專利名稱：消化道運動性病癥的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療例如腸易激綜合征(IBS)的消化道運動性病癥(gut motility disorder)的產(chǎn)品及其用途。
背景技術(shù)：
腸易激綜合征(IBQ是一種病因未知的常見胃腸道病癥。微生物群被認為在IBS 中起作用?；谂R床研究，本領(lǐng)域達成了共識并且制訂了對IBS癥狀進行分類的羅馬標準 (Rome Criteria)。所述標準強調(diào)腹部疼痛的存在以及疼痛與排便習(xí)慣的改變之間的關(guān)系。 腸易激綜合征是一種常見的腸道病癥，其特征是腹部疼痛和痙攣；腸道運動改變(腹瀉和/ 或便秘)；脹氣(gassiness)；胃氣脹；惡心；和其他癥狀。對于IBS，還沒有治愈的方法。該 病癥的許多方面都是未知的或者知之甚少；但是，飲食的改變、藥物和心理治療常能夠消除 或基本上減輕癥狀?？?cè)丝诘拇蠹s10-15%患有IBS，并且相對于男性而言，女性患IBS更 為常見，但其原因不明。治療腸易激綜合征(IBQ的一些可能的方法已有記載。US 2005/053641描述了纖維治療IBS的用途。WO 2005/0559 要求保護凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilus coagulans)治療IBS的用途。EP 1384483公開了益生菌通過改善消化道神經(jīng)肌肉功能來治療IBS的用途。WO 94/04136描述了具有陰離子結(jié)合特性的多糖治療IBS的用途。WO 2004/089115公開了益生菌和益生元的合生素(synbiotic)組合物及其治療 IBS的用途。Faber 在 American Journal of Gastroenterology, vol. 95, 2000, p2533 中分析 了 26名IBS患者的消化道菌群紊亂并且報道了糞便中的以下致病生物肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) (16/ )、費氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundi) (15/26)、銅 綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) (3/26)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) (3/26)以及酵母白色念珠菌(Candida albicans) (10/26)和光滑假絲酵母菌(Candida glabrata)(4/26)。McFarland et al. World J. Gastroenterol, vol 14,May 2008，pp2650_2661 描述 了對益生菌治療IBS的公開臨床試驗的統(tǒng)合分析(meta-analysis)。盡管在本領(lǐng)域已認識到細菌菌群可能是IBS的一個重要病因因素并因此是治療 IBS的很好的選擇，但是在文獻中沒有指出菌群的哪個組成成分造成了腸道運動性病癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人現(xiàn)在意外發(fā)現(xiàn)胃腸道中銅綠假單胞菌的存在與例如IBS的消化道運動 性病癥有關(guān)。鑒于此發(fā)現(xiàn)，對IBS的治療可以比以前更有針對性，因為所述治療可以是旨在 調(diào)節(jié)——尤其是減少——存在于消化道內(nèi)的銅綠假單胞菌的細菌數(shù)量。本文中調(diào)節(jié)或者減 少或降低銅綠假單胞菌的細菌數(shù)量也被稱作治療銅綠假單胞菌生長過度。
本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，IBS患者的小腸和糞便中的粘膜相關(guān)細菌 中的銅綠假單胞菌更為普遍并且量更多。此發(fā)現(xiàn)促使本發(fā)明人使用旨在降低并且優(yōu)選根除 小腸中的銅綠假單胞菌的特異性療法以治療IBS。一種調(diào)節(jié)(優(yōu)選在小腸中的)銅綠假單胞菌的數(shù)量的可能方法是使用特異性抗生 素。所述特異性抗生素優(yōu)選地旨在根除銅綠假單胞菌。另一種調(diào)節(jié)(優(yōu)選在小腸中的)銅綠假單胞菌的數(shù)量的可能方法是使用益生菌， 特別是用于減少和/或防止銅綠假單胞菌生長過度，特別是在小腸中，并因此用于治療患 有的消化道運動性病癥的患者，所述消化道運動性病癥具體地包括腸易激綜合征。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的包含益生菌的組合物可用來治療腸易激綜合征相關(guān) 的癥狀，包括腹瀉、(胃腸道)感染、急腹痛、腹部痙攣和腹部疼痛。具體地，本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)優(yōu)選地將選自如下的特異性益生菌用于治療消化道運 動性病癥發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum) (NumRes 4和NumRes 2)、干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei) (CRL-431)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animal is) (BB-12)、 長雙歧桿菌生物型 longum(Bifidobacterium longum biotype longum) (BB-536)、干酪乳 桿菌(DN-114001 = CNCM 1-1518)、動物雙歧桿菌(DN-173010 = CNCM 1-2494)、或其混合 物；因為這些選出的益生菌有特殊的有益性質(zhì)，例如對腸道襯細胞的粘附性強并且有較強 的抗假單胞菌活性。
具體實施例方式抗生素組合物抗生素可用于調(diào)節(jié)患者消化道中——特別是小腸中一一的銅綠假單胞菌的數(shù)目、 量或水平。因此，合適地講，包含一種或多種抗假單胞菌抗生素的組合物會對用于治療消化 道運動性病癥特別用于治療IBS的用途非常有益。在一個實施方案中，所述包含一種或多 種抗假單胞菌抗生素的組合物用于治療消化道運動性病癥患者的銅綠假單胞菌感染，優(yōu)選 用于治療IBS患者的銅綠假單胞菌感染。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療消化道運動性病癥的方法，并且優(yōu)選治 療IBS的方法，所述方法包括給予有需要的患者一種包含一種或多種抗假單胞菌抗生素的 組合物。也就是說，本發(fā)明涉及包含一種或多種抗假單胞菌抗生素的組合物用于制備用于 治療消化道病癥、優(yōu)選治療IBS的藥物的用途。本發(fā)明還可以被描述為用于治療消化道運 動性病癥、優(yōu)選用于治療IBS的包含一種或多種抗假單胞菌抗生素的組合物。用聯(lián)合療法治療假單胞菌生長過度是有利的。因此，在一個實施方案中，所述抗生 素組合物包含一種抗假單胞菌β -內(nèi)酰胺和一種氨基糖苷或氟喹諾酮(fluoroquinolone) 的結(jié)合物?；蛘撸环N優(yōu)選的組合物包含選自以下物質(zhì)的抗生素碳青霉烯、氨基糖苷、 Cotr imox、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、或其混合物。益生菌組合物在另一種方法中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)益生菌可使腸粘膜的假單胞菌減少。因此，在一個 優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種治療消化道運動性病癥、優(yōu)選治療IBS的方法，所述方 法包括給予有需要的患者一種包含一種或多種益生菌的組合物。也就是說，本發(fā)明涉及包含益生菌的組合物用于制備一種用于治療消化道運動性病癥——優(yōu)選治療IBS——的組合 物——優(yōu)選營養(yǎng)組合物——的用途。本發(fā)明還可以被描述為一種用于治療消化道運動性病 癥(優(yōu)選用于治療IBS)的包含益生菌的組合物，優(yōu)選營養(yǎng)組合物。在一個具體的實施方案 中，本發(fā)明涉及用益生菌組合物治療消化道運動性病癥患者中的銅綠假單胞菌生長過度。 所述消化道運動性病癥優(yōu)選為IBS。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用益生菌組合物治療消 化道運動性病癥患者中的銅綠假單胞菌感染，優(yōu)選治療IBS患者的銅綠假單胞菌感染。通常小腸細菌生長過度(SIBO)是指一種如下所述的病癥——在該病癥中，小腸中 出現(xiàn)異常大量的細菌，每ml小腸流體有至少100，000個細菌，并且該小腸中的細菌類型更 像結(jié)腸中的細菌而不是小腸中的細菌。銅綠假單胞菌生長過度可通過在本文實施例1中公開的方法確定。銅綠假單胞菌 生長過度被定義為小腸中的銅綠假單胞菌的細菌載量比健康受試者——特別是未被診斷 為患有IBS的健康受試者——中的銅綠假單胞菌平均細菌載量高。銅綠假單胞菌生長過度 優(yōu)選地被定義為在受試者小腸內(nèi)，銅綠假單胞菌的細菌載量為至少2%，優(yōu)選銅綠假單胞 菌的細菌載量為至少5 %。銅綠假單胞菌生長過度的治療是指，與攝取所述抗生素或益生菌 組合物之前的銅綠假單胞菌的細菌載量相比，在攝取所述抗生素或益生菌組合物后銅綠假 單胞菌的細菌載量下降。治療優(yōu)選地是指銅綠假單胞菌的細菌載量減少至低于5 %的值，優(yōu) 選減少至低于2%的值，更優(yōu)選減少至低于健康受試者——特別是未被診斷患有IBS的健 康受試者——中的平均細菌載量。實際上，這是指若例如通過實施例1中描述的PCR方法 可測出小腸中或糞便中的銅綠假單胞菌，則存在銅綠假單胞菌生長過度，而治療則是指糞 便和/或粘膜中的細菌載量減少至幾乎檢測不到的水平。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種治療IBS患者的腹瀉、感染(優(yōu)選胃腸道 感染)、急腹痛、腹部痙攣和/或腹部疼痛的方法，所述方法包括給予有需要的患者一種包 含一種或多種益生菌的組合物。也就是說，本發(fā)明涉及包含益生菌的組合物用于制備治療 IBS患者的腹瀉、感染(優(yōu)選胃腸道感染)、急腹痛、腹部痙攣和/或腹部疼痛的組合物(優(yōu) 選營養(yǎng)組合物)的用途。本發(fā)明還能被描述為一種用于治療IBS患者的腹瀉、感染(優(yōu)選 胃腸道感染)、急腹痛、腹部痙攣和/或腹部疼痛的包含益生菌的組合物，優(yōu)選營養(yǎng)組合物。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)各種益生菌并非同樣地適合治療患有例如IBS的腸道運動性 病癥的患者的假單胞菌生長過度。發(fā)現(xiàn)(參見表1)發(fā)酵乳桿菌NumRes 4、發(fā)酵乳桿菌 NumRes 2、動物雙歧桿菌BB-12和長雙歧桿菌生物型longum BB-536是假單胞菌粘附小腸 細胞的強抑制劑。因此，用于治療IBS患者的銅綠假單胞菌生長過度和IBS患者的腹瀉、感 染(優(yōu)選胃腸道感染、急腹痛、腹部痙攣和/或腹部疼痛的一種優(yōu)選的組合物包含發(fā)酵乳 桿菌(NumRes 4)、發(fā)酵乳桿菌(NumRes 2)、動物雙歧桿菌(BB-12)、長雙歧桿菌(BB-536)、 或其混合物。從丹麥的Chr. Hansen可獲得動物雙歧桿菌(BB-U)，從日本的Morinaga 可獲得長雙歧桿菌(BB-536)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含發(fā)酵乳桿菌NumRes 4(LMG-P-24701)、發(fā)酵乳桿菌NumRes 2 (LMG-P-24701)、動物雙歧桿菌BB-12、或其混合物 的組合物用于制備治療腸易激綜合征的組合物的用途。干酪乳桿菌CRL-431由于顯示出對小腸細胞良好的粘附性(Morata et al. (1999) J Food Prot 62:1430-1434)以及顯示出能夠在鼠中防止假單胞菌感染(Alvarez et al. (2001)J Food Prot 64:1768-1774)而同樣是良好的候選者。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的益生菌組合物包含干酪乳桿菌(CRL-431)。從丹麥的Chr. Hansen可獲得干 酪乳桿菌CRL-431。同樣地，由于其有益活性，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的益生菌組合 物包含干酪乳桿菌(DN-114001 = CNCMI-1518)和/或動物雙歧桿菌(DN-173010 = CNCM 1-2494)。這兩種細菌已顯示具有非常好的益生菌特性，例如在新鮮乳制品中的穩(wěn)定性和腸 道定居。申請人:已根據(jù)布達佩斯條約于2008年7月8日將發(fā)酵乳桿菌 NumRes 4和發(fā)酵乳桿菌NumRes 2保藏于BCCM (比利時微生物協(xié)作保藏中 心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms), Laboratorium voor Microbiologie- Bacterienverzameling (LMG) , University of Gent, K. L. Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent, Belgium)。NumRes 4 的 BCCM 保藏號為 LMG-P-24701。NumRes 2的BCCM保藏號為LMG-24700。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及 BCCM保藏號為LMG-P-24701的發(fā)酵乳桿菌NumRes 4。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及BCCM 保藏號為LMG-P-24700的發(fā)酵乳桿菌NumRes 2。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及NumRes 4(LMG-24701)用作藥物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及NumRes 2 (LMG-24700)用作藥物。營養(yǎng)組合物在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物——特別是所述益生菌組合物——是營 養(yǎng)組合物。營養(yǎng)組合物優(yōu)選包含至少一種、優(yōu)選至少兩種、更優(yōu)選至少三種選自蛋白質(zhì)、脂 肪和可消化性碳水化合物的常量營養(yǎng)物。在一個有利實施方案中，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物包 含非可消化性碳水化合物，下文也稱作膳食纖維。MM在一個實施方案中，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物包含脂肪。Y-亞油酸(GLA)對消化系統(tǒng) 以及肝和脾運作有刺激作用。因此，本發(fā)明組合物的一個優(yōu)選實施方案含有GLA源。源自 月見草種子的月見草油是天然植物油，是GLA的合適來源。組合物中脂肪過多可引起使IBS癥狀增加的消化問題。因此，本發(fā)明的組合物優(yōu) 選地脂肪含量低，以組合物總重量計，優(yōu)選包含少于3重量％的脂肪，優(yōu)選為0. 1至3重 量％并且甚至更優(yōu)選為0. 1至1重量％的脂肪。蛋白質(zhì)和可消化性碳水化合物在一個實施方案中，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物包含蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明 的營養(yǎng)組合物包含可消化性碳水化合物。本發(fā)明的組合物有利地包含乳蛋白。很多IBS患 者不耐受乳糖，這些IBS患者將從乳糖含量低的飲食中大大地受益。因此本發(fā)明的組合物 優(yōu)選包含乳糖含量低或者甚至優(yōu)選無乳糖的乳蛋白質(zhì)源?；蛘撸墒褂脕碜苑侨樵蠢绱?豆的蛋白源。除了乳糖，本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含選自蔗糖、葡萄糖、果糖、固態(tài)玉米糖漿、 淀粉和麥芽糊精的可消化性碳水化合物。本發(fā)明有利地提供了一種組合物，其中脂肪提供0. 5至15%的總卡路里，蛋白質(zhì) 提供5至50%的總卡路里，可消化性碳水化合物組分提供15至90%的總卡路里。膳食纖維在一個實施方案中，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物包含膳食纖維。膳食纖維具有減輕IBS 癥狀的有益效果。當在本說明書中使用術(shù)語“膳食纖維”時，這是意指包括非可消化性寡糖 和非可消化性多糖，但不是單糖和二糖。本發(fā)明中使用的膳食纖維通常難以在人小腸中消
6化和吸收而優(yōu)先在大腸中被完全或部分地發(fā)酵。本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含至少一種選自 如下的膳食纖維包括反式半乳寡糖在內(nèi)(TOS)的半乳寡糖(GOS)、菊糖、包括長鏈低聚果 糖(IcFOQ和短鏈低聚果糖(scFOS)、及其混合物在內(nèi)的低聚果糖(F0S)、低聚木糖、帕拉 ^ !! (palatinoseoligosaccharide)(soybean oligosaccharide)
(gentiooligosaccharide)、果膠、果膠酸鹽、藻酸鹽、軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素(h印arine)、 類肝素(h印arane)、唾液酸聚糖(sialoglycan)、巖藻聚糖、巖藻寡糖、角叉菜聚糖、黃原 膠、纖維素、聚葡萄糖(PDX，由隨機交聯(lián)的葡萄糖和山梨糖醇合成的非可消化性碳水化合 物)、瓜爾膠、優(yōu)選為US 5，560，914的MGN-3米糠阿拉伯木聚糖化合物(MGN_3Rice Bran Arabinoxylan Compound)的阿拉伯木聚糖、木聚糖、愈創(chuàng)葡聚糖、木質(zhì)素和/或它們的降解 產(chǎn)物。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少兩種不同的選自如下的膳食纖 維包括反式半乳寡糖在內(nèi)的半乳寡糖、菊糖、低聚果糖、低聚木糖、帕拉金寡糖、抗性 淀粉(resistant starch)、乳果糖、乳果寡糖(Iactosucrose)、甘露寡糖、異麥芽寡糖 (isomaltooligosaccharide)、麥芽寡糖(maltooligosaccharide)、葡甘露聚糖、阿拉伯半 乳聚糖、大豆寡糖、龍膽寡糖、果膠、果膠酸鹽、軟骨素、透明質(zhì)酸、唾液酸聚糖、巖藻寡糖、黃 原膠、聚葡萄糖(PDX)、半乳甘露聚糖和瓜爾膠、阿拉伯木聚糖(優(yōu)選MGN-3米糠阿拉伯木聚 糖)、木聚糖、愈創(chuàng)葡聚糖和/或它們的降解產(chǎn)物，其中至少一種選自半乳寡糖(包括反式半 乳寡糖)、菊糖、低聚果糖、低聚木糖、帕拉金寡糖、抗性淀粉、乳果糖、乳果寡糖、甘露寡糖、 異麥芽寡糖、麥芽寡糖、葡甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、龍膽寡糖、黃原膠、阿拉伯木聚糖、聚 葡萄糖(PDX)、半乳甘露聚糖、瓜爾膠和/或它們的降解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包括至少三種選自如下的膳食纖維包括 反式半乳寡糖在內(nèi)的半乳寡糖、菊糖、低聚果糖、低聚木糖、帕拉金寡糖、抗性淀粉、乳果糖、 乳果寡糖、甘露寡糖、異麥芽寡糖、麥芽寡糖、葡甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、大豆寡糖、龍膽 寡糖、果膠、果膠酸鹽、軟骨素、透明質(zhì)酸、唾液酸聚糖、巖藻寡糖、黃原膠、聚葡萄糖(PDX)、 半乳甘露聚糖和瓜爾膠、阿拉伯木聚糖(優(yōu)選MGN-3米糠阿拉伯木聚糖)、木聚糖、愈創(chuàng)葡聚 糖和/或它們的降解產(chǎn)物，其中至少兩種選自包括反式半乳寡糖在內(nèi)的半乳寡糖、菊糖、 低聚果糖、低聚木糖、帕拉金寡糖、抗性淀粉、乳果糖、乳果寡糖、甘露寡糖、異麥芽寡糖、麥 芽寡糖、葡甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、龍膽寡糖、黃原膠、阿拉伯木聚糖、聚葡萄糖(PDX)、 半乳甘露聚糖、瓜爾膠和/或它們的降解產(chǎn)物，并且第三種是選自如下的酸性寡糖膳食纖 維果膠、果膠酸鹽、軟骨素、透明質(zhì)酸、唾液酸聚糖和巖藻寡糖和/或它們的降解產(chǎn)物。意外的是，纖維的某些組合顯示出更好的抗粘附活性。包括反式半乳寡糖(TOS) 在內(nèi)的半乳寡糖(GOS)、包括長鏈低聚果糖(IcFOQ和短鏈低聚果糖(scFOQ在內(nèi)的低聚 果糖(F0Q的組合形式以及幾種與酸性寡糖(例如果膠水解產(chǎn)物)組合的形式都比單個的 纖維效果更好，所述IcFOS被定義為由10個或更多單糖組成，并且所述scFOS被定義為由 2至10個單糖組成。因此，本發(fā)明組合物的施用可用于達到一種或多種以下生理效應(yīng)雙歧桿菌和/ 或乳酸細菌顯著增加；乳酸顯著增加和/或總的SCFA顯著增加；乙酸鹽相對量顯著增加； 丁酸鹽相對量顯著下降；異丁酸鹽、戊酸鹽和異戊酸鹽的總量顯著下降；氣體形成減少；發(fā) 酵(包括在結(jié)腸的最遠端部分的發(fā)酵)時間更長更平穩(wěn)，并且在結(jié)腸的最近端發(fā)酵高。
此外可加入碳酸鈣以防止氣體形成。因此，優(yōu)選的組合物包括與碳酸鈣聯(lián)用的膳 食纖維。本發(fā)明的膳食纖維可有利地在治療和/或預(yù)防銅綠假單胞菌生長過度、腹瀉、 (胃腸道)感染、急腹痛、腹部痙攣、腹部疼痛和腸易激綜合征的方法中與選自如下的益生 菌聯(lián)合使用發(fā)酵乳桿菌(NumRes 4)、發(fā)酵乳桿菌(NumRes 2)、動物雙歧桿菌(BB-12)、干 酪乳桿菌(CRL-431)、長雙歧桿菌(BB-536)、干酪乳桿菌(DN-114 001)和動物雙歧桿菌 (DN-173010)。發(fā)酵乳產(chǎn)品在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物是發(fā)酵乳產(chǎn)品的形式。在一個優(yōu)選 實施方案中，所述發(fā)酵乳產(chǎn)品是通過將葡萄糖(源自乳中的乳糖水解)發(fā)酵為乳酸而得 的凝結(jié)乳產(chǎn)品，由此得到一種發(fā)酵乳產(chǎn)品，例如酸奶，所述葡萄糖到乳酸的發(fā)酵優(yōu)選地通 過保加利亞乳桿菌(LactcAacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌——優(yōu)選還與長雙歧桿菌 (BB-536)和/或動物雙歧桿菌(BB-12)結(jié)合——來實現(xiàn)。此外，上述益生菌和益生元的任 何一種都可加入到這樣的發(fā)酵乳產(chǎn)品中以治療銅綠假單胞菌生長過度和/或IBS患者的感染。在本文及其權(quán)利要求書中，動詞“包含”及其變形以其非限制性的含義使用，意指 其后的條目是被包含在內(nèi)的，但是并不排除未特地提出的條目。此外，提及要素時使用的不 定冠詞“一個(種)”并不排除存在多于一個(種)要素的可能性，除非上下文明確地要求 有且只有一個(種)所述要素。因此不定冠詞“一個(種)”通常是指“至少一個(種)”。實施例實施例1IBS患者的腸內(nèi)和糞便樣本中銅綠假單胞菌增加方法取樣、制備和保存使裝在無菌導(dǎo)管中的無菌細胞刷(Uno-Brush，Prince Medical, Ercuis, France) 穿過內(nèi)窺鏡活組織檢查通道并直視向前推進至內(nèi)窺鏡末端外。將十二指腸粘膜刷3次以得 到粘膜相關(guān)細菌。從每位受試者的十二指腸的降部和水平部得到其細胞刷樣本。刷完后， 將所述細胞刷拉回至導(dǎo)管鞘中，將所述導(dǎo)管取出并且立即將細胞刷與導(dǎo)管分開并將細胞刷 放在無菌管內(nèi)置于液氮中，保存在-80°C直至分析。在內(nèi)窺鏡檢查前取糞便樣本。糞便樣本保存在受試者的家用冰箱中，在臨進行內(nèi) 窺鏡檢查前收集并且保存在-80°C直至分析。在微生物學(xué)分析前，糞便和細胞刷樣本都保存 在干冰中。DNA提取和PCR擴增將所述冷凍的糞便解凍并且使用i^ast DNA Spin kit試劑盒(Qbiogene，Irvine， USA)從0.5g糞便材料中提取DNA。將所述冷凍的細胞刷樣本解凍，用180 μ 1 ATL緩沖液 懸浮并且將其劇烈地渦旋震蕩來提取粘附的細菌。隨后，使用組織DNA酶試劑盒Oiiagen， Venlo，荷蘭)依照制造商的說明書從粘膜相關(guān)細菌中分離DNA。將從糞便和細胞刷中分離 到的DNA的溶液都保存在_20°C。將提取到的DNA 用作模板，用 Muyzer G et al. ,Appl Environ Microbiol 1993 ；59(3) :695-700 禾口 Muyzer and Smalla, Antonie Van Leeuwenhoek 1998 ；73(1) :127-141 中描述的引物U968-GC-f和U1401-r來擴增16S rRNA的V6至V8區(qū)。用來自hvitrogen的 Taq DNA聚合酶試劑盒(Invitrogen，Paisley，UK)進行PCR。反應(yīng)混合物由5μ1 IOXPCR 緩沖液、50mM MgCl2JOyM三磷酸脫氧核苷酸、1.25U Taq聚合酶、各IOpmol的每種引物 和1 μ 1適當稀釋的模板DNA組成，終體積為50 μ 1。在PTC-200PCR系統(tǒng)(MJ-Research， Waltham, USA)中對樣本進行擴增，熱循環(huán)程序如下94°C 5分鐘；10個循環(huán)的94°C變性1 分鐘、65-56°C的溫度退火1分鐘(每個循環(huán)降1°C )、68°C延伸3分鐘；33個循環(huán)的94°C 1 分鐘、56°C 1分鐘和68°C 3分鐘。在含有溴化乙錠的1. 5% (重量/體積)的瓊脂糖凝膠 上通過電泳對5 μ 1等分試樣的PCR產(chǎn)物進行分析。
PCR擴增子的DGGE分析 通過基于Muyzer and Smalla (同上)的方法的DGGE用DGGE解碼系統(tǒng)(DGGE Decode system) (Bio-Rad Laboratories,Hercules,California,USA)分離 PCR 擴增子，但 有以下修改。聚丙烯酰胺凝膠由8% (體積/體積)的聚丙烯酰胺(丙烯酰胺和二丙烯酰 胺的比率；37. 5 1)和0. 5XTris-乙酸-EDTA(pH 8. 0) (TAE)緩沖液組成。100%變性丙 烯酰胺被限定為7M脲和40%甲酰胺。所述聚丙酰胺凝膠是以32. 5至72. 5%的變性梯度制 備的° 使用梯度標記禾口泵(Econo 梯度泵；Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)以;3ml/min的速度從頂部傾倒所述凝膠。在變性凝膠(梯度體積，28ml)聚合之前 加入7.5ml的不含變性化學(xué)物質(zhì)的積層凝膠，然后插入合適的梳子。在60°C的恒溫下于 0. 5 X TAE緩沖液中，電泳首先在200V下進行5分鐘，然后在80V下進行17個小時。用AgNO3 將所述凝膠染色并在50°C下干燥過夜。DGGE圖譜的分析和合并圖譜(pooled profile)的產(chǎn)生使用標準參照對凝膠圖譜進行標準化。由于DGGE凝膠是在相似的變性和電泳條 件下進行的，所以此標準化步驟使得能夠比較不同凝膠的DGGE圖譜。使用GelCompar軟件 (Applied Maths，Kortri jk，比利時)基于凝膠上的條帶強度和位置分別在平均IBS指紋和 平均健康受試者指紋中合并來自IBS患者和健康受試者的DGGE圖譜。檢測這些平均圖譜 中的條帶差異，將在平均IBS和健康圖譜中不相同的條帶在個體DGGE圖譜中定位。將個體 圖譜中最強的條帶從原始凝膠中切下。將這些條帶的DNA用于第二次DGGE分析，其中使用 46-51. 6%梯度。對目的條帶進行如下所述的測序。來自DGGE條帶的DNA的克隆和測序為鑒定與條帶相關(guān)的細菌，用無菌解剖刀將選定條帶的中間部分從DGGE凝膠上 切下來，然后在4°C下在50 μ 1無菌Milli-Q中孵育M小時以使其擴散。將含有DNA片段 的洗脫液用于PCR再擴增，使用與先前同樣的引物。為檢查在首次DGGE凝膠上的目的DNA 和再擴增的DNA是否遷移至同一位置，進行了第二次DGGE，以比較兩個樣本。當所述兩條 帶共遷移時，用GenElute PCR DNA純化試劑盒(Sigma，Zwi jndrecht，荷蘭)將DNA片段 純化，然后將其連接到pCR ‘2. 1-T0P0 載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌One Shot T0P10感受 態(tài)細胞(Invitrogen, Paisley, UK)中。用Qiagen中型的質(zhì)粒純化試劑盒(Plasmid Midi Purification Kit) (Qiagen, Venlo，荷蘭)提取來自卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子集落的質(zhì)粒。用 M13正向和反向引物以及968f和140Ir引物進行PCR以篩選插入物大小正確的提取質(zhì)粒。 對選出的轉(zhuǎn)化子的插入PCR擴增子進行純化并進行DNA序列分析(Baseclear，Leiden,荷蘭)。用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)中的基本局部比對搜索工具 (BLAST)檢查克隆的序列相似性。實時定量PCR分析進行實時定量PCR(q-PCR)以測定細胞刷和糞便樣本中的銅綠假單胞菌的百分 比。將如Pirnay et al.，Crit Care 2000 ；4(4) :255-261所描述的方法略作改動檢測銅 綠假單胞菌。將熒光標記從LC Red 640變?yōu)?FAM并且從熒光素變?yōu)門AMRA，而所述q-PCR 的其他組分和條件保持不變。在 ABI 7900HT Fast (Applied Biosystems，Nieuwerkerk aan de IJssel，荷蘭)上檢測退火階段的熒光信號。如Nadkarni et al. Microbiology 2002 ； 148 (Pt 1) :257-266所描述檢測總細菌載量。然后根據(jù)Liu et al. Biochem Biophys Res Commun 2002 ；294 (2) :347-353 和 Anal Biochem 2002 ；302(1) :52-59 計算銅綠假單胞菌 的相對百分比。分別計算每個擴增曲線的效能并將其用于確定DNA的初始量。最后，將得 到的DNA初始量之間的比率相對同一物質(zhì)的單一培養(yǎng)物(設(shè)為100% )標準化。統(tǒng)計學(xué)分析用GelCompar II軟件(Applied Maths,比利時)分析DGGE數(shù)據(jù)。用皮爾遜積矩 相關(guān)分析(Pearson product-moment correlation)禾口非力口權(quán)組平均法(unweighted-pair group method using arithmetic averages) (UPGMA)進 亍不同條帶模式之間的聚類分析禾口 相似性指數(shù)的計算。用獨立樣本t檢驗分析IBS患者和健康受試者的銅綠假單胞菌水平。用單因 素方差分析分析IBS亞群的銅綠假單胞菌水平，其中使用邦弗朗尼校正(Bonferroni correction)。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM0用Windows下的SPSS 12. 0. 1進行分析。結(jié)果DGGE凝膠在兩組的小腸樣本中78. 2%相同而在糞便樣本中86. 25%相同。僅限于 IBS的小腸和糞便條帶的克隆主要被鑒別為假單胞菌種，其中銅綠假單胞菌是主要的種。IBS患者的小腸中的銅綠假單胞菌占總細菌載量的百分比顯著高于 (8. 3士0.950 % )健康受試者中的(0. 1 士0.069 % ) (P < 0.001)。IBS患者的糞便中 的銅綠假單胞菌占總細菌載量的百分比也顯著高于(2. 34士0.31% )健康受試者中的 (0. 003士0. 0027% ) (P < 0. 001)。結(jié)論結(jié)果顯示銅綠假單胞菌在IBS患者的粘膜相關(guān)小腸和糞便樣本中增加，清楚地表 明銅綠假單胞菌在IBS病理生理學(xué)中有作用。實施例2選擇最佳抑制銅綠假單胞菌對人小腸細胞(Caco-幻的粘附的益生菌菌株方法在37°C下在(X)2培養(yǎng)箱中在M孔板中使Caco-2細胞在有20% FCS (小牛血清) 的MEM+培養(yǎng)基中生長2周，直至形成單層細胞。MEM+培養(yǎng)基包含MEM(Gibco 10938)，并補 充有IOmM丙酮酸鈉、IX非必須氨基酸(Gibco 11130-36)和100U青霉素-100 μ g鏈霉素 (penstrep ；Gibco 15140-130)。在實驗前1天將所述培養(yǎng)基更換為含有10% FCS的MEM+ 培養(yǎng)基(無青鏈霉素)，并且在實驗前1小時將所述培養(yǎng)基更換為含有1 % FCS的MEM+培 養(yǎng)基(無青鏈霉素)。將在TSB肉湯中的銅綠假單胞菌P112和在rMRS肉湯中的乳酸細菌的過夜培養(yǎng)物在PBS中洗滌一次，顯微鏡計數(shù)并在Caco-2細胞培養(yǎng)物中分別地稀釋為 2X10E8CFU/ml和1X10E9 CFU/ml的儲液。將所述P112儲用培養(yǎng)物也以適當?shù)南♂尪冉?種在NA-瓊脂上。將250 μ 1 Caco-2儲用培養(yǎng)物與250 μ 1乳酸細菌儲液混合。之后加入 250 μ 1 Ρ112培養(yǎng)物并且將所得混合物在37°C下在(X)2培養(yǎng)箱中孵育lh。將Caco-2與不 加乳酸細菌的P112孵育作為陰性對照。孵育后將所述細胞在PBS中洗滌3次以除去未粘 附的細菌。加入蒸餾水以使細菌分離并裂解Caco-2細胞。然后將樣本以適當?shù)南♂尪冉?種于NA-瓊脂上以測定P112活菌計數(shù)并計算粘附的細菌的百分比。結(jié)果通過使用Caco-2細胞進行體外實驗來測定益生菌菌株對銅綠假單胞菌在小腸細 胞上的粘附的影響。在這些實驗中使用了臨床分離菌株(AZU R87》銅綠假單胞菌菌株 P112。Caco-2細胞是能夠表達成熟腸細胞的分化特征的人結(jié)腸腺癌細胞，因此它是用于與 腸細胞功能相關(guān)的研究的有價值的體外工具。Caco-2細胞與Pl 12和長雙歧桿菌BB-536的 共孵育顯示出抑制61 %的銅綠假單胞菌對細胞的粘附。其他乳酸細菌菌株也抑制假單胞菌 的粘附但是抑制程度較低。所得結(jié)果也總結(jié)在表1中。這些結(jié)果顯示，長雙歧桿菌BB-536 能夠抑制銅綠假單胞菌在腸上段定居。表1 對銅綠假單胞菌在與各種乳酸細菌菌株共孵育的Caco-2細胞單層上的粘附
的抑制(％ )
權(quán)利要求
1.一種包含益生菌的組合物，用于治療消化道運動性病癥患者的銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)生長過度。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述消化道運動性病癥是腸易激綜合征。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述益生菌選自發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum)NumRes 4(LMG-P_24701)、發(fā)酵乳桿菌 NumRes 2 (LMG-P-24700)、干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)CRL-431、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)BB-12、 長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) BB-536、干酪乳桿菌DN-114001、動物雙歧桿菌 DN-173010、或其混合物。
4.權(quán)利要求1-3任一項的組合物，用于治療腸易激綜合征患者的腹瀉、感染、急腹痛、 腹部痙攣和/或腹部疼痛，其中所述益生菌選自發(fā)酵乳桿菌NumRes 4 (LMG-P-24701)、發(fā) 酵乳桿菌NumRes 2 (LMG-P-24700)、干酪乳桿菌CRL-431、動物雙歧桿菌BB-12、長雙歧桿菌 BB-536、干酪乳桿菌DN-114001、動物雙歧桿菌DN-173010、或其混合物。
5.權(quán)利要求1-4任一項的組合物，其中所述益生菌選自發(fā)酵乳桿菌NumRes 4 (LMG-P-24701)、發(fā)酵乳桿菌NumRes 2 (LMG-P-24701)、動物雙歧桿菌BB-12、或其混合物。
6.權(quán)利要求1-5任一項的組合物，還包括膳食纖維。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述膳食纖維選自半乳寡糖(G0S)、反式半乳寡糖(T0S)、 低聚果糖(F0Q和果膠水解產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求1-7任一項的組合物，還包括蛋白質(zhì)、可消化性碳水化合物和脂肪，其中存 在的所述脂肪為所述組合物的0. 1至3重量％。
9.權(quán)利要求1-7任一項的組合物，所述組合物為一種發(fā)酵乳產(chǎn)品。
10.BCCM編號為LMG-P-24701的發(fā)酵乳桿菌NumRes 4。
11.BCCM編號為LMG-P-24700的發(fā)酵乳桿菌NumRes 2。
12.包含發(fā)酵乳桿菌NumRes 4 (LMG-P-24701)、發(fā)酵乳桿菌 NumRes 2 (LMG-P-24701)、 動物雙歧桿菌BB-12、或其混合物的組合物用于制備一種治療腸易激綜合征的營養(yǎng)組合物 的用途。
13.一種用于治療消化道運動性病癥的組合物，所述組合物包含一種或多種抗假單胞 菌抗生素。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述消化道運動性病癥是腸易激綜合征(IBS)。
15.權(quán)利要求13或14的組合物，其中所述一種或多種抗生素是一種抗假單胞菌β-內(nèi) 酰胺和一種氨基糖苷或氟喹諾酮的結(jié)合物。
16.權(quán)利要求13或14的組合物，其中所述一種或多種抗生素選自碳青霉烯、氨基糖苷、 Cotrimox、環(huán)丙沙星和諾氟沙星。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含抗生素或益生菌的產(chǎn)品及其用于治療例如腸易激綜合征(IBS)的消化道運動性病癥的用途。
文檔編號A23L1/30GK102123718SQ200980131977
公開日2011年7月13日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月15日
發(fā)明者J·科諾爾, K·本阿默, R·D·文德 申請人:N.V.努特里奇亞