專利名稱：羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，尤其涉及羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
羅氏沼蝦肌肉白濁病又稱白體病、白尾病，主要危害羅氏沼蝦苗種，發(fā)生于蝦苗淡化后放養(yǎng)到池塘3-5周內(nèi)，病蝦表現(xiàn)為肌肉白斑或呈白濁狀，病蝦可在較短時(shí)間內(nèi)大量死亡，特別是對(duì)于高密度養(yǎng)殖的育苗池內(nèi)，死亡率可高達(dá)40-90％。該病最早于1996年前后被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已蔓延到全國主要羅氏沼蝦養(yǎng)殖場，造成了羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失。2001年起，在每年4月后在許多羅氏沼蝦苗種場流行，一旦發(fā)生，便造成當(dāng)年發(fā)病苗場育苗失敗，成為羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要威脅。
該病的病原是羅氏沼蝦諾達(dá)病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV)，這是一種直徑為24-25nm的廿面體球狀病毒，由兩個(gè)單鏈RNA分子組成，分別為3.0kb和1.3kb，分類上屬諾達(dá)病毒科，但不同于已知的兩個(gè)屬，病毒的分類地位還未最終確定。病毒主要感染羅氏沼蝦的肌肉細(xì)胞，引起肌肉壞死，導(dǎo)致蝦的死亡。該病毒的傳染性較強(qiáng)，以浸泡感染健康蝦苗即可引起發(fā)病。由于羅氏沼蝦苗種業(yè)屬于投入高、利潤和風(fēng)險(xiǎn)均很大的產(chǎn)業(yè)，該病目前業(yè)已成為羅氏沼蝦種苗業(yè)的主要威脅。目前除肉眼觀察外，還沒有簡便易行的方法供養(yǎng)殖場使用，進(jìn)行疾病及病毒的確診。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測方便、靈敏度高的羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述診斷試劑盒的檢測方法。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，及時(shí)檢測出羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒，減少損失，本發(fā)明一種羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒診斷試劑盒，由酶標(biāo)板、病毒陽性對(duì)照、病毒陰性對(duì)照、抗病毒單克隆抗體、酶標(biāo)抗小鼠抗體、酶顯色液、終止液、樣品稀釋及沖洗液組成，其特征在于其中的酶標(biāo)板為抗羅氏沼蝦諾達(dá)病毒抗體包被的酶標(biāo)板，病毒陽性對(duì)照為含有羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的羅氏沼蝦研磨液，抗病毒單克隆抗體為對(duì)羅氏沼蝦諾達(dá)病毒有高度特異性和結(jié)合力的小鼠單克隆抗體；其中所述的酶顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；終止液為H2SO4；樣品稀釋及沖洗液為磷酸緩沖液(PBS)；本發(fā)明還提供一種羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒檢測方法，包括如下步驟(1)、取待測的蝦苗于EP管中，加入，充分研磨，搖勻，離心；(2)、取上清液加入已包被好抗病毒抗體的酶標(biāo)板中(固相載體)，同時(shí)加入陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照，在37℃孵育60min，用沖洗液沖洗、拍干；(3)、各孔中加入小鼠單克隆抗體，37℃孵育60min，用沖洗液沖洗、拍干；(4)、每孔加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育60min，沖洗、拍干；(5)、每孔中加入顯色液，混勻、置于暗處若干分鐘；(6)、每孔中加入硫酸數(shù)滴，終止反應(yīng)，觀察色澤變化，如顯黃色說明已感染肌肉白濁病病毒，否則沒有感染。
本發(fā)明提供了專門用于引起羅氏沼蝦肌肉白濁病的諾達(dá)病毒的測定方法和相應(yīng)的診斷試劑盒，有極高的特異性和靈敏度，所采用的方法簡便易行，許多苗種場可就地使用本方法進(jìn)行病毒的診斷，可以預(yù)防羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒的大面積蔓延、擴(kuò)散。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例本發(fā)明一種羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒檢測試劑由酶標(biāo)板、病毒陽性對(duì)照、病毒陰性對(duì)照、抗病毒單克隆抗體、酶標(biāo)抗小鼠抗體、酶顯色液、終止液、樣品稀釋及沖洗液組成，其中的酶標(biāo)板為抗羅氏沼蝦諾達(dá)病毒抗體包被的酶標(biāo)板，病毒陽性對(duì)照為含有羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的羅氏沼蝦病苗研磨液，抗病毒單克隆抗體為對(duì)羅氏沼蝦諾達(dá)病毒有高度特異性和結(jié)合力的小鼠單克隆抗體，酶顯色液采用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，終止液為2M H2SO4，樣品稀釋及沖洗液(X10)10X磷酸鹽緩沖液(PBS)。
測蝦苗時(shí)，按如下步驟操作(1)、取待測蝦苗1～2尾于1.5ml EP管中，加入10X磷酸鹽緩沖液0.3毫升，充分研磨，搖勻，9000rpm，離心5min；(2)、取0.1ml離心上清，加入已包被好抗病毒抗體的酶標(biāo)板中(固相載體)，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照(加沖洗液0.1ml)各1孔，37℃孵育60min，用沖洗液10X磷酸鹽緩沖液沖洗三次，每次拍干。
(3)、每孔加入小鼠抗病毒抗體0.1ml，37℃孵育60min，用沖洗液10X磷酸鹽緩沖液沖洗三次，每次拍干；(4)、每孔加入酶標(biāo)抗體0.1ml，37℃孵育60min，用沖洗液10X磷酸鹽緩沖液沖洗三次，每次拍干；(5)、將顯色液TMB 0.05ml加入到10ml底物稀釋液中，底物稀釋液為pH5.0的磷酸—檸檬酸緩沖液中，加入15μL 30％過氧化氫，混勻，每孔加入0.1ml，黑暗中顯色15min；(6)、加入2M硫酸1-2滴，終止反應(yīng)。
觀察結(jié)果樣品中呈明顯的黃色，表示感染了羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒。
權(quán)利要求
1.羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，由酶標(biāo)板、病毒陽性對(duì)照、病毒陰性對(duì)照、抗病毒單克隆抗體、酶標(biāo)抗小鼠抗體、酶顯色液、終止液、樣品稀釋及沖洗液組成，其特征在于其中的酶標(biāo)板為抗羅氏沼蝦諾達(dá)病毒抗體包被的酶標(biāo)板，病毒陽性對(duì)照為含有羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的羅氏沼蝦苗研磨液，抗病毒單克隆抗體為對(duì)羅氏沼蝦諾達(dá)病毒有高度特異性和結(jié)合力的小鼠單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于酶顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于終止液為H2SO4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于樣品稀釋及沖洗液為磷酸鹽緩沖液(PBS)。
5.一種羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)、取待測的蝦苗于EP管中，加入磷酸鹽緩沖液，充分研磨，離心；(2)、取上清液加入已包被好抗病毒抗體的酶標(biāo)板中(固相載體)，同時(shí)加入陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照，在37℃孵育60min，用沖洗液沖洗、拍干；(3)、在各孔中加入小鼠單克隆抗體，37℃孵育60min，用沖洗液沖洗、拍干；(4)、每孔加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育60min，沖洗、拍干；(5)、每孔中加入顯色液，混勻、置于暗處若干分鐘；(6)、每孔中加入硫酸數(shù)滴，終止反應(yīng)，觀察色澤變化。
全文摘要
本發(fā)明涉及羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明診斷試劑盒由酶標(biāo)板、病毒陽性對(duì)照、病毒陰性對(duì)照、抗病毒單克隆抗體、酶標(biāo)抗小鼠抗體、酶顯色液、終止液、樣品稀釋及沖洗液組成，其中的酶標(biāo)板為抗羅氏沼蝦諾達(dá)病毒抗體包被的酶標(biāo)板，病毒陽性對(duì)照為含有羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的羅氏沼蝦苗研磨液，抗病毒單克隆抗體為對(duì)羅氏沼蝦諾達(dá)病毒有高度特異性和結(jié)合力的小鼠單克隆抗體，通過使用本診斷試劑盒可以快速有效的檢測出羅氏沼蝦蝦苗中的肌肉白濁病病毒，對(duì)羅氏沼蝦蝦肌肉白濁病病毒的防治具有重大意義。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1603830SQ03143428
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2003年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者錢冬, 劉問, 楊國梁 申請(qǐng)人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所