用于分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的設(shè)備的制造方法
【專利說(shuō)明】用于分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的設(shè)備
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種中型流體系統(tǒng)，其用于分析樣品中細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，特別是精子樣 品中細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。本發(fā)明還設(shè)及評(píng)估樣品中運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量的方法，W及從非運(yùn) 動(dòng)細(xì)胞中取出運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的方法，特別是使用所述中型流體系統(tǒng)從非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞中取出運(yùn)動(dòng)細(xì) 胞的方法。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 意識(shí)到在過(guò)去幾十年中男性生育能力下降已經(jīng)很高，因此產(chǎn)生了分析精子樣品的 需求。特別是，已經(jīng)知曉樣品中運(yùn)動(dòng)精子細(xì)胞的濃度是關(guān)于評(píng)估樣品可育性的最具有預(yù)測(cè) 性的因素（Tomlinson等人，2013,HumanFertility, 1-19)。目前，用于評(píng)定精子樣品中細(xì) 胞的數(shù)量和運(yùn)動(dòng)性的分析通常由專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中完成，并且在現(xiàn)有技術(shù)中用于評(píng) 估男性生育能力的家庭診斷設(shè)備僅在有限范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)。運(yùn)類家庭診斷設(shè)備應(yīng)該優(yōu)選易于 使用，并且為了具有用后可丟棄的性質(zhì)，其應(yīng)該W低成本購(gòu)買，而不需要輔助儀器例如顯微 鏡、用于阻抗測(cè)量的電極或類似物。
[0003] W02012/126478中記載了一種用于在家中的舒適環(huán)境中測(cè)試精子樣品的設(shè)備。 W02012/126478記載了一種中型流體系統(tǒng)，其能夠基于運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性分離運(yùn)動(dòng)細(xì)胞， 并允許檢測(cè)和定量所述細(xì)胞。所述系統(tǒng)包括通過(guò)通道與另一分析室流體連通的第一分析 室，其中所述通道具有與所述第一分析室流體連通的進(jìn)入端口W及與所述另一分析室流體 連通的離開端口，其中所述進(jìn)入端口的橫截面積大于所述離開端口的橫截面積。每個(gè)分析 室還包括固-液分離單元，其界定了面向所述分析室的上游表面和面向流出通道的下游表 面，W便經(jīng)由所述固-液分離單元允許所述分析室和所述流出通道之間的流體連通。所連 接的分析室允許運(yùn)動(dòng)細(xì)胞從所述第一分析室移至下一個(gè)分析室，從而提供樣品中細(xì)胞運(yùn)動(dòng) 性的評(píng)估。
[0004] W02012/126478還記載了中型流體系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案，所述中型流體系統(tǒng)還 包括界定與調(diào)節(jié)培養(yǎng)基側(cè)相對(duì)的樣品應(yīng)用側(cè)的細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器（cellperme油le filter)，其中所述細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器具有允許運(yùn)動(dòng)細(xì)胞游動(dòng)穿過(guò)所述過(guò)濾器的孔尺寸。 所述細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器被描述為將應(yīng)用到樣品應(yīng)用側(cè)的樣品的液體與存在于或加入到 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基側(cè)的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的混合最小化。因此，提供細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器W確保細(xì)胞不 通過(guò)對(duì)流（convection)被從樣品應(yīng)用側(cè)運(yùn)輸?shù)秸{(diào)節(jié)培養(yǎng)基側(cè)，W使存在于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基側(cè) 的細(xì)胞將成為已經(jīng)通過(guò)游動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器而橫穿其的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞。 陽(yáng)0化]現(xiàn)有技術(shù)的設(shè)備存在一些缺點(diǎn)，其在評(píng)估運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的數(shù)量時(shí)提供有限的準(zhǔn)確度。 特別地，甚至當(dāng)并入細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器時(shí)，目前可購(gòu)得的設(shè)備尚不能充分降低，例如非運(yùn) 動(dòng)細(xì)胞的污染。運(yùn)進(jìn)而意味著，非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞可能被包括在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的評(píng)估結(jié)果中。此外， 運(yùn)動(dòng)精子細(xì)胞穿過(guò)流體通道的遷移可能將定量的點(diǎn)的濃度降低到難W檢測(cè)的水平。運(yùn)對(duì)于 包括一些串聯(lián)連接的分析室的系統(tǒng)來(lái)說(shuō)似乎特別正確。
[0006] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)是克服運(yùn)些缺點(diǎn)并提供一種具有提高的評(píng)估準(zhǔn)確性并同時(shí)符 合可操作的家庭診斷設(shè)備的要求的中型流體系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)方面設(shè)及一種中型流體系統(tǒng)，其包括具有樣品室和分析室的基 體；所述樣品室包括界定樣品應(yīng)用隔室和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室的細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器；
[0008] 所述樣品室具有在所述樣品應(yīng)用隔室中的樣品入口端口；
[0009] 所述分析室具有進(jìn)入端口和離開端口；
[0010] 所述調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室經(jīng)由通道與所述分析室的進(jìn)入端口流體連通；
[0011] 其中所述樣品應(yīng)用隔室在所述細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的下方并且所述調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 隔室在所述細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的上方。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的中型流體系統(tǒng)可用于評(píng)估樣品中特別是液體樣品中的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的 數(shù)量。通常，將樣品添加至樣品應(yīng)用隔室，存在于樣品中的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞會(huì)從所述樣品應(yīng)用隔室 游動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器進(jìn)入存在于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室中的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 隔室中的液體可W被移至分析室，在所述分析室中可W對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析例如定量。由于運(yùn) 動(dòng)細(xì)胞與不能穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞分離，因此在分析室中被量化的細(xì)胞 是運(yùn)動(dòng)細(xì)胞。 陽(yáng)〇1；3]對(duì)于本發(fā)明，手冊(cè)"W冊(cè) 1 油oratorymanualfortheExaminationand processingofhumansemen"(第五片反，WorldHealthOrganization, 2010,ISBN978 92 4 154778 9)提供了關(guān)于精子細(xì)胞的背景信息，并且所述手冊(cè)W引用的方式全文納入本文。
[0014] 基體可W由任何合適的材料制成。樣品室可具有任何合適的形狀或尺寸，條件是 樣品室能夠被細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器分為兩個(gè)單獨(dú)的隔室。細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器界定調(diào)節(jié)培 養(yǎng)基隔室和樣品應(yīng)用隔室，并且因此細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器被認(rèn)為具有分別面向調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 隔室和樣品應(yīng)用隔室的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基側(cè)和樣品應(yīng)用側(cè)。在所述系統(tǒng)的一個(gè)設(shè)想的用途中，調(diào) 節(jié)培養(yǎng)基被添加至調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室。待分析的樣品被添加至樣品應(yīng)用隔室。添加調(diào)節(jié)培養(yǎng) 基和樣品的順序不重要，雖然在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在將調(diào)節(jié)培養(yǎng)基添加至調(diào)節(jié)培養(yǎng) 基隔室之前將樣品添加至樣品應(yīng)用隔室。因此，樣品應(yīng)用隔室和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室可W分別 具有任何合適的尺寸。細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器通過(guò)跨越樣品室界定樣品應(yīng)用隔室和調(diào)節(jié)培養(yǎng) 基隔室，使得僅該兩個(gè)隔室之間的流體連通（fluidicconnection)通過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾 器。細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器可W具有任何合適的設(shè)計(jì)、材料和形狀，其允許待分析的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞 游動(dòng)穿過(guò)所述過(guò)濾器，從而允許細(xì)胞從樣品應(yīng)用隔室行進(jìn)到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室中。具體地，根 據(jù)待分離的細(xì)胞的尺寸和其它特征，例如，根據(jù)細(xì)胞的尺寸相對(duì)于細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的 孔的尺寸來(lái)選擇細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器。細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器，例如細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的 孔，可包括將運(yùn)動(dòng)細(xì)胞吸引至其的材料。樣品應(yīng)用隔室在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的下方，并且 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室因此在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的上方。術(shù)語(yǔ)"下方"是參照重力場(chǎng)看的，使得 將在從"上方"到"下方"的方向上施加重力。細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器可提供樣品隔室在 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室的下方的任何合適的方式跨越樣品隔室。
[0015] 本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品應(yīng)用隔室在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的下方并且調(diào)節(jié)培 養(yǎng)基隔室在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的上方時(shí)，應(yīng)用細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的用于將運(yùn)動(dòng)細(xì)胞與 非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞分離的效果顯著提高。在另一個(gè)方面，本發(fā)明設(shè)及評(píng)估樣品中運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的數(shù)量 的方法，所述方法包括W下步驟：提供細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器；
[0016] 將含有運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的樣品應(yīng)用在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的下方；
[0017] 允許樣品中的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞游動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器；
[0018] 檢測(cè)已經(jīng)游動(dòng)穿過(guò)所述過(guò)濾器的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞。在一個(gè)另外的方面，本發(fā)明設(shè)及從非 運(yùn)動(dòng)細(xì)胞中取出運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的方法，所述方法包括W下步驟：提供細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器；
[0019] 將含有運(yùn)動(dòng)細(xì)胞和非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的樣品應(yīng)用在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器的下方；
[0020] 允許樣品中的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞游動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器；
[0021] 取出已經(jīng)游動(dòng)穿過(guò)所述過(guò)濾器的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，為本發(fā)明的任何方面所描 述的所有變化和實(shí)施方案都與本發(fā)明的任何其它方面相關(guān)，并且實(shí)施方案的特征可W自由 組合。
[0022] 本發(fā)明的系統(tǒng)或方法可W采用存在于或添加到細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器下方的細(xì)胞 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。在本發(fā)明的上下文中，"細(xì)胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基"是任何意欲支持樣品中的細(xì)胞例如 保持細(xì)胞有活力的液體，并且它可W視情況對(duì)于特定細(xì)胞而言含有例如營(yíng)養(yǎng)素、鹽、緩沖液 和/或粘度改性劑。同樣地，本發(fā)明的系統(tǒng)或方法可W采用存在于或添加到細(xì)胞可透過(guò)的 過(guò)濾器的上方的樣品培養(yǎng)基。"樣品培養(yǎng)基"還可W視情況對(duì)于特定細(xì)胞而言含有營(yíng)養(yǎng)素、 鹽、緩沖液和/或粘度改性劑，并且它可W與細(xì)胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基相同，或者樣品培養(yǎng)基和細(xì)胞 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基可W具有不同組分。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基和/或樣品培養(yǎng)基可 W包含檢測(cè)試劑。在某一實(shí)施方案中，所述中型流體系統(tǒng)或所述方法不采用樣品培養(yǎng)基。
[0023] 用于定量運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的任何合適的方法可W應(yīng)用在根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)中，并且分析 室可W具有任何合適的適應(yīng)所選擇的方法的形狀或尺寸。分析室包括進(jìn)入端口和離開端 口。在本發(fā)明的上下文中，"端口"是任何合適的允許經(jīng)由該端口的流體連通的開口。端口 可W是默認(rèn)開放的，或者它可W是閉合的，需要經(jīng)由致動(dòng)器（例如閥）打開。進(jìn)入端口為液 體提供入口，例如，含有運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至分析室的入口。離開端口允許調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 離開分析室，并且進(jìn)一步地還可W經(jīng)由分析室的離開端口將調(diào)節(jié)培養(yǎng)基應(yīng)用到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 隔室。同樣地，分析室的端口允許流體流動(dòng)穿過(guò)本中型系統(tǒng)。進(jìn)入端口和離開端口可W具 有任何合適的提供該功能的設(shè)計(jì)，并且端口可W與流體通道流體連通。在一個(gè)具體的實(shí)施 方案中，樣品入口端口例如經(jīng)由通道與用于接收樣品例如精子樣品的接收小室（receiving well)流體連通。
[0024] 因此，所述系統(tǒng)和方法改善了樣品中運(yùn)動(dòng)細(xì)胞與非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的分離，然后可W在 分析室中定量所述運(yùn)動(dòng)細(xì)胞。當(dāng)通過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器將樣品應(yīng)用隔室與調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔 室分開時(shí)，樣品液體與調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的混合被最小化。本發(fā)明人認(rèn)為，雖然細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾 器的應(yīng)用不能完全防止例如非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞從樣品應(yīng)用側(cè)對(duì)流傳遞到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基側(cè)，但是他們 已經(jīng)在根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)中（即當(dāng)樣品應(yīng)用隔室在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室下方時(shí)）觀察到跨越細(xì) 胞可透過(guò)的過(guò)濾器的對(duì)流的顯著減少。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"對(duì)流"通常描述物質(zhì)的 任何被動(dòng)傳遞，例如順著液體流動(dòng)攜帶液體成分的情況。本發(fā)明人認(rèn)為，減少的對(duì)流W及擴(kuò) 散，可W至少部分地歸因于作用在樣品上的重力。目P，在所有粒子例如樣品中的細(xì)胞上施加 向下的力，從而限制在向上方向的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)。沒(méi)有辦法對(duì)抗重力的非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞較低程度地 通過(guò)對(duì)流和擴(kuò)散作用向上轉(zhuǎn)移穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器。另一方面，有辦法在樣品液體中 W任何給定的方向主動(dòng)自我轉(zhuǎn)移的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞可W容易地克服其上施加的重力，并且通過(guò)其 自身游動(dòng)轉(zhuǎn)移穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器。具體地，一旦運(yùn)動(dòng)細(xì)胞遇到細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器， 它們傾向于沿著所遇到的表面游動(dòng)，從而游動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器。因此，樣品在細(xì)胞 可透過(guò)的過(guò)濾器下方的位置在更大程度上確保細(xì)胞不會(huì)經(jīng)由對(duì)流從樣品應(yīng)用側(cè)被動(dòng)轉(zhuǎn)移 到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基側(cè)。因此，在根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)中分析精子樣品的過(guò)程中，存在于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 側(cè)的細(xì)胞會(huì)是已經(jīng)通過(guò)游動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器而橫穿其的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞。本系統(tǒng)的一個(gè) 另外的優(yōu)勢(shì)是與其中通過(guò)細(xì)胞在通道中的行進(jìn)距離來(lái)測(cè)量運(yùn)動(dòng)性的系統(tǒng)相比，運(yùn)動(dòng)細(xì)胞將 必須行進(jìn)的距離是短的。因此，較短的距離導(dǎo)致較短的實(shí)施分析所需的時(shí)間。
[00巧]本發(fā)明人進(jìn)一步觀察到，本發(fā)明的中型流體系統(tǒng)和方法還降低了調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室 中調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的污染。樣品例如精子樣品通常包括也可W穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器并進(jìn)入 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的另外的粒子、細(xì)胞和分子。但是，在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器下方應(yīng)用樣品還減少 了樣品的此類另外的成分的對(duì)流和擴(kuò)散，所述對(duì)流和擴(kuò)散另外可能降低后期調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi) 含物的分析的質(zhì)量。特別地，精子樣品例如樣品液體可能包含能對(duì)分析具有不利作用的酶， 因此從包含所述酶的樣品液體中分離運(yùn)動(dòng)細(xì)胞是特別有利的。
[00%] 因此，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如通過(guò)提供具有在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器下方的樣品 應(yīng)用隔室和在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器上方的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室的設(shè)備，將具有運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的樣品 應(yīng)用在細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器下方，使得由非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞W及樣品另外的污染性成分引起的調(diào) 節(jié)培養(yǎng)基的污染降低。應(yīng)確保只有運(yùn)動(dòng)細(xì)胞會(huì)進(jìn)入分析室，運(yùn)由此防止存在于樣品中的非 運(yùn)動(dòng)細(xì)胞、碎片和其它成分W假陽(yáng)性和/或假陰性貢獻(xiàn)的形式對(duì)測(cè)試結(jié)果具有不利影響。
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室還包括可W與外界環(huán)境流體連通的 培養(yǎng)基入口端口。培養(yǎng)基入口端口可W促進(jìn)液體的進(jìn)入，所述液體例如含有分析細(xì)胞所必 需的成分的樣品調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，并且此外，因?yàn)榕囵B(yǎng)基入口端口可W與外界環(huán)境流體連通，因 此它可W提供壓力釋放功能。培養(yǎng)基入口端口從而確保當(dāng)經(jīng)由分析室的離開端口施加負(fù)相 對(duì)壓力時(shí)或者當(dāng)經(jīng)由培養(yǎng)基入口端口施加正相對(duì)壓力時(shí)，樣品應(yīng)用隔室中的樣品不會(huì)主動(dòng) 地轉(zhuǎn)移穿過(guò)細(xì)胞可透過(guò)的過(guò)濾器并進(jìn)入調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室和/或分析室中，運(yùn)是因?yàn)榧?xì)胞可 透過(guò)的過(guò)濾器處的壓降比培養(yǎng)基入口端口處的壓降顯著更大。當(dāng)經(jīng)由分析室的進(jìn)入端口或 經(jīng)由培養(yǎng)基入口端口向調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室裝載液體時(shí)或從調(diào)節(jié)培養(yǎng)基隔室