(shí)驗(yàn)例5.共價(jià)法與物理吸附法標(biāo)記抗體，標(biāo)記效率與標(biāo)記物穩(wěn)定性比較(僅以UCP-羊抗炭疽芽孢抗體為例進(jìn)行說明)說明在現(xiàn)有的一些UCP標(biāo)記技術(shù)中，其沒有采用UCP表面系列修飾后通過共價(jià)法連接抗體的方法，而是與膠體金標(biāo)記技術(shù)類似，即直接利用UCP納米級(jí)顆粒的表面靜電吸附特性，通過物理吸附法結(jié)合抗體。在此我們通過實(shí)驗(yàn)將這兩種方法從標(biāo)記效率以及標(biāo)記物穩(wěn)定性兩方面來進(jìn)行比較。
A.物理吸附法UCP標(biāo)記羊抗炭疽芽孢抗體稱量100mg沒有經(jīng)過任何表面修飾的空白UCP加入圓底磨口燒瓶中；燒瓶中加入99.175ml 4℃預(yù)冷的pH＝9.5 0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻；99.175ml的UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入825μl 2mg/ml羊抗炭疽芽孢抗體，4℃，攪拌反應(yīng)4h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2.5ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝9.5 0.05 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液配制)，4℃，攪拌反應(yīng)2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含1.0％BSA和0.5％Tween20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹颍瑢覞嵋旱谷霟恐?；共?0ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100ml UCP懸濁液反應(yīng)體系，4℃，攪拌反應(yīng)2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)清洗燒瓶，洗液合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-1次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹颍瑢覞嵋旱谷肽タ谠噭┢恐校还灿?0ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；將UCP-抗體標(biāo)記物保存于4℃?zhèn)溆谩?br> B.共價(jià)法與物理吸附法標(biāo)記效率比較上文所述同一批制備的氨基化UCP，按照本發(fā)明所描述的物理吸附法完全平行重復(fù)進(jìn)行10次羊抗炭疽芽孢抗體標(biāo)記；每一批UCP-抗體分別按照“抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)”與“抗體標(biāo)記物空白對(duì)照檢測(cè)”的方法步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共得到10組一對(duì)應(yīng)的X與Y值，見表5，(X代表UCP-羊抗炭疽芽孢抗體與AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即特異性檢測(cè)中得到的吸光度；Y代表UCP-羊抗炭疽芽孢抗體與AP-羊抗兔IgG反應(yīng)后，再用底物pNPP顯色后的吸光度，即空白對(duì)照檢測(cè)中得到的吸光度)；按照EDC共價(jià)法、戊二醛共價(jià)法和物理吸附法分別進(jìn)行10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)制備UCP-羊抗炭疽芽孢抗體標(biāo)記物，其各自特異性檢測(cè)后的吸光度結(jié)果總結(jié)見表6，圖18，結(jié)論物理吸附法也可以在UCP表面固定抗體；共價(jià)法的抗體標(biāo)記效率遠(yuǎn)好于物理吸附法，而共價(jià)法中戊二醛法略好于EDC法。
表5物理吸附法制備的UCP-抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)與空白對(duì)照檢測(cè)吸光度序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10空白對(duì)照Y 0.0352 0.0257 0.0562 0.0719 0.0442 0.0269 0.0603 0.0552 0.0679 0.0748特異檢測(cè)X 1.2402 1.3549 1.2918 1.3162 1.2547 1.2794 1.3071 1.2955 1.2625 1.2957表6三種方法分別制備的10批UCP-抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)吸光度序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10EDC共價(jià)法 2.5412 2.4989 2.4587 2.5793 2.3010 2.5173 2.4001 2.5379 2.3924 2.4781戊二醛共價(jià)法 3.0792 2.9987 2.9812 3.0441 3.0171 2.9578 2.9910 2.9762 3.0524 2.9847物理吸附法1.2402 1.3549 1.2918 1.3162 1.2547 1.2794 1.3071 1.2955 1.2625 1.2957
C.共價(jià)法與物理吸附法所得到的UCP抗體標(biāo)記物穩(wěn)定性比較上文所述同一批制備的氨基化UCP，分別用戊二醛共價(jià)法、EDC共價(jià)法和物理吸附法標(biāo)記羊抗炭疽芽孢抗體；使用AP-兔抗羊IgG分別在制備后0h、30h、60h、120h、240h、480h、960h，對(duì)戊二醛共價(jià)法UCP-羊抗炭疽芽孢抗體、EDC共價(jià)法UCP-羊抗炭疽芽孢抗體和物理吸附法UCP-羊抗炭疽芽孢抗體進(jìn)行抗體標(biāo)記物特異性檢測(cè)。結(jié)果見表7和圖19，結(jié)論共價(jià)法制備的UCP-抗體標(biāo)記物穩(wěn)定性好于物理吸附法，而共價(jià)法中戊二醛法略好于EDC法。
表7三種方法制備的UCP-抗體在不同保存時(shí)間下特異性檢測(cè)吸光度時(shí)間(h) 0.0 30.0 60.0 120.0 240.0 480.0 960.0戊二醛共價(jià)法 3.07922.80692.77382.79032.75692.74212.7494EDC共價(jià)法 2.54122.15272.24012.17352.13582.20242.1647物理吸附法1.24020.41990.42400.43410.42790.40370.4213實(shí)驗(yàn)例6.共價(jià)法與物理吸附法標(biāo)記親合素，標(biāo)記效率與標(biāo)記物穩(wěn)定性比較A.物理吸附法UCP標(biāo)記親合素稱量100mg沒有經(jīng)過任何表面修飾的空白UCP加入圓底磨口燒瓶中；燒瓶中加入100ml 4℃預(yù)冷的pH＝9.5，0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻；100mlUCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2mg親合素，4℃，攪拌反應(yīng)4h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝9.5 0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液配制)2.5ml，4℃，攪拌反應(yīng)2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含1.0％BSA和0.5％Tween20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100ml UCP懸濁液反應(yīng)體系，4℃，攪拌反應(yīng)2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween 20、0.02％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用4℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-1次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；共?0ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；將UCP-親合素標(biāo)記物保存于4℃?zhèn)溆谩?br> B.共價(jià)法與物理吸附法標(biāo)記效率比較上文所述同一批制備的氨基化UCP，按照本發(fā)明所描述的物理吸附法完全平行重復(fù)進(jìn)行10次親合素標(biāo)記；每一批UCP-親合素分別按照“親合素標(biāo)記物特異性檢測(cè)”與“親合素標(biāo)記物空白對(duì)照檢測(cè)”的方法步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共得到10組一一對(duì)應(yīng)的X與Y值，見表8；(XUCP-親合素依次與生物素化羊抗兔IgG、AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，用底物pNPP顯色后的吸光度，即特異性檢測(cè)中得到的吸光度YUCP-親合素與AP-兔抗羊IgG反應(yīng)后，用底物pNPP顯色后的吸光度，即空白對(duì)照檢測(cè)中得到的吸光度)；按照EDC共價(jià)法、戊二醛共價(jià)法和物理吸附法分別進(jìn)行10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)制備UCP-親合素標(biāo)記物，其各自特異性檢測(cè)后的吸光度結(jié)果見表9和圖20，結(jié)論物理吸附法也可以在UCP表面固定親合素；共價(jià)法的抗體標(biāo)記效率遠(yuǎn)好于物理吸附法，而共價(jià)法中戊二醛法略好于EDC法。
表8物理吸附法制備的UCP-親合素標(biāo)記物特異性檢測(cè)與空白對(duì)照檢測(cè)吸光度序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10空白對(duì)照Y 0.0413 0.0735 0.0367 0.0411 0.0619 0.0260 0.0587 0.0573 0.0427 0.0505特異檢測(cè)X 1.5002 1.4179 1.4465 1.4934 1.4631 1.4290 1.5067 1.4474 1.4923 1.4763表9三種方法分別制備的10批UCP-生物素標(biāo)記物特異性檢測(cè)吸光度序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10EDC共價(jià)法 2.7469 2.7312 2.6949 2.6831 2.7079 2.7254 2.6657 2.6943 2.7398 2.7138戊二醛共價(jià)法 3.3483 3.3010 3.2742 3.2936 3.3387 3.2887 3.3148 3.3212 3.2729 3.3059物理吸附法1.5002 1.4179 1.4465 1.4934 1.4631 1.4290 1.5067 1.4474 1.4923 1.4763C.共價(jià)法與物理吸附法所得到的UCP親合素標(biāo)記物穩(wěn)定性比較上文所述同一批制備的氨基化UCP，分別用戊二醛共價(jià)法、EDC共價(jià)法和物理吸附法標(biāo)記親合素；使用生物素化羊抗兔IgG與AP-兔抗羊IgG分別在制備后0h、30h、60h、120h、240h、480h、960h，對(duì)戊二醛共價(jià)法UCP-親合素、EDC共價(jià)法UCP-親合素和物理吸附法UCP-親合素進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果見表10和圖21。
結(jié)論共價(jià)法制備的UCP-親合素標(biāo)記物穩(wěn)定性好于物理吸附法，而共價(jià)法中戊二醛法略好于EDC法。
表10三種方法制備的UCP-親合素在不同保存時(shí)間下特異性檢測(cè)吸光度時(shí)間(h) 0.0 30.0 60.0 120.0 240.0 480.0 960.0戊二醛共價(jià)法 3.34833.09213.06563.05293.05473.05833.0579EDC共價(jià)法 2.74692.52172.49682.53902.52872.50672.5142物理吸附法1.50020.48190.41740.44280.43900.41710.3981


圖1UCP顆粒；圖2UCP顆粒表面硅化；圖3UCP顆粒硅層表面修飾功能化基團(tuán)；圖4UCP顆粒連接生物活性分子；圖5戊二醛還原法反應(yīng)方程式；圖6EDC法反應(yīng)方程式；圖7戊二醛還原法總實(shí)驗(yàn)路線；圖8EDC法總實(shí)驗(yàn)路線；圖9氨基化效率檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)濃度工作曲線；圖10從左到右依次為未經(jīng)過任何修飾的UCP顆粒、硅化后的UCP顆粒、UCP顆粒氨基化后的最后一次清洗液、氨基化UCP與氨基檢測(cè)試劑茚三酮反應(yīng)；圖11氨基化UCP(左)與醛基化UCP(右)在醛基檢測(cè)試劑中的現(xiàn)象；圖12從左到右依次為UCP-抗體與AP-兔抗羊IgG反應(yīng)并清洗后的1#-7#離心上清以及UCP復(fù)合物，再用pNPP顯色后的結(jié)果；圖13從左到右依次為UCP-抗體與AP-羊抗兔IgG反應(yīng)并清洗后的1#-7#離心上清以及UCP復(fù)合物，再用pNPP顯色后的結(jié)果；圖14EDC法與戊二醛法標(biāo)記抗體標(biāo)記效率比較；圖15從左到右依次為UCP-親合素與生物素化羊抗兔IgG、AP-兔抗羊IgG反應(yīng)并清洗后的1#-7#離心上清以及UCP復(fù)合物，再用pNPP顯色后的結(jié)果；圖16從左到右依次為UCP-親合素與AP-兔抗羊IgG反應(yīng)并清洗后的1#-7#離心上清以及UCP復(fù)合物，再用pNPP顯色后的結(jié)果；圖17EDC法與戊二醛法標(biāo)記親合素標(biāo)記效率比較；圖18EDC共價(jià)法、戊二醛共價(jià)法、物理吸附法標(biāo)記抗體標(biāo)記效率比較；圖19三種方法制備的UCP-抗體標(biāo)記物穩(wěn)定性比較；圖20EDC共價(jià)法、戊二醛共價(jià)法、物理吸附法標(biāo)記親合素標(biāo)記效率比較；圖21三種方法制備的UCP-親合素標(biāo)記物穩(wěn)定性比較。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備UCP表面利用APES進(jìn)行氨基化的實(shí)驗(yàn)均在預(yù)處理過的圓底磨口燒瓶中進(jìn)行(防止與UCP反應(yīng)的過程中，APES有所損失)。燒瓶預(yù)處理的具體方法如下A.待處理的圓底燒瓶徹底清洗，并烘干；B.燒瓶中加入100ml濃硝酸，用電熱套加熱使其保持沸騰狀態(tài)1h；
C.待燒瓶以及濃硝酸冷卻后，倒出濃硝酸，用大量的水沖洗燒瓶直至洗液變?yōu)橹行?，將燒瓶烘干；D.燒瓶中加入100ml三氯甲烷以及2ml APES；E.燒瓶中放入磁轉(zhuǎn)子，上口接蒸餾系統(tǒng)，在62℃左右水浴中，磁力攪拌，蒸干燒瓶中的混合液反應(yīng)體系(注三氯甲烷沸點(diǎn)為61.2℃)；F.將燒瓶放入110℃烘箱中老化6h；G.處理后的圓底燒瓶徹底清洗，并烘干備用；實(shí)施例1戊二醛還原法修飾與活化UCP(1)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面硅化A.稱量100mg UCP加入150ml圓底磨口燒瓶中；B.3.194ml H2O與2.294ml 28％氨水混合，并加入異丙醇至混合體系總體積為100ml，混合均勻；C.將“B”中的混合液反應(yīng)體系，加入盛有UCP的150ml圓底磨口燒瓶中，用超聲波處理30s將燒瓶中的反應(yīng)體系充分混合均勻；D.將燒瓶中放入磁轉(zhuǎn)子，上口接冷凝回流系統(tǒng)，在40℃左右水浴中，磁力攪拌，平衡30min；E.燒瓶中的懸濁液反應(yīng)體系，加入350μl TEOS，40℃左右，磁力攪拌反應(yīng)4h；F.上口改為蒸餾系統(tǒng)，將水浴升溫至83℃左右，磁力攪拌，蒸干燒瓶中的混合液反應(yīng)體系；(注異丙醇的沸點(diǎn)為82.4℃，其與水的共沸物沸點(diǎn)為80.4℃)(2)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面氨基化A.上一步得到的UCP干粉中加入100ml三氯甲烷，用超聲波處理30s將燒瓶中的體系充分混合均勻，并倒入在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中處理好的燒瓶中；B.燒瓶中的懸濁液反應(yīng)體系，加入198μl APES，并放入磁轉(zhuǎn)子，上口接蒸餾系統(tǒng)；C.將燒瓶放入62℃左右水浴中磁力攪拌，蒸干混合液反應(yīng)體系；D.將UCP連同燒瓶放入110℃烘箱中老化6h；E.老化的UCP中加入20ml水，超聲波處理30s將燒瓶中的體系充分混合均勻；F.將懸濁液倒入20ml離心管中，用少量水清洗燒瓶，洗液合并入離心管中；G.用水作為清洗液進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(超聲30s混勻后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；H.離心管中的UCP沉降物中加入少量水，超聲波處理30s將其充分混合均勻；I.將UCP懸濁液倒入蒸發(fā)皿中，110℃蒸干。
(3)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面醛基化
A.將100mg氨基化UCP加入圓底磨口燒瓶中；B.將90ml pH＝9.5，0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，加入盛有氨基化UCP的圓底磨口燒瓶中，用超聲波處理30s將燒瓶中的反應(yīng)體系充分混合均勻；C.UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入10ml 50％戊二醛，磁力攪拌，常溫反應(yīng)1h；D.將UCP懸濁液反應(yīng)體系分別倒入6支20ml離心管中，用少量pH＝9.5，0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；E.用pH＝9.5 0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-4次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(超聲30s混勻后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；實(shí)施例2采用戊二醛還原法修飾與活化的UCP制備生物標(biāo)記物1.連接抗體(本例中的抗體采用羊抗炭疽芽孢抗體)A.將實(shí)施例1步所得6支盛有醛基化UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的pH＝9.5，0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻，將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；B.共用39.175ml 4℃預(yù)冷的pH＝9.5 0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；C.99.175ml的UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入825μl 2mg/ml羊抗炭疽芽孢抗體，4℃，攪拌反應(yīng)4h；D.UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2.5ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝9.5，0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液配制)，4℃，攪拌反應(yīng)2h；E.UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入250mg NaBH4，4℃，攪拌反應(yīng)1h；F.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/LPB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；G.用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；H.向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含1.0％BSA和0.5％Tween 20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹颍瑢覞嵋旱谷霟恐?；I.共用40ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；J.100ml UCP懸濁液反應(yīng)體系，4℃，攪拌反應(yīng)2h；
K.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween 20、0.02％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；L.用4℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-1次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；M.向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；N.共用40ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；O.將UCP-抗體標(biāo)記物保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 應(yīng)用此實(shí)驗(yàn)中制備的UCP-羊抗炭疽芽孢抗體標(biāo)記物可以免疫夾心模式，應(yīng)用免疫層析裝置對(duì)待檢測(cè)樣品中所含有的炭疽芽孢進(jìn)行檢測(cè)將UCP標(biāo)記的羊抗炭疽芽孢抗體固定于結(jié)合物釋放墊中；檢測(cè)帶上固定羊抗炭疽芽孢抗體；而質(zhì)控帶上則固定兔抗羊IgG抗體。當(dāng)將陽性待測(cè)樣品滴加到樣品墊上后，待測(cè)樣品中的炭疽芽孢會(huì)和UCP標(biāo)記的羊抗炭疽芽孢抗體特異的結(jié)合，并在吸水墊的虹吸作用下流經(jīng)檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，當(dāng)樣品中攜帶的UCP-抗體-芽孢流經(jīng)檢測(cè)帶時(shí)會(huì)與檢測(cè)帶上的羊抗炭疽芽孢抗體結(jié)合形成UCP-抗體-芽孢-抗體的夾心結(jié)構(gòu)，并被固定于檢測(cè)帶上。多余的UCP標(biāo)記的羊抗炭疽芽孢抗體無法與檢測(cè)帶結(jié)合，在隨樣品流經(jīng)質(zhì)控帶時(shí)，與質(zhì)控帶上的兔抗羊IgG抗體結(jié)合固定于質(zhì)控帶上。而對(duì)于陰性待測(cè)樣品，則由于樣品中缺乏炭疽芽孢而無法形成夾心結(jié)構(gòu)將UCP固定于檢測(cè)帶上，而只是與質(zhì)控帶上的兔抗羊IgG抗體結(jié)合。當(dāng)用檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)，陽性樣品在檢測(cè)帶與質(zhì)控帶上均會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)的磷光信號(hào)；而陰性樣品只有質(zhì)控帶上有磷光信號(hào)。磷光信號(hào)的強(qiáng)弱與UCP的含量成正比，因而檢測(cè)帶上的信號(hào)也就正比地反映了炭疽芽孢的含量。通過公式(T-B)/C(T是檢測(cè)帶上磷光光強(qiáng)，C是質(zhì)控帶上磷光光強(qiáng)，B是檢測(cè)帶與質(zhì)控帶之間非特異的背景信號(hào))消除層析裝置檢測(cè)的系統(tǒng)誤差，可進(jìn)一步提高靈敏度與穩(wěn)定性。此外，表面連接了針對(duì)被檢物表面分化抗原的抗體的UCP，與流式細(xì)胞儀相結(jié)合，還可以其超強(qiáng)適于多重分析的性能同時(shí)精確地對(duì)細(xì)胞、細(xì)菌、病原體等進(jìn)行分型鑒定及豐度測(cè)定，即根據(jù)成分及相對(duì)豐度提供被分析樣品的“指紋圖”，為進(jìn)一步的研究工作提供豐富的信息。
2.連接親合素A.將實(shí)施例1所得6支盛有醛基化UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的pH＝9.5，0.05mol/l Na2CO3-NaHCO3緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻，將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；B.共用40ml 4℃預(yù)冷的pH＝9.5，0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；C.100mlUCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2mg親合素，4℃，攪拌反應(yīng)4h；D.UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2.5ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝9.5，0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液配制)，4℃，攪拌反應(yīng)2h；E.UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入250mg NaBH4，4℃，攪拌反應(yīng)1h；F.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/LPB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；G.用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；H.向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含1.0％BSA和0.5％Tween 20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；I.共用40ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；J.100ml UCP懸濁液反應(yīng)體系，4℃，攪拌反應(yīng)2h；K.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween 20、0.02％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；L.用4℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-1次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；M.向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；N.共用40ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；O.將UCP-親合素標(biāo)記物保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 應(yīng)用將一種看家基因的cDNA作為探針，點(diǎn)樣后構(gòu)建成微點(diǎn)陣；待檢RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后與生物素結(jié)合，作為探針檢測(cè)的靶標(biāo)；以連接有親合素的UCP作為微點(diǎn)陣的發(fā)光標(biāo)記物。這樣經(jīng)過雜交反應(yīng)便構(gòu)成了探針cDNA-靶標(biāo)cDNA-生物素-親合素-UCP的可被檢測(cè)的特異結(jié)合體。使用氙燈寬視野顯微鏡(a wide-field microscopy)便可對(duì)微點(diǎn)陣上特異結(jié)合的UCP進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例3EDC法修飾與活化UCP(1)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面硅化A.稱量100mg UCP加入150ml圓底磨口燒瓶中；B.3.194ml H2O與2.294ml 28％氨水混合，并加入異丙醇至混合體系總體積為100ml，混合均勻；C.將“B”中的混合液反應(yīng)體系，加入盛有UCP的150ml圓底磨口燒瓶中，用超聲波處理30s將燒瓶中的反應(yīng)體系充分混合均勻；D.將燒瓶中放入磁轉(zhuǎn)子，上口接冷凝回流系統(tǒng)，在40℃左右水浴中，磁力攪拌，平衡30min；E.燒瓶中的懸濁液反應(yīng)體系，加入350μl TEOS，40℃左右，磁力攪拌4h；F.上口改為蒸餾系統(tǒng)，將水浴升溫至83℃左右，磁力攪拌，蒸干燒瓶中的混合液反應(yīng)體系；(注異丙醇的沸點(diǎn)為82.4℃，其與水的共沸物沸點(diǎn)為80.4℃)(2)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面氨基化A.上一步得到的UCP干粉中加入100ml三氯甲烷，用超聲波處理30s將燒瓶中的體系充分混合均勻，并倒入在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中處理好的燒瓶中；B.燒瓶中懸濁液反應(yīng)體系，加入198μl APES，放入磁轉(zhuǎn)子，上口接蒸餾系統(tǒng)；C.將燒瓶放入62℃左右水浴中磁力攪拌，蒸干混合液反應(yīng)體系；D.將UCP連同燒瓶放入110℃烘箱中老化6h；E.老化的UCP中加入20ml水，超聲波處理30s將燒瓶中體系充分混合均勻；F.將懸濁液倒入20ml離心管中，少量水清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；G.用水作為清洗液進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(超聲30s混勻后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；H.離心管中的UCP沉降物加入少量水，超聲波處理30s將其充分混合均勻；I.將UCP懸濁液倒入蒸發(fā)皿中，110℃蒸干。
(3)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面羧基化A.將100mg氨基化UCP加入圓底磨口燒瓶中；B.1g琥珀酸酐，加入100ml pH＝11，0.5mol/L PB緩沖液中，水浴加熱使溶解；C.將“B”中的混合液反應(yīng)體系，加入盛有UCP的圓底磨口燒瓶中，用超聲波處理30s將燒瓶中的反應(yīng)體系充分混合均勻；D.磁力攪拌，室溫反應(yīng)8h；
E.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，PH＝4.7，0.03mol/L的PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；F.用pH＝4.70.03mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-4次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(超聲處理30s后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡。
(4)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面EDC活化A.上步所得6支盛有羧基化UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml pH＝4.7，0.03mol/L PB緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻，將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；B.共用40ml pH＝4.7，0.03mol/L PB緩沖液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；C.100ml的UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入100mg EDC，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h；D.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用pH＝4.7，0.03mol/L的PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；E.用4℃預(yù)冷的pH＝4.70.03mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心10min)-2次(攪拌震蕩后，離心10min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡。
實(shí)施例4采用EDC法修飾與活化的UCP制備生物標(biāo)記物1.連接抗體(本例中的抗體采用羊抗炭疽芽孢抗體)A.99ml 4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，加入2mg/ml羊抗炭疽芽孢抗體1ml，混合均勻；B.將實(shí)施例3所得6支盛有UCP(羧基被活化)沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的“A”中的混合液，超聲波處理30s充分混勻，將懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；C.用剩余的4℃預(yù)冷的“A”中混合液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；D.UCP懸濁液反應(yīng)體系，4℃，攪拌反應(yīng)4h；E.UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2.5ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液配制)，4℃，攪拌反應(yīng)2h；F.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；G.用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；H.向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液(Ph＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含1.0％BSA和0.5％Tween 20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；I.共用40ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗也合并入燒瓶中；J.100ml UCP懸濁液反應(yīng)體系，4℃，攪拌反應(yīng)2h；K.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween 20、0.02％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；L.用4℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-1次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；M.向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；N.共用40ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；O.將UCP-抗體標(biāo)記物保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 2.連接親合素A.100ml 4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，加入2mg親合素，混合均勻；B.將實(shí)施例3所得6支盛有UCP(羧基被活化)沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的“A”中的混合液，超聲波處理30s充分混勻，將懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；C.用剩余的4℃預(yù)冷的“A”中混合液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；D.UCP懸濁液反應(yīng)體系，4℃，攪拌反應(yīng)4h；E.UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2.5ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液配制)，4℃，攪拌反應(yīng)2h；F.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/LPB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；G.用4℃預(yù)冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，4℃，1次(離心20min)-2次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；H.向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含1.0％BSA和0.5％Tween 20)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；I.共用40ml 4℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；J.100ml UCP懸濁液反應(yīng)體系，4℃，攪拌反應(yīng)2h；K.將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入6支20ml離心管中，用4℃預(yù)冷的UCP保存液(pH＝7.2，0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween 20、0.02％NaN3)清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；L.用4℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，1次(離心20min)-1次(不重懸沉降物，離心10min)-1次(攪拌震蕩后，離心20min)，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；M.向6支盛有UCP沉降物的離心管中，分別加入10ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；N.共用40ml 4℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)6支離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；O.將UCP-親合素標(biāo)記物保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，其特征在于其表面覆蓋一層薄而均勻的SiO2。
2.如權(quán)利要求1所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，其特征在于SiO2層上包含硅烷化衍生物修飾而得到活性游離基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，其特征在于所述的硅烷化衍生物是三乙氧基-3-氨基丙基硅烷。
4.如權(quán)利要求1-3之一所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，其特征在于它還連有接生物活性分子。
5.如權(quán)利要求4所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，其特征在于它是通過雙功能交聯(lián)劑與選自抗體、酶、寡核苷酸、蛋白質(zhì)的生物活性分子連接的。
6.如權(quán)利要求5所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，其特征在于所述的雙功能交聯(lián)劑為葡聚糖、氨基羧基聚乙二醇、雙氨基聚乙二醇、戊二醛、對(duì)二苯甲醛。
7.一種生物檢測(cè)裝置，其特征在于包括權(quán)利要求4-6之一的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料作為生物標(biāo)記物。
8.一種對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料進(jìn)行表面修飾處理的方法，其特征在于包括(1)對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面進(jìn)行硅化處理形成SiO2層；(2)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料所形成的SiO2層與硅烷化試劑的衍生物反應(yīng)，修飾活性游離基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于硅烷化衍生物是三乙氧基-3-氨基丙基硅烷。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于活性游離基團(tuán)選自-NH2、-COOH、-OH。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于進(jìn)一步包括步驟(3)將步驟(2)所得的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料通過其表面修飾的活性游離基團(tuán)，經(jīng)雙功能交聯(lián)劑與生物活性分子相連接，所述生物活性分子選自抗體、酶、寡核苷酸、蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述雙功能交聯(lián)劑為葡聚糖、氨基羧基聚乙二醇、雙氨基聚乙二醇、戊二醛、對(duì)二苯甲醛。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于采用戊二醛作為雙功能交聯(lián)劑，和低濃度的NaBH4作為還原劑。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于進(jìn)一步經(jīng)BSA和Tween 20封閉。
15.如權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟(1)和(2)是有機(jī)相中進(jìn)行，并且以蒸干體系結(jié)束反應(yīng)。
16.一種生物標(biāo)記物的制備方法，其特征在于該方法包含如下步驟上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面硅化100體積份異丙醇中加入2-3體積份氨水和3-4體積份H2O，混合均勻；稱量100重量份UCP，將混合液反應(yīng)體系加入其中，用超聲波處理30s將反應(yīng)體系充分混合均勻；放入磁轉(zhuǎn)子，在30-50℃水浴中，磁力攪拌，平衡20-40min；懸濁液反應(yīng)體系，加入0.3-0.5體積份正硅酸乙脂；30-50℃磁力攪拌器攪拌反應(yīng)3-5h；上口改為蒸餾系統(tǒng)，將水浴升溫至80-100℃左右，磁力攪拌，蒸干燒瓶中的混合液反應(yīng)體系；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面氨基化上一步得到的UCP中加入100體積份三氯甲烷，用超聲波處理30s將燒瓶中的體系充分混合均勻，并倒入在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中處理好的燒瓶中；燒瓶中的懸濁液反應(yīng)體系，加入0.1-0.3體積份APES，并放入磁轉(zhuǎn)子，上口接蒸餾系統(tǒng)；將燒瓶放入60-80℃左右水浴中磁力攪拌，蒸干混合液反應(yīng)體系；將UCP連同燒瓶放入100-120℃烘箱中老化5-8h；老化的UCP中加入20體積份水，超聲波處理30s將燒瓶中的體系充分混合均勻；將懸濁液倒入離心管中，用少量水清洗燒瓶，洗液合并入離心管中；用水作為清洗液進(jìn)行12000r/min離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，超聲30s混勻后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；離心管中的UCP沉降物中加入少量水，用超聲波處理30s將其充分混合均勻；將UCP懸濁液倒入蒸發(fā)皿中，100-120℃蒸干；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面醛基化將100重量份氨基化UCP加入圓底磨口燒瓶中；將85-90體積份pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，加入盛有氨基化UCP的圓底磨口燒瓶中，用超聲波處理30s將燒瓶中的反應(yīng)體系充分混合均勻；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入10-15體積份50％戊二醛，磁力攪拌，常溫反應(yīng)1-2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系分別倒入離心管中，用少量pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共4次，超聲30s混勻后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；
17.如權(quán)利要求16所述的生物標(biāo)記物的制備方法，其特征在于該方法還包含如下步驟100重量份醛基化UCP中，加入99-99.2體積份3-5℃預(yù)冷的pH＝8-10，0.01-0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入0.8-1體積份1-3mg/ml抗體，3-5℃，攪拌反應(yīng)3-5h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4ml40mg/ml牛血清白蛋白BSA，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4重量份NaBH4，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液，其為pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB緩沖液中含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100體積份UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，其為pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3，清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹颍瑢覞嵋旱谷肽タ谠噭┢恐?；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；將UCP-抗體標(biāo)記物保存于3-5℃?zhèn)溆茫?br> 18.如權(quán)利要求16所述的生物標(biāo)記物的制備方法，其特征在于該方法還包含如下步驟100重量份醛基化UCP中，加入100體積份3-5℃預(yù)冷的pH＝8-10，0.01-0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入1-3重量份親合素，3-5℃，攪拌反應(yīng)3-5h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4ml 40mg/ml牛血清白蛋白BSA，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4重量份NaBH4，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液，其為pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100體積份UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，其為pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3，清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；將UCP-生物素標(biāo)記物保存于3-5℃?zhèn)溆茫?br> 19.如權(quán)利要求16所述的生物標(biāo)記物的制備方法，其特征在于該方法包含如下步驟上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面羧基化1000-1100重量份琥珀酸酐，加入100體積份pH＝10-12，0.1-1.0mol/L PB緩沖液中，水浴加熱使溶解；將混合液反應(yīng)體系，加入盛有100重量份氨基化UCP的圓底磨口燒瓶中，用超聲波處理30s將燒瓶中的反應(yīng)體系充分混合均勻；磁力攪拌，室溫反應(yīng)7-9h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，pH＝3-5，0.01-0.05mol/L的PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用pH＝3-5，0.01-0.05mol/LPB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共4次，超聲處理30s后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面羧基的EDC活化盛有羧基化UCP沉降物的離心管中，加入60體積份pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB緩沖液，用超聲波處理30s充分混勻，將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；共用40體積份pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB緩沖液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入90-110重量份EDC，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)1-2h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用pH＝3-5，0.01-0.05mol/LPB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心10-15min，共2次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；
20.如權(quán)利要求19所述的生物標(biāo)記物的制備方法，其特征在于該方法還包含如下步驟99體積份3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，加入1-3mg/ml抗體1體積份，混合均勻；60體積份上述反應(yīng)混合液加入盛有羧基被活化的UCP沉降物的離心管中，超聲波處理30s充分混勻，將懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；用剩余的40體積份3-5℃預(yù)冷的反應(yīng)混合液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)3-5h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4ml 40mg/ml牛血清白蛋白BSA，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液，其為pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100體積份UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，其為pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3，清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹颍瑢覞嵋旱谷肽タ谠噭┢恐?；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液分多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液合并入磨口試劑瓶中；將UCP-抗體標(biāo)記物保存于3-5℃?zhèn)溆茫?br> 21.如權(quán)利要求19所述的生物標(biāo)記物的制備方法，其特征在于該方法還包含如下步驟100體積份3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中，加入1-3重量份親合素，混合均勻；60體積份上述反應(yīng)混合液加入盛有羧基被活化的UCP沉降物的離心管中，超聲波處理30s充分混勻，將懸濁液反應(yīng)體系倒入燒瓶中；用剩余的40體積份3-5℃預(yù)冷的反應(yīng)混合液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)3-5h；UCP懸濁液反應(yīng)體系中，加入2-4ml 40mg/ml牛血清白蛋白BSA，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，3-5℃，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共2次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液，其為pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入燒瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP封閉液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入燒瓶中；100體積份UCP懸濁液反應(yīng)體系，3-5℃，攪拌反應(yīng)1-3h；將UCP懸濁液反應(yīng)體系倒入離心管中，用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，其為pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB緩沖液中含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3，清洗燒瓶，洗液也合并入離心管中；用3-5℃預(yù)冷的UCP保存液作為清洗液，進(jìn)行12000r/min，離心15-30min，共1次，不重懸沉降物，離心10-15min，共1次，攪拌震蕩后，離心15-30min，共1次，離心清洗，每次將上清液盡量吸盡；向盛有UCP沉降物的離心管中，加入60體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?，將懸濁液倒入磨口試劑瓶中；共?0體積份3-5℃預(yù)冷的UCP保存液分為多次對(duì)離心管進(jìn)行清洗，洗液也合并入磨口試劑瓶中；將UCP-親合素標(biāo)記物保存于3-5℃?zhèn)溆茫?br> 22.如權(quán)利要求16、17、18、19、20或21所述的生物標(biāo)記物的制備方法，其特征在于該方法中的溫度參數(shù)3-5℃均可以是4℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表面覆蓋一層薄而均勻的SiO
文檔編號(hào)G01V15/00GK1521231SQ20041000091
公開日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2004年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月23日
發(fā)明者周蕾, 紀(jì)軍, 楊瑞馥, 王津, 鄭巖, 侯秀潔, 周 蕾 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物