本發(fā)明屬于功能性生物材料及其制備和在蛋白質(zhì)特異性捕獲、釋放及純化中的應(yīng)用，具體的說是一種新型的表面涂層改性的固定化金屬離子親和色譜材料制備及其作為親和純化材料用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化。

背景技術(shù)：

重組蛋白技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)晶、蛋白質(zhì)藥物、蛋白質(zhì)相互作用及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有非常重要的作用(T.Hyeon,et al.Adv.Mater.,2010,22,57–60；A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究到功能性蛋白質(zhì)表達(dá)與純化工藝的開發(fā)，親和標(biāo)簽已經(jīng)成為重組蛋白純化中的一個非常重要且有效的工具。由于組氨酸標(biāo)簽具有標(biāo)簽短小、低免疫原性、不影響蛋白構(gòu)象及功能、表達(dá)暴露于蛋白表面、親和力強(qiáng)、易于純化等優(yōu)點(diǎn)，是目前重組蛋白純化中使用最廣泛親和標(biāo)簽(A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。

對組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，目前常采用固定化金屬離子親和色譜(IMAC)技術(shù)，即通過IMAC材料上的金屬離子與組氨酸標(biāo)簽之間的螯合作用實現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽蛋白的捕獲，隨后利用競爭性螯合試劑或低pH洗脫液洗脫，使組氨酸標(biāo)簽蛋白特異性洗脫，實現(xiàn)其純化。然而，由于IMAC材料上金屬離子暴露在材料表面，任何能與金屬離子產(chǎn)生螯合作用的蛋白質(zhì)均被捕獲在IMAC上，如表面富含組氨酸、半胱氨酸、賴氨酸的蛋白質(zhì)。同時，含有金屬離子的蛋白質(zhì)也可被IMAC捕獲(A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。這些蛋白質(zhì)的吸附會導(dǎo)致組氨酸標(biāo)簽純化純度大幅降低，為達(dá)到所需純度必須進(jìn)行后期的二次甚至三次純化(J.K.Shea,et al.J.Am.Chem.Soc.,2014,136,1194-1197)，純化步驟越多，純化效率越低，純化成本也會大幅增加。因此，開發(fā)一步法高純度純化組氨酸標(biāo)簽蛋白的新型固定化金屬離子親和色譜材料意義重大。

對材料表面進(jìn)行涂層改性，可以利用所包覆涂層的特性對基質(zhì)材料的吸附行為進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過在IMAC材料表面包覆聚合物涂層，能在IMAC材料的金屬螯合位點(diǎn)周圍形成聚合物網(wǎng)絡(luò)，利用聚合物網(wǎng)絡(luò)的孔隙篩分作用，能使小分子、肽段及裸露在外的自由度較高的蛋白質(zhì)末端進(jìn)入聚合物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而被IMAC上金屬離子所捕獲；而由于空間位阻作用，其他體積較大的大分子蛋白質(zhì)很難進(jìn)入位點(diǎn)。通過這種表面涂層的孔隙篩分作用，IMAC材料能實現(xiàn)對特定目標(biāo)物的特異性捕獲及純化。

因此，我們以IMAC材料作為基質(zhì)材料，通過自由基聚合反應(yīng)在IMAC 基質(zhì)材料表面包被了一層聚合物涂層。在聚合物網(wǎng)絡(luò)的篩分作用下，組氨酸標(biāo)簽蛋白的末端裸露組氨酸標(biāo)簽可以進(jìn)入聚合物網(wǎng)絡(luò)被IMAC材料捕獲，而其他蛋白質(zhì)缺乏末端組氨酸標(biāo)簽，同時完整蛋白空間阻力太大，無法進(jìn)入聚合物網(wǎng)絡(luò)。最終，利用表面涂層改性的IMAC材料實現(xiàn)了組氨酸標(biāo)簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

選擇表面固載了金屬離子的基質(zhì)材料，通過功能單體聚合形成表面包被的聚合物涂層，制備得到表面涂層改性的IMAC材料，并且將該材料用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化中。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

(1)在基質(zhì)材料表面通過化學(xué)修飾引入功能單體聚合反應(yīng)的反應(yīng)位點(diǎn)，如氨基、巰基、羧基、碳碳雙鍵、環(huán)氧基團(tuán)等。

(2)在基質(zhì)材料表面引入金屬螯合配基，螯合基團(tuán)包括亞氨基二乙酸基團(tuán)(IDA)、次氨基三乙酸基團(tuán)(NTA)、二甲基吡啶胺基團(tuán)(DPA)、磷酸化絲氨酸基團(tuán)(OPS)，三(2-胺乙基)胺基團(tuán)、多巴胺基團(tuán)、磷酸基團(tuán)，利用金屬螯合配基與金屬離子的螯合作用，將金屬離子(包括Cu²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，F(xiàn)e²⁺，Ca²⁺，Co²⁺，F(xiàn)e³⁺，Al³⁺，Yb³⁺，Ga³⁺等)固載于基質(zhì)材料表面，制備得到IMAC材料(Chem Commun.2011；47:3969-71)。

(3)在室溫條件下，將上述基質(zhì)材料、功能單體及致孔劑分散于聚合溶劑中，加入引發(fā)劑，攪拌情況下進(jìn)行聚合；功能單體包括丙烯酰胺類、硅氧烷類、多巴胺、乙烯基類、丙烯基類、苯乙烯基類等；聚合溶劑包括甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基甲酰胺(NMP)、水及上述溶劑以任意比例混合所得的混合溶劑；致孔劑包括聚合溶劑、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚環(huán)氧乙烯醚-聚環(huán)氧丙烯醚-聚環(huán)氧乙烯醚三嵌段共聚物(P123)、聚乙二醇-環(huán)氧乙烷加聚物(F127)、氨基酸、肽段、蛋白質(zhì)等。反應(yīng)結(jié)束后，離心收集材料，洗滌除去未完全反應(yīng)的單體，即可制備得到表面涂層化修飾的金屬離子親和色譜材料(surface coated immobilized metal ion affinity chromatograph,SC-IMAC)。

(5)將該新型SC-IMAC材料用于生物分析、生物化工、生物技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)組氨酸標(biāo)簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明以IMAC材料為基質(zhì)，利用表面涂層改性調(diào)節(jié)了IMAC材料對不同蛋白質(zhì)的親和性。通過表面涂層的孔隙篩分作用，在不影響組氨酸標(biāo)簽蛋白在IMAC上吸附的情況下，降低了雜蛋白的非特異性吸附，實現(xiàn)了組氨酸標(biāo)簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化。

(2)本發(fā)明中IMAC材料外包被一層聚合物涂層，這會阻礙IMAC材 料上金屬離子向外擴(kuò)散，降低了金屬離子泄露的可能。

(3)本發(fā)明基質(zhì)材料、金屬螯合臂、金屬離子以及表面涂層都具有很好的穩(wěn)定性，因此所制備得到的材料可以重復(fù)利用。

附圖說明

圖1：基于NTA及Ni²⁺螯合作用的二氧化硅IMAC表面涂層材料(SC-IMAC1)透射電鏡表征圖；

圖2：SC-IMAC1純化效果圖；其中，泳道1：Marker，泳道2：重組蛋白表達(dá)液，泳道3：IMAC材料純化組份，泳道4，SC-IMAC1純化組份。

圖3：基于IDA及Ni²⁺螯合作用的磁性IMAC表面涂層材料(SC-IMAC2)透射電鏡表征圖；

圖4：SC-IMAC2純化效果圖，其中，泳道2：重組蛋白表達(dá)液，泳道3：SC-IMAC2材料純化組份。

具體實施方式

實施例1

基于NTA及Ni²⁺螯合作用的二氧化硅IMAC表面涂層材料(SC-IMAC1)的制備

3g氨基修飾的二氧化硅納米顆粒(粒徑350nm)，分散于60mL PB緩沖液中，加入2mL戊二醛，室溫下反應(yīng)6h，水洗兩次除去未反應(yīng)的戊二醛。重懸材料與90mL PB緩沖液，加入200mg NTA，調(diào)節(jié)pH至8.0，室溫下過夜反應(yīng)，水洗兩次去除未反應(yīng)的NTA。將所得材料分散于30mL 10mg/mL的NiSO₄水溶液中，得到表面固載了Ni²⁺的IMAC材料。隨后將100mg顆粒重新分散于20mL乙腈中，加入10mg丙烯酰胺(AAm)，10mg亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)，0.5mg AIBN，通N₂20min后，65℃磁力攪拌反應(yīng)12h，離心收集獲得產(chǎn)物，超純水清洗3次，真空干燥，得到基于NTA及Ni²⁺螯合作用的二氧化硅IMAC表面涂層材料(SC-IMAC1)。

用相同的方法，在基質(zhì)材料上只固載金屬離子，不進(jìn)行后續(xù)表面涂層改性，制備得到傳統(tǒng)IMAC材料。

如圖1，所制得SC-IMAC1大小均勻、分散性好，粒徑300-400nm，測得孔隙率為10％。同時，表面很薄的聚合涂層保證了組氨酸標(biāo)簽可通過涂層接近螯合位點(diǎn)，同時其他完整蛋白難以進(jìn)入涂層。

實施例2

基于NTA及Ni²⁺螯合作用的二氧化硅IMAC表面涂層材料(SC-IMAC1)用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化

4mg SC-IMAC用80μL含10mM咪唑的上樣緩沖液于4℃下清洗兩次，使SC-IMAC1處于上樣環(huán)境。將重組蛋白提取液用上樣緩沖液稀釋至4mg/mL，加200μL于預(yù)平衡的SC-IMAC1中，4℃下振蕩孵育30min。離心收集材料，100μL上樣緩沖液洗滌一次，去除未結(jié)合蛋白。30μL含25mM咪唑的洗滌緩沖液洗滌2次，30min/次，以去除弱結(jié)合的雜蛋白。 30μL含250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫4次，30min/次，洗脫組氨酸標(biāo)簽蛋白，SDS-PAGE分析純化產(chǎn)物。

作為參照組，在相同的操作條件下，用IMAC作為親和純化材料對組氨酸標(biāo)簽蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析。

如圖2，由于SC-IMAC1表面進(jìn)行了涂層改性，阻礙干擾蛋白接近螯合位點(diǎn)，降低了非特異性吸附，而由于組氨酸標(biāo)簽裸露在外而且比完整蛋白小，可以通過涂層中的聚合物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而靠近螯合位點(diǎn)被捕獲，因此純度有了很大提高，達(dá)到84％(泳道4)；然而對IMAC而言，金屬螯合位點(diǎn)裸露在外，因此可大量捕獲目標(biāo)蛋白組氨酸標(biāo)簽蛋白，但是同時也吸附了大量的干擾蛋白，純度僅67％(泳道3)。

實施例3

基于IDA及Ni²⁺螯合作用的磁性IMAC表面涂層材料(SC-IMAC2)的制備

5g二氧化硅納米顆粒加入100mL GLYMO-IDA溶液中，65℃下反應(yīng)24小時，將IDA基團(tuán)修飾于二氧化硅材料表面。將5g上述材料加入150mL甲醇中，隨后加入10mLγ-MAPS，于90℃下回流15小時，然后通過甲醇回流的方法，在該基質(zhì)材料表面修飾γ-MAPS。同實施例1方法，可制得基于IDA及Ni²⁺螯合作用的磁性IMAC表面涂層材料(SC-IMAC2)，如圖3所示。同實施例2，用SC-IMAC2純化組氨酸標(biāo)簽蛋白，純化結(jié)果如圖4所示。

實施例4

基于多巴胺單體的二氧化硅IMAC表面涂層材料(SC-IMAC3)的制備

同實施例1，制備表面修飾NTA及γ-MAPS的基質(zhì)材料。以多巴胺為功能單體進(jìn)行在其表面進(jìn)行聚合，形成表面聚合物網(wǎng)絡(luò)，可制備得到基于多巴胺單體的二氧化硅IMAC表面涂層材料(SC-IMAC3)。

實施例5

基于NIPAAm單體的二氧化硅IMAC表面涂層材料(SC-IMAC4)的制備

同實施例1，制備表面修飾NTA及γ-MAPS的基質(zhì)材料。以N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)為功能單體進(jìn)行表面聚合，可制備得到基于NIPAAm單體的二氧化硅IMAC表面涂層材料(SC-IMAC4)。

實施例6

同實施例1及實施例3，用CoSO₄處理表面固載有IDA或NTA的基質(zhì)材料，可將Co²⁺螯合在該材料表面，隨后進(jìn)行表面聚合物包被，可制備得到基于Co²⁺螯合的IMAC表面涂層材料(SC-IMAC5)。