本發(fā)明涉及以納米氧化銅作為模擬堿性過氧化物酶，在堿性條件下催化過氧化氫氧化對(duì)羥基苯丙酸，形成穩(wěn)定的二聚體熒光產(chǎn)物，測(cè)定過氧化氫的熒光分析方法，屬于分析化學(xué)和納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

天然酶作為生物催化劑，因其催化效率高、專一性強(qiáng)。反應(yīng)條件溫和而受到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等生命活動(dòng)有著密切的聯(lián)系。但由于天然酶的制備和純化成本高、操作繁瑣，價(jià)格昂貴，并且容易受到各種物理、化學(xué)因素的影響而失去活性，使其實(shí)際應(yīng)用受到極大限制。納米人工模擬酶相較于天然酶在高溫、極端pH、高鹽濃度等惡劣環(huán)境下依然能保持良好的催化活性，并且具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、易于大規(guī)模制備以及可調(diào)催化活性等優(yōu)點(diǎn)，使納米人工模擬酶成為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的有前景的工具。

過氧化物酶是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，在許多生物系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，并且是生物分析和臨床化學(xué)中的重要工具。過氧化氫是生化反應(yīng)中重要的中間產(chǎn)物，所以對(duì)過氧化氫及其相關(guān)物質(zhì)的精確測(cè)定具有重要意義。天然過氧化物酶及其模擬物通常在酸性或中性條件下發(fā)揮最佳性能。然而，在堿性條件下進(jìn)行的研究很少。因此，堿性過氧化物酶模擬物的發(fā)現(xiàn)對(duì)于實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

本發(fā)明基于納米氧化銅作為模擬堿性過氧化物酶，在堿性條件下催化過氧化氫氧化對(duì)羥基苯丙酸產(chǎn)生二聚體熒光產(chǎn)物，提供一種以納米氧化銅為催化劑測(cè)定過氧化氫的熒光分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是基于納米氧化銅作為模擬堿性過氧化物酶，在堿性條件下催化過氧化氫氧化對(duì)羥基苯丙酸產(chǎn)生二聚體熒光產(chǎn)物，提供一種以納米氧化銅為催化劑測(cè)定過氧化氫的熒光分析方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：所述一種納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶，其特征是納米氧化銅在堿性條件下催化過氧化氫氧化對(duì)羥基苯丙酸作為模擬堿性過氧化物酶；所述的納米氧化銅由如下步驟制得：1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

所述的一種納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶，其特征是將對(duì)羥基苯丙酸、過氧化氫、納米氧化銅溶液和磷酸鹽緩沖液四者混合溫浴反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物具有熒光，最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為320 nm和409 nm。

納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶最佳活性pH值為10.1~10.3。

納米氧化銅對(duì)底物對(duì)羥基苯丙酸的米氏常數(shù)為0.68 mmol/L，對(duì)底物過氧化氫的米氏常數(shù)為5.4 mmol/L。

本發(fā)明基于納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶測(cè)定過氧化氫的熒光分析方法，其特征是將對(duì)羥基苯丙酸、過氧化氫、納米氧化銅溶液和磷酸鹽緩沖液四者混合溫浴反應(yīng)，測(cè)定熒光強(qiáng)度。

上述的納米氧化銅由如下步驟制得：1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

所述的一種基于納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶測(cè)定過氧化氫的熒光分析方法，其特征是將50 μL不同濃度的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對(duì)羥基苯丙酸，200 μL濃度為2mg/L的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L、pH為10.25的磷酸鹽緩沖溶液中，混合液在65 ℃溫浴，45分鐘后分別測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm，以熒光強(qiáng)度對(duì)過氧化氫濃度作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

熒光強(qiáng)度與過氧化氫濃度在0.05~0.4 mmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.81 μmol/L。

所述的熒光反應(yīng)體系的pH值優(yōu)選為10.25，氧化銅濃度優(yōu)選為0.4mg/L，對(duì)羥基苯丙酸濃度優(yōu)選為4mmol/L。

所述的熒光反應(yīng)溫度優(yōu)選為65℃，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為45分鐘。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體步驟如下：

（一）納米氧化銅的制備：

取醋酸銅溶液和冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰，快速加入氫氧化鈉溶液，加完后，繼續(xù)攪拌后，得到黑色氧化銅。將反應(yīng)得到的黑色氧化銅立即離心，用無水乙醇洗滌，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。將納米氧化銅粉體分散于二次蒸餾水中得到棕色納米氧化銅膠體溶液。

納米氧化銅具體制備步驟如下：

（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；

（2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；

（3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

（二）過氧化氫的測(cè)定

在EP管中依次加入過氧化氫溶液、對(duì)羥基苯丙酸、納米氧化銅、磷酸鹽緩沖液，將混合液放入65 ℃水浴。45分鐘后測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)過氧化氫濃度作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線以用于測(cè)定過氧化氫。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶，在堿性條件下催化過氧化氫氧化對(duì)羥基苯丙酸產(chǎn)生二聚體熒光產(chǎn)物，納米氧化銅對(duì)底物對(duì)羥基苯丙酸的親和力高于辣根過氧化物酶。本發(fā)明納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶可用于過氧化氫的熒光分析，測(cè)定過氧化氫的線性范圍為0.05~0.4 mmol/L，其檢測(cè)限為0.81 μmol/L，具有靈敏度高，樣品需求量少，重現(xiàn)性好，成本低等優(yōu)點(diǎn)。。

附圖說明

圖1為反應(yīng)體系的熒光光譜圖。

圖2為pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖3為反應(yīng)溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖4為反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖5為納米氧化銅濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖6為對(duì)羥基苯丙酸濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖7為納米氧化銅對(duì)于對(duì)羥基苯丙酸的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線圖。

圖8為納米氧化銅對(duì)于過氧化氫的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線圖。

圖9為過氧化氫的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實(shí)例1：

納米氧化銅具體制備步驟如下：（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；（2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；（3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得直徑為6 nm的納米氧化銅粉體。

實(shí)例2：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對(duì)羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測(cè)定其熒光光譜。如圖1所示，熒光產(chǎn)物激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為409 nm。

實(shí)例3：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對(duì)羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L不同pH的磷酸鹽緩沖溶液（pH 9～11）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm）。如圖2所示，熒光強(qiáng)度在pH為10.1~10.3之間達(dá)到最大值。

實(shí)例4：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對(duì)羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于不同溫度水?。?5℃～85℃）溫浴，45分鐘后測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm）。如圖3所示，熒光強(qiáng)度在65℃時(shí)達(dá)到最大值。

實(shí)例5：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對(duì)羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，反應(yīng)不同時(shí)間（0~75分鐘）后測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm）。如圖4所示，熒光強(qiáng)度在45分鐘時(shí)達(dá)到最大值。

實(shí)例6：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對(duì)羥基苯丙酸和200 μL不同濃度的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液（0～5 mg/L）加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm）。如圖5所示，熒光強(qiáng)度隨混合液中納米氧化銅濃度增大而增大并在終濃度為0.4 mg/L時(shí)達(dá)到最大。

實(shí)例7：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL不同濃度的對(duì)羥基苯丙酸（0～80 mmol/L）和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm）。如圖6所示，熒光強(qiáng)度隨混合液中對(duì)羥基苯丙酸濃度增大而增大，在終濃度為3.5 mmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。

實(shí)例8：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL不同濃度的對(duì)羥基苯丙酸（0～60 mmol/L）和200 μL濃度為2 mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于37℃溫浴，1分鐘后測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm），計(jì)算初速度。通過米氏方程擬合，可以得出納米氧化銅對(duì)底物對(duì)羥基苯丙酸的米氏常數(shù)為0.68 mmol/L（見圖7）。

實(shí)例9：

將50 μL不同濃度的過氧化氫溶液（1～120 mmol/L），50 μL濃度為80 mmol/L的對(duì)羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于37℃溫浴，1分鐘后測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm），計(jì)算初速度。通過米氏方程擬合，可以得出納米氧化銅對(duì)底物過氧化氫的米氏常數(shù)為5.4 mmol/L（見圖8）。

實(shí)例10：

將50 μL不同濃度的過氧化氫溶液（0～8 mmol/L），50 μL濃度為80 mmol/L的對(duì)羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，45分鐘后測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm），以熒光強(qiáng)度對(duì)過氧化氫濃度作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖9所示，熒光強(qiáng)度與過氧化氫濃度在0.05~0.4 mmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.81 μmol/L。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。