專利名稱：一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片及其制備方法。該芯片用于檢測蛋白質(zhì)、DNA等生物分子，能夠廣泛應(yīng)用于臨床檢測、檢驗檢疫、環(huán)境監(jiān)測、藥物篩選、微生物鑒定以及核酸和蛋白功能分析等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微流控分析芯片是指通過微細(xì)加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建由儲液池、微反應(yīng)室、微管道等微功能元件構(gòu)成的微流路系統(tǒng)，加載生物樣品和反應(yīng)液后，在壓力泵或者電場作用下形成微流路，于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)，以實現(xiàn)對組織和細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)和其他生物組分的高通量快速分析。它是20世紀(jì)90年代初中期在分析化學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來的一種分析技術(shù)，以分析化學(xué)和分析生物化學(xué)為基礎(chǔ)，應(yīng)用微機(jī)電加工技術(shù)，在微芯片上加工出微米級的容器、泵、閥、管道等微結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，將采樣、稀釋、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測等過程進(jìn)行集成的微全分析系統(tǒng)。芯片的大小在幾個平方厘米左右，選用硅片、玻璃、石英、高聚物等材料作為芯片基本載體，通過蝕刻、光刻或印模等方法加工微通道，采用電、壓力、重力、離心力等方式驅(qū)動通道內(nèi)的流體，最后采用化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)、吸收光度、熒光檢測器等進(jìn)行檢測。該芯片在裝置上的主要特征是其容納流體的有效結(jié)構(gòu)(包括其通道、反應(yīng)室和其它功能部件)至少在一個維度上為微米級尺度。與宏觀尺度的實驗裝置相比，微流控芯片的微米級結(jié)構(gòu)顯著增大了流體環(huán)境的比表面積。這一變化在微流控系統(tǒng)中導(dǎo)致一系列與物體表面有關(guān)的決定其特殊性能的特有效應(yīng)，如層流效應(yīng)，表面張力及毛細(xì)效應(yīng)，快速熱傳導(dǎo)效應(yīng)以及擴(kuò)散效應(yīng)等。這些效應(yīng)可以使微流體分析芯片的分析性能得到顯著的改善，包括可以使分析裝備的體積減小，裝備更加的集成化自動化，可以顯著提高分析效率以及使試樣和試劑消耗顯著下降等。把實驗室大型設(shè)備集成在盡可能小的操作平臺上，用以完成不同的實驗過程，并能對產(chǎn)物進(jìn)行分析的技術(shù)。它不僅使試劑的消耗降低，而且使實驗速度提高，費用降低，充分體現(xiàn)了當(dāng)今實驗室設(shè)備微型化、集成化和便攜化的發(fā)展趨勢?，F(xiàn)在微流控芯片已在生物化學(xué)分析和環(huán)境分析諸方面發(fā)有了廣泛的應(yīng)用和快速的發(fā)展。由于微流控芯片將整個樣品分析的過程，包括取樣和樣品的處理、預(yù)濃集、稀釋和混合、分離、化學(xué)反應(yīng)和信號檢測全部集成化在一塊小的芯片上，它與傳統(tǒng)的分析裝置相比實現(xiàn)了亞微升甚至納升級的試劑和樣品消耗，反應(yīng)空間的大大縮小使反應(yīng)的均一性提高，反應(yīng)速度加快，同時降低了生產(chǎn)成本并便于攜帶。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題:本發(fā)明的目的是提供一種以微球為固相載體進(jìn)行生物分子檢測的微流控芯片。將固定有生物探針分子的編碼微球通過芯片進(jìn)行進(jìn)樣、與待測樣品反應(yīng)、洗滌和檢測，提供一種檢測分析的芯片平臺。技術(shù)方案:本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片，其特征在于:該微流控芯片包括蓋片、基片以及方孔陣列，所述的蓋片上設(shè)置有多個并列的進(jìn)樣通道和與所述進(jìn)樣通道連通的反應(yīng)池，該反應(yīng)池的出口位于所述的蓋片的內(nèi)表面上；所述的基片上設(shè)置有多個并列的出樣通道和與所述出樣通道連通的出樣池，該出樣池的入口位于所述基片的內(nèi)表面上；所述的方孔陣列位于所述蓋片的反應(yīng)池和基片的出樣池之間；在所述基片出樣通道的出樣口還連接有一液滴導(dǎo)出管；在所述反應(yīng)池內(nèi)設(shè)置有編碼的微球，在該微球的表面固定有生物分子探針；所述方孔陣列的孔徑小于所述微球的直徑。微球的大小在45 μ m 300 μ m之間；反應(yīng)池和出樣池的直徑均在1.5mnT2.5mm之間，反應(yīng)池和出樣池的高度均在300 μ πΓ 200 μ m之間，進(jìn)樣通道的進(jìn)樣口直徑在200 μ m 1000 μ m之間，長度在5mm 20mm之間；方孔陣列的孔徑在40 μ πΓ290 μ m之間。所述生物分子探針是核酸、蛋白質(zhì)或多肽。所述微球的材料是二氧化硅或聚苯乙烯和聚乙二醇雙丙烯酸酯水凝膠；所述蓋片的材料是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚碳酸酯；所述基片的材料是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚碳酸酯；方孔陣列的材料是聚合物膜、硅片或銅網(wǎng)。微球的編碼是條形碼編碼、熒光編碼、量子點編碼、光子晶體編碼、拉曼標(biāo)簽編碼、紅外光譜編碼、形狀編碼、射頻編碼、大小編碼或位置編碼。其工作原理是:
a)利用移液槍吸取一定量的編碼微球，將微球連其運載緩沖液通過進(jìn)樣通道的進(jìn)樣口，注入出樣池。由于方孔陣列的尺寸小于編碼微球的直徑，因此微球留在方孔陣列上方的反應(yīng)池中，而廢液通過出樣通道的出樣口由液滴導(dǎo)出管導(dǎo)出；
b)之后，將液滴導(dǎo)出管與真空泵連接，抽干芯片中的殘余液體；
c)此時，用移液槍通過進(jìn)樣口注入待測樣品溶液，使樣品充滿方孔陣列上方的出樣池，使待測樣品溶液與微球充分反應(yīng)；
d)反應(yīng)完畢，繼續(xù)通過進(jìn)樣口注入洗滌緩沖液；
e)洗滌完全之后，將液滴導(dǎo)出管與真空泵連接，抽氣5iTlOS，使微球在氣流作用下干燥并卡入方孔陣列中，通過控制微球的數(shù)量使其在方孔陣列上呈單層分布，最后在芯片下方檢測微球表面的反應(yīng)結(jié)果。有益效果:根據(jù)本發(fā)明，利用芯片進(jìn)行注入微球，加樣，反應(yīng)，洗滌和檢測的連續(xù)化操作，以編碼微球為生物分子檢測的固相載體具有以下優(yōu)點:
(1)試劑消耗少:由于雜交反應(yīng)只在反應(yīng)池內(nèi)進(jìn)行，試劑充滿反應(yīng)池只需要
2μ Πθ μ L，避免了外接管路中樣品死體積的產(chǎn)生，減少了試劑消耗；
(2)檢測多元化:作為固相載體的微球具有多種編碼，分別固定不同的探針分子，可以同時檢測同一個樣品中的多個指標(biāo)。同時球形載體比表面積大，檢測靈敏度高，反應(yīng)速度快；
(3)檢測通量高:一個芯片可以集成多個結(jié)構(gòu)單元，同時進(jìn)行多個樣品的檢測分析。(3)準(zhǔn)確度高:微球在方孔陣列上方由于網(wǎng)孔的局限作用相互分隔、有序排列，微球之間的熒光互相不產(chǎn)生影響，便于圖像處理以及解碼，檢測準(zhǔn)確性高； (4)熒光背景低:反應(yīng)試劑滯留在方孔陣列上方，不接觸方孔陣列下表面，通過芯片下方進(jìn)行檢測時幾乎不產(chǎn)生熒光背景。
(3)可擴(kuò)展性高:由于采用了微流控芯片的形式，可以方便的同樣品預(yù)處理等微流控芯片集成，促進(jìn)了分析系統(tǒng)的微型化和自動化；
(3)本發(fā)明同時結(jié)合了微球載體以及微流控芯片的生物檢測優(yōu)勢，對小尺寸的微球操作簡單，具有鮮明的優(yōu)勢。


圖1為本發(fā)明芯片的剖面圖。圖2為本發(fā)明芯片的蓋片的俯視圖。圖3是本發(fā)明芯片的基片的俯視圖。圖4為本發(fā)明芯片檢測時，單個微球的檢測光路圖。圖5為本發(fā)明芯片檢測時，微球與方孔陣列俯視圖。以上的圖中有:1、蓋片，11、進(jìn)樣通道，12、反應(yīng)池，2、基片，21、出樣通道，22、出樣池，3、方孔陣列，4、液滴導(dǎo)出管。

具體實施例方式 下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)說明，本發(fā)明生物芯片由三個部分構(gòu)成，如圖1，包括最上層的蓋片1、中間層的方孔陣列3、以及下層的基片2 ;蓋片I和基片2結(jié)構(gòu)如圖2、圖3所示，蓋片I內(nèi)設(shè)有多個并列的進(jìn)樣通道11以及反應(yīng)池12，基片2內(nèi)設(shè)有多個并列的出樣通道21以及出樣池22，基片在樣通道21的出樣口連接有液滴導(dǎo)出管4 ;一個進(jìn)樣通道11、反應(yīng)池12、方孔陣列、出樣池22、出樣通道21以及液滴導(dǎo)出管4構(gòu)成一個結(jié)構(gòu)單元，該生物芯片由多個結(jié)構(gòu)單元組成。具有不同編碼的微球，其粒徑大小在45 μ m 300 μ m，微球的制備材料為二氧化硅、聚苯乙烯和聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)水凝膠等。方孔陣列的材料可以是聚合物膜(如PE、PP、PVC、PET、PC)、硅片、銅網(wǎng)等；方孔陣列的孔徑可以在40 μ πΓ290 μ m之間；反應(yīng)池的直徑在1.5mnT2.5mm之間，反應(yīng)池的高度在300 μ πΓ 200 μ m之間，進(jìn)樣口直徑在200 μ m 1000 μ m之間，長度在5mm 20mm之間。芯片的基質(zhì)材料可以是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)及聚碳酸酯(PC)等。實施例一:以PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)作為芯片材料，在光子晶體編碼玻璃微球上固定探針進(jìn)行生物檢測，微球直徑為50 μ m,方孔陣列為激光微加工的聚碳酸酯膜，孔徑為 40 μ m。a、蓋片的制備:采用激光微加工方法。通過AutoCAD設(shè)計通道及反應(yīng)池圖形，將CAD圖形轉(zhuǎn)換成激光微加工系統(tǒng)可識別指令；采用激光微加工系統(tǒng)在基片(或蓋片)上加工所需的結(jié)構(gòu)，其中，進(jìn)樣通道直徑為0.8mm，長5mm，反應(yīng)池直徑為2mm，高度為1.2mm ；
b、基片的制備:與蓋片制備過程相同，在出樣通道的出樣口插入外徑為0.8_，長度為7mm的PE管；
C、蓋片和基片的封合:在基片上涂一層較薄的PDMS(留出反應(yīng)池部分)，之后將其放入75°C烘箱預(yù)固化5min，在半固化的PDMS上放置方孔陣列，并將兩片芯片基片對齊粘合，用夾子固定兩片基片并放入75°C烘箱固化Ih ；
d、微球上固定探針:洗凈的微球經(jīng)親水處理和硅烷化，然后將不同的探針分子固定到不同編碼的光子晶體微球上；
e、微流控芯片的連接:液滴導(dǎo)出管4接真空泵；
f、進(jìn)樣:通過移液槍將編碼微球連同其運載緩沖液注入進(jìn)樣通道11的進(jìn)樣口，然后進(jìn)入出樣池12，最后抽干運載緩沖液，編碼微球留在反應(yīng)池12中；
g、反應(yīng):通過移液槍將待檢測溶液注入進(jìn)樣通道11的進(jìn)樣口，最后進(jìn)入反應(yīng)池12中與編碼微球表面的探針分子進(jìn)行反應(yīng)；
h、洗滌:反應(yīng)完畢后，通過移液槍從進(jìn)樣通道11的進(jìn)樣口注入洗滌緩沖液到反應(yīng)池12對微球進(jìn)行充分洗滌；
1、檢測:抽干反應(yīng)池12中的洗滌緩沖液，抽氣5iTlOS，使微球在氣流作用下干燥并卡入方孔陣列中，最后在芯片下方檢測微球表面的反應(yīng)結(jié)果。實施例二:以PDMS和玻璃作為芯片材料，在量子點編碼聚苯乙烯微球上固定探針進(jìn)行生物檢測，微球直徑為210μπι，方孔陣列為銅網(wǎng)，孔徑為200μπι。a、基片的制備:選擇PDMS的基質(zhì)和固化劑的比例為10:1 (質(zhì)量比)，混合均勾后，經(jīng)真空抽氣以除去氣泡后，澆注在排布鋼針的容器內(nèi)，進(jìn)行加熱固化60min，其中，鋼針長度為2cm，直徑為0.8_。固化好后將PDMS從容器上揭下，在鋼針末端打孔(孔徑2.5_)即制成基片；
b、蓋片的制備:與基片制備方法相同，制備完成后用酒精潤濕蓋片，拔除鋼針；
C、蓋片和基片的封合:固化好的基片和蓋片以及兩片洗凈的玻璃經(jīng)氧等離子體處理后，在基片上放置方孔陣列，將基片和蓋片夾在兩片玻璃之間貼合，然后直接通過熱鍵合方法進(jìn)行基片和蓋片的封裝；
d、微球上固定探針:將不同的探針分子固定到不同編碼的聚苯乙烯微球表面；
e、微流控芯片的連接:液滴導(dǎo)出管4接真空泵；
f、進(jìn)樣:通過移液槍將編碼微球連同其運載緩沖液注入進(jìn)樣通道11的進(jìn)樣口，然后進(jìn)入反應(yīng)池12，最后抽干運載緩沖液，編碼微球留在反應(yīng)池12中；
g、反應(yīng):通過移液槍將待檢測溶液注入進(jìn)樣通道11的進(jìn)樣口，最后進(jìn)入反應(yīng)池12中與編碼微球表面的探針分子進(jìn)行反應(yīng)；
h、洗滌:反應(yīng)完畢后，通過移液槍從進(jìn)樣通道11的進(jìn)樣口注入洗滌緩沖液到反應(yīng)池12對微球進(jìn)行充分洗滌；
1、檢測:抽干反應(yīng)池12中的洗滌緩沖液，抽氣5iTlOS，使微球在氣流作用下干燥并卡入方孔陣列中，最后在芯片下方檢測微球表面的反應(yīng)結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片，其特征在于:該微流控芯片包括蓋片(I)、基片(2)以及方孔陣列(3)，所述的蓋片(I)上設(shè)置有多個并列的進(jìn)樣通道(11)和與所述進(jìn)樣通道(11)連通的反應(yīng)池(12)，該反應(yīng)池(12)的出口位于所述的蓋片(I)的內(nèi)表面上；所述的基片(2)上設(shè)置有多個并列的出樣通道(21)和與所述出樣通道(21)連通的出樣池(22)，該出樣池(22)的入口位于所述基片(2)的內(nèi)表面上；所述的方孔陣列(3)位于所述蓋片(I)的反應(yīng)池(12 )和基片(2 )的出樣池(22 )之間；在所述基片(2 )出樣通道(22 )的出樣口還連接有一液滴導(dǎo)出管(4);在所述反應(yīng)池(12)內(nèi)設(shè)置有編碼的微球，在該微球的表面固定有生物分子探針；所述方孔陣列的孔徑小于所述微球的直徑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片，其特征在于:微球的大小在45μπι 300μπι之間；反應(yīng)池(12)和出樣池(22)的直徑均在1.5mnT2.5mm之間，反應(yīng)池(12)和出樣池(22)的高度均在300μπΓ 200μπι之間，進(jìn)樣通道(11)的進(jìn)樣口直徑在200 μ m 1000 μ m之間，長度在5mm 20mm之間；方孔陣列(3)的孔徑在40 μ πΓ290 μ m 之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片，其特征在于:所述生物分子探針是核酸、蛋白質(zhì)或多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片，其特征在于:所述微球的材料是二氧化硅或聚苯乙烯和聚乙二醇雙丙烯酸酯水凝膠；所述蓋片的材料是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚碳酸酯；所述基片的材料是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚碳酸酯；方孔陣列的材料是聚合物膜、硅片或銅網(wǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片，其特征在于:微球的編碼是條形碼編碼、熒光編碼、量子點編碼、光子晶體編碼、拉曼標(biāo)簽編碼、紅外光譜編碼、形狀編碼、射頻編碼 、大小編碼或位置編碼。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于微球多元生物檢測的微流控芯片，該微流控芯片包括蓋片、基片以及方孔陣列，蓋片上設(shè)置有多個并列的進(jìn)樣通道和與進(jìn)樣通道連通的反應(yīng)池，該反應(yīng)池的出口位于蓋片的內(nèi)表面上；基片上設(shè)置有多個并列的出樣通道和與出樣通道連通的出樣池，該出樣池的入口位于所述基片的內(nèi)表面上；方孔陣列位于蓋片的反應(yīng)池和基片的出樣池之間；在基片出樣通道的出樣口還連接有一液滴導(dǎo)出管；在反應(yīng)池內(nèi)設(shè)置有編碼的微球，在該微球的表面固定有生物分子探針；方孔陣列的孔徑小于微球的直徑。在芯片的使用過程中，微球與樣品的進(jìn)樣、反應(yīng)、洗滌以及檢測都在芯片上進(jìn)行，具有集成度高，使用方便，樣品消耗量小，檢測靈敏度高等優(yōu)點。
文檔編號B01L3/00GK103191792SQ20131013548
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者顧忠澤, 趙祥偉, 王曉霞 申請人:東南大學(xué)