專利名稱：一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于功能高分子水凝膠材料的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種酶促凝膠 化快速形成蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法。
背景技術(shù)：
分子印跡技術(shù)是通過模板分子在聚合物網(wǎng)絡(luò)中形成特征識別單元的過
程。近年來，基于分子印跡技術(shù)制備出的分子印跡水凝膠(MIHs)材料， 不僅可發(fā)揮水凝膠柔韌性好、傳質(zhì)快的特性，而且可提高聚合物網(wǎng)絡(luò)對特定 分子的結(jié)合力。目前，該類功能材料已在分離、傳感、催化、抗體模擬、藥 物傳輸?shù)阮I(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
蛋白質(zhì)是一類重要的天然有機物。它是生物體內(nèi)一切組織的基礎(chǔ)物質(zhì)， 并在生命現(xiàn)象和生命過程中起決定性作用。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 一般由200 300個氨基酸所構(gòu)成的，這給蛋白質(zhì)分離、提純帶來極大困難。目前，用于 蛋白質(zhì)分離的方法主要有凝膠過濾、電泳和色譜法。然而，這些方法所需材 料的制備耗時長、成本高、且穩(wěn)定性較差(Bergmarm N M, Peppas N A. Progress in Polymer Science, 2008, 33: 271-288)。利用分子印跡水 疑膠易于 大量制備、性能穩(wěn)定、專一識別性等優(yōu)點，可望解決蛋白質(zhì)識別、分離中的 技術(shù)難題。
迄今為止，有關(guān)氨基酸等小分子的分子印跡技術(shù)已得到一定程度的應(yīng) 用，但對蛋白類生物大分子的印跡技術(shù)尚存在以下不足首先，常用分子印 跡材料制備過程中，為了實現(xiàn)分子識別，功能單體需先與模板分子相互作用 形成某種可逆復(fù)合物，再加入引發(fā)劑和交聯(lián)劑進行共聚交聯(lián)，這一過程往往 需數(shù)小時才能完成(中國專利CA 1844174A)，從而使蛋白質(zhì)活性難以保持； 其次，傳統(tǒng)分子印跡過程多在有機溶劑中進行，且有關(guān)共聚交聯(lián)一般需在光 照或加熱等條件下進行，而這些條件又極易引起蛋白質(zhì)變性失活；第三，常 見MIHs制備時多采用丙烯酸、丙烯酰胺等乙烯基衍生物作為功能單體，二 甲基丙烯酸乙二醇酯、A^V-亞甲基雙丙烯酰胺等作為交聯(lián)劑(Ohad K,Havazelet B P. Langmuir, 2007, 23: 6329-6335)，致使所得分子印跡材料的生 物降解及相容性較差，從而限制了MIHs在蛋白質(zhì)分子印跡方面的應(yīng)用。因 此，如何在溫和反應(yīng)條件下、快速制備出具有良好生物相容性的MIHs材料， 是當(dāng)前蛋白質(zhì)分子印跡技術(shù)領(lǐng)域的一項重要研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì) 分子印跡水凝膠的制備方法。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn) 一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制 備方法，其特征在于包括以下操作步驟
(1) 將質(zhì)量百分比濃度為2.0 8.0 %的羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物
水溶液與質(zhì)量百分比濃度為0.02 0.2 %牛血清蛋白水溶液混合；
(2) 在攪拌的條件下，依次加入占羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物總質(zhì) 量的0.30 0.70 %的過氧化氫(H202)和占羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物總 質(zhì)量的0.01 0.04。/。的辣根過氧化酶(HRP)，凝膠化反應(yīng)8 12s，得到凝膠 化反應(yīng)產(chǎn)物；
(3) 洗脫除去模板分子牛血清蛋白，得到對牛血清蛋白具有選擇性吸 附特性的分子印跡水凝膠。
步驟(1)所述羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物溶液和牛血清蛋白溶液的 質(zhì)量比為1:1。
步驟(1)所述羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物溶液是將羧甲基淀粉-對氨 基苯酚接枝物溶于水中或緩沖試劑中；所述牛血清蛋白溶液是將牛血清蛋白 溶于水中或緩沖試劑中。所述緩沖試劑是碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、 磷酸二氫鈉或檸檬酸鈉。
步驟(1)所述羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物的合成方法，包括以下操 作步驟
(a) 制備羧甲基淀粉將10.0 g可溶性淀粉溶于40 mL水中，并加入 20 mL異丙醇和8.0 g氫氧化鈉，60 °C條件下攪拌，溶脹熟化1 h，加入25.0 g氯乙酸鈉，反應(yīng)4h后，用乙醇沉淀、洗滌，于40 50。C下真空干燥48h， 得到羧甲基淀粉；
(b) 制備羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物取5.0g步驟(a)所得羧甲 基淀粉溶于60 mL 二甲基亞砜(DMSO)中，100 °C條件下攪拌溶脹1 h;冷卻至室溫，在攪拌條件下，加入0.3 1.0gA^ ,二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 0.15 0.50 g7V-羥基琥珀酰亞胺(NHS)禾卩0.30 2.0 g的對氨基苯酚進行酰 胺化反應(yīng)；在攪拌條件下反應(yīng)24h后，過濾除去沉淀物，用乙醇沉淀，洗滌、 干燥后得到羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物。
步驟(2)所述過氧化氫制成質(zhì)量百分比濃度為0.5 2.0%的水溶液；所 述辣根過氧化酶制成質(zhì)量體積濃度為0.30 1.0 mg/mL的水溶液，該辣根過 氧化酶的活性為200 250 U/mg。
步驟(3)所述洗脫除去牛血清蛋白的方法為將步驟(2)所得凝膠化 反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量百分含量為2.0 8.0 %的十二垸基磺酸鈉的乙酸/水混合溶 液洗滌至其在紫外278 nm處沒有吸收。
所述乙酸/水是體積比為1: 9 2: 8的乙酸和水的混合物。
將步驟(3)所得蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠用水洗滌至中性，除去殘余的 十二垸基磺酸鈉和乙酸，冷凍干燥得蛋白質(zhì)分子印跡干膠。
上述方法所得蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的選擇性吸附特性測定方法為稱 取兩份質(zhì)量為0.10 g的分子印跡干膠并浸入蒸餾水中充分溶脹，再分別置于 5.0mL濃度均為1.0mg/mL的牛血清蛋白和干酪素水溶液中，吸附4h后， 用紫外分光光度法測定吸附量(牛血清和干酪素的測定波長分別為278 nm 和288 nm)，并計算出分離因子(a)和印跡效率(^)。
本發(fā)明的原理是以具有良好生物降解和生物相容性的天然多糖為基本 原材料，首先合成了羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物，再采用酶促凝膠化法 在水溶液中快速形成蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠；本發(fā)明通過控制羧甲基淀粉與 對氨基苯酚接枝物的取代度及其與牛血清蛋白的投料比，以過氧化氫和辣根 過氧化酶為催化劑，引發(fā)凝膠化反應(yīng)，于室溫條件下，制備系列可生物降解 且具有良好生物相容性的蛋白質(zhì)印跡水凝膠。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果(l)酶促凝膠化法 制備蛋白質(zhì)印跡水凝膠，不涉及其它化學(xué)交聯(lián)劑與引發(fā)劑，制備工藝簡單， 且容易控制；(2)反應(yīng)條件溫和，在室溫下瞬時形成，凝膠化速度快，可有 效避免蛋白質(zhì)變性；(3)凝膠化過程在水介質(zhì)中進行；(4)分子印跡凝膠的 強度可通過羧甲基淀粉與對氨基苯酚接枝物的濃度及取代度進行調(diào)控；(5) 由本發(fā)明的方法制得的分子印跡水凝膠性能穩(wěn)定，可長期保存；(6)所采用 的主要原料為淀粉，原料來源廣泛，所形成的分子印跡水凝膠具有良好的生 物降解性及生物相容性。


圖1為本發(fā)明牛血清蛋白分子印跡干凝膠模板分子洗脫前與洗脫后的紅 外光譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施 方式不限于此。 實施例1
(1) 制備羧甲基淀粉將10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入 20mL異丙醇、8.0g氫氧化鈉，60。C條件下磁力攪拌，溶脹熟化1 h，加入 25.0g氯乙酸鈉，反應(yīng)4h后，用乙醇沉淀、洗滌，于40 °C真空干燥48 h， 即得到羧甲基淀粉，采用酸堿滴定法測得該羧甲基淀粉的取代度為0.20;
(2) 制備羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物取5.0g羧甲基淀粉置于150 mL圓底燒瓶中，并加入60 mL 二甲基亞砜(DMSO)， 100 。C條件下攪拌溶 脹l h;冷卻至室溫，磁力攪拌條件下，加入0.30g的見7V-二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)和0.15 g的W-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，然后加入0.30 g的 對氨基苯酚進行酰胺化反應(yīng)；攪拌反應(yīng)24h后，過濾除去沉淀物，用乙醇沉 淀，經(jīng)洗滌、干燥得羧甲基淀粉與對氨基苯酚接枝物，用紫外光譜法測得該 接枝物的對氨基苯酚的取代度為0.03;
(3) 將2.0 g質(zhì)量百分比濃度為4.0 %，取代度為0.03的羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物水溶液與2.0 g質(zhì)量百分比濃度為0.08 %牛血清蛋白水溶 液充分混合；
(4) 磁力攪拌條件下，依次加入0.50 mg的H202 (1^202制成質(zhì)量百分 比濃度為0.5 %的水溶液)是與0.03 mg的辣根過氧化酶(辣根過氧化酶制 成質(zhì)量體積濃度為0.30 mg/mL的水溶液，該辣根過氧化酶的活性為 200U/mg)，凝膠化反應(yīng)8s，得到凝膠化產(chǎn)物；
(5) 將制得的凝膠化產(chǎn)物用質(zhì)量百分含量為2.0 %的十二烷基磺酸鈉的 乙酸/水混合溶液(乙酸和水的體積比為1: 9)洗滌至紫外278 nm處沒有吸 收為止，得蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠；洗脫后的分子印跡水凝膠再用大量蒸餾 水洗滌至中性，除去殘余的十二烷基磺酸鈉及乙酸，冷凍干燥得蛋白質(zhì)分子 印跡干膠。
將步驟(5)中洗脫前后的蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠進行紅外光譜測定，如圖1所示，圖l (A)為牛血清蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠模板分子洗脫前的紅 外光譜圖，與圖l (B)為牛血清蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠模板分子洗脫后的紅
外光譜圖。圖1A在1316、 710cm"處出現(xiàn)了牛血清蛋白的特征吸收峰，這表 明牛血清蛋白已成功印跡到水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，而對比圖1A、 B發(fā)現(xiàn)，圖1B 在該位置沒有吸收峰，這表面蛋白質(zhì)洗脫較完全。進一步比較圖1A、 B兩紅 外譜圖發(fā)現(xiàn)，圖1A中羧基的特征吸收峰出現(xiàn)在1609、 1424 cm—'處，而圖1B 中羧基的特征吸收峰是在1645和1398 cm—'處；另外，洗脫前后葡萄糖單元環(huán) 上的C一OH不對稱伸縮振動峰也由1040 cm"變?yōu)楹?010 cm—1。這些吸收峰的 偏移是由于羧甲基淀粉上的羧基、羥基與牛血清蛋白分子間存在較強的氫鍵 作用。
測定本實施例制得的牛血清蛋白分子印跡水凝膠的分離因子(《)為 1.61，印跡效率(P)為1.70。
實施例2
(1) 制備羧甲基淀粉將10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入 20mL異丙醇、8.0g氫氧化鈉，60。C條件下磁力攪拌，溶脹熟化1 h，加入 25.0g氯乙酸鈉，反應(yīng)4h后，用乙醇沉淀、洗滌，于45 °C真空干燥48 h， 即得到羧甲基淀粉，采用酸堿滴定法測得該羧甲基淀粉的取代度為0.20;
(2) 制備羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物取5.0g羧甲基淀粉置于150 mL圓底燒瓶中，并加入60 mL 二甲基亞砜(DMSO)， 100 °C條件下攪拌溶 脹l h。冷卻至室溫，磁力攪拌條件下，加入0.50 g的7V， iV-二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)和0.25 g的W-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，然后加入0.60 g的 對氨基苯酚進行酰胺化反應(yīng)；攪拌反應(yīng)24h后，過濾除去沉淀物，用乙醇沉 淀，經(jīng)洗滌、干燥得羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物，用紫外光譜法測得該 接枝物的對氨基苯酚的取代度為0.06;
(3) 將2.0 g質(zhì)量百分比濃度為2.0 %，取代度為0.06的羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物的碳酸鈉溶液與2.0 g質(zhì)量百分比濃度為0.02 %牛血清蛋 白碳酸氫鈉溶液混合；
(4) 磁力攪拌條件下，依次加入0.12mg的H202 (H202制成質(zhì)量百分 比濃度為1.0%的水溶液)與0.016 mg的辣根過氧化酶(辣根過氧化酶制成 質(zhì)量體積濃度為0.5 mg/mL的水溶液，該辣根過氧化酶的活性為250 U/mg)， 凝膠化反應(yīng)10 s，得到凝膠化產(chǎn)物；(5)將制得的凝膠化產(chǎn)物用十二垸基磺酸鈉質(zhì)量百分含量為4.0 %的乙
酸/水混合溶液(乙酸和水的體積比為1: 8)洗滌至紫外278 nm處沒有吸收 為止，得蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠；洗脫后的蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠再用大量 蒸餾水洗滌至中性，除去殘余的十二垸基磺酸鈉及乙酸，冷凍干燥得蛋白質(zhì) 分子印跡干膠。
測定本實施例制得的牛血清蛋白分子印跡水凝膠的的分離因子(a)為 1.73，印跡效率(/ )為1.81。
實施例3
(1) 制備羧甲基淀粉將10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入 20mL異丙醇、8.0g氫氧化鈉，60。C條件下磁力攪拌，溶脹熟化1 h，加入 25.0g氯乙酸鈉，反應(yīng)4h后，用乙醇沉淀、洗滌，于5(TC真空干燥48h， 即得到羧甲基淀粉，采用酸堿滴定法測得該羧甲基淀粉的取代度為0.20;
(2) 制備羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物取5.0g羧甲基淀粉置于150 mL圓底燒瓶中，并加入60mL 二甲基亞砜(DMSO)， 100。C條件下攪拌溶脹 1 h。冷卻至室溫，磁力攪拌條件下，加入l.O g的W， iV-二環(huán)己基碳二亞胺
(DCC)和0.50 g的W-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，然后加入2.0 g的對氨基苯 酚進行酰胺化反應(yīng)。攪拌反應(yīng)24h后，過濾除去沉淀物，用乙醇沉淀，經(jīng)洗 滌、干燥得羧甲基淀粉與對氨基苯酚接枝物，用紫外光譜法測得該羧甲基淀 粉-對氨基苯酚接枝物的對氨基苯酚的取代度為0.10;
(3) 將1.0 g質(zhì)量百分比濃度為6.0 %，取代度為0.10的羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物的磷酸氫二鈉溶液與1.0 g質(zhì)量百分比濃度為0.1 %牛血清 蛋白的磷酸二氫鈉溶液混合；
(4) 磁力攪拌條件下，依次加入0.24mg的H202 (11202制成質(zhì)量百分 比濃度為1.5%的水溶液)與0.012 mg的辣根過氧化酶(辣根過氧化酶制成 質(zhì)量體積濃度為0.6 mg/mL的水溶液，該辣根過氧化酶的活性為220 U/mg)， 凝膠化反應(yīng)12 s，得到凝膠化產(chǎn)物；
(5) 將制得的凝膠化產(chǎn)物用十二烷基磺酸鈉質(zhì)量百分含量為6.0 %的乙 酸/水混合溶液(乙酸和水的體積比為1: 5)洗滌至紫外278 nm處沒有吸收 為止，得蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠；洗脫后的分子印跡水凝膠再用大量蒸餾水 洗滌至中性，除去殘余的十二垸基磺酸鈉及乙酸，冷凍干燥得蛋白質(zhì)分子印 跡干膠。測定本實施例制得的牛血清蛋白分子印跡水凝膠的的分離因子(a)為 2.09，印跡效率(")為2.13。
實施例4
(1) 制備羧甲基淀粉將10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入 20mL異丙醇、8.0g氫氧化鈉，60 QC條件下磁力攪拌，溶脹熟化1 h，加入 25.0g氯乙酸鈉，反應(yīng)4h后，用乙醇沉淀、洗滌，于47 QC真空干燥48 h， 即得到羧甲基淀粉，采用酸堿滴定法測得該羧甲基淀粉的取代度為0.20;
(2) 制備羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物取5.0g羧甲基淀粉置于150 mL圓底燒瓶中，并加入60 mL 二甲基亞砜(DMSO)， 100 °C條件下攪拌溶 脹l h。冷卻至室溫，磁力攪拌條件下，加入0.50 g的iV， ,二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)和0.25 g的iV-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，然后加入0.60 g的 對氨基苯酚進行酰胺化反應(yīng)。攪拌反應(yīng)24h后，過濾除去沉淀物，用乙醇沉 淀，經(jīng)洗滌、干燥得羧甲基淀粉與對氨基苯酚接枝物，用紫外光譜法測得該 羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物的對氨基苯酚的取代度為0.06。
(3) 將2.0 g質(zhì)量百分比濃度為8.0 %，取代度為0.06的羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物水溶液與2.0 g質(zhì)量百分比濃度為0.04 %牛血清蛋白檸檬 酸鈉溶液混合；
(4) 磁力攪拌下，磁力攪拌條件下，依次加入0.96mg的H202 (H202 制成質(zhì)量百分比濃度為2.0 %的水溶液)與0.016mg的辣根過氧化酶(辣根 過氧化酶制成質(zhì)量體積濃度為0.8 mg/mL的水溶液，該辣根過氧化酶的活性 為230U/mg)，凝膠化反應(yīng)lls，得到凝膠化產(chǎn)物；
(5) 將制得的蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠用十二烷基磺酸鈉質(zhì)量百分含量 為8.0 %的乙酸/混合水溶液(乙酸和水的體積比為2: 9)洗滌至紫外278 nm 處沒有吸收為止，得蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠；洗脫后的分子印跡水凝膠再用 大量蒸熘水洗滌至中性，除去殘余的十二垸基磺酸鈉及乙酸，冷凍干燥得蛋 白質(zhì)分子印跡干膠。
測定本實施例制得的牛血清蛋白分子印跡水凝膠的的分離因子(《)為 1.41，印跡效率(A)為1.55。
實施例5
(1)制備羧甲基淀粉將10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入20mL異丙醇、8.0g氫氧化鈉，6(TC條件下磁力攪拌，溶脹熟化1 h，加入 25.0g氯乙酸鈉，反應(yīng)4h后，用乙醇沉淀、洗滌，于43。C真空干燥48h， 即得到羧甲基淀粉，采用酸堿滴定法測得該羧甲基淀粉的取代度為0.20;
(2) 制備羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物取5.0g羧甲基淀粉置于150 mL圓底燒瓶中，并加入60mL 二甲基亞砜(DMSO)， 100 。C條件下攪拌溶 脹l h。冷卻至室溫，磁力攪拌條件下，加入0.50 g的iV， iV-二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)和0.25 g的iV-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，然后加入0.60 g的 對氨基苯酚進行酰胺化反應(yīng)。攪拌反應(yīng)24h后，過濾除去沉淀物，用乙醇沉 淀，經(jīng)洗滌、干燥得羧甲基淀粉與對氨基苯酚接枝物，用紫外光譜法測得該 羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物的對氨基苯酚的取代度為0.06。
(3) 將1.0 g質(zhì)量百分比濃度為8.0 %，取代度為0.06的羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物的檸檬酸鈉溶液與1.0 g質(zhì)量百分比濃度為0.16 %牛血清 蛋白水溶液混合
(4) 磁力攪拌下，磁力攪拌條件下，依次加入0.4 mg的H202 (H202 制成質(zhì)量百分比濃度為1.8%的水溶液)與0.024 mg的辣根過氧化酶(辣根 過氧化酶制成質(zhì)量體積濃度為1.0mg/mL的水溶液，該辣根過氧化酶的活性 為200U/mg)，凝膠化反應(yīng)9s，得到凝膠化產(chǎn)物；
(5) 將制得的蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠用十二烷基磺酸鈉質(zhì)量百分含量 為5.0 %的乙酸/水混合溶液(乙酸和水的體積比為2: 8)洗滌至紫外278 rnn 處沒有吸收為止，得蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠；洗脫后的分子印跡水凝膠再用 大量蒸餾水洗滌至中性，除去殘余的十二烷基磺酸鈉及乙酸，冷凍干燥得蛋 白質(zhì)分子印跡干膠。
測定本實施例制得的牛血清蛋白分子印跡水凝膠的的分離因子(《)為 1.73，印跡效率(p)為1.90。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述 實施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、 修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護 范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)將質(zhì)量百分比濃度為2.0～8.0％的羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物溶液與質(zhì)量百分比濃度為0.02～0.2％牛血清蛋白溶液混合；(2)在攪拌的條件下，依次加入占羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物總質(zhì)量的0.30～0.70％的過氧化氫和占羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物總質(zhì)量的0.01～0.04％的辣根過氧化酶，反應(yīng)8～12s，得到凝膠化反應(yīng)產(chǎn)物；(3)洗脫除去牛血清蛋白，得到蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其 特征在于步驟(1)所述羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物溶液和牛血清蛋白 溶液的質(zhì)量比為l: 1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其 特征在于步驟(1)所述羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物溶液是將羧甲基淀 粉一對氨基苯酚接枝物溶于水中或緩沖試劑中；所述牛血清蛋白溶液是將牛 血清蛋白溶于水中或緩沖試劑中。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其特征在于所述緩沖試劑是碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉或檸檬酸鈉。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其特征在于步驟(1)所述羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物的合成方法包括以 下操作步驟(a) 制備羧甲基淀粉將10.0 g可溶性淀粉溶于40 mL水中，并加入 20 mL異丙醇和8.0 g氫氧化鈉，60 。C條件下攪拌，溶脹熟化1 h，加入25.0 g氯乙酸鈉，反應(yīng)4h后，用乙醇沉淀、洗滌，于40 5(TC下真空干燥48h， 得到羧甲基淀粉；(b) 制備羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物取5.0g步驟(a)所得羧甲 基淀粉溶于60mL 二甲基亞砜中，100。C條件下攪拌溶脹lh;冷卻至室溫， 在攪拌條件下，加入0.3 1.0gA^ ,二環(huán)己基碳二亞胺、0.15 0.50gA^-羥基 琥珀酰亞胺和0.30 2.0 g的對氨基苯酚進行酰胺化反應(yīng)；在攪拌條件下反應(yīng) 24 h后，過濾除去沉淀物，用乙醇沉淀，洗滌、干燥后得到羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其 特征在于步驟(2)所述過氧化氫制成質(zhì)量百分比濃度為0.5 2.0 %的水溶液；所述辣根過氧化酶制成質(zhì)量體積濃度為0.30 1.0 mg/mL的水溶液， 該辣根過氧化酶的活性為200 250 U/mg。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其 特征在于步驟(3)所述洗脫除去牛血清蛋白的方法為將步驟(2)所得 凝膠化反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量百分含量為2.0 8.0 %的十二垸基磺酸鈉的乙酸/水 混合溶液洗滌至其在紫外278 nm處沒有吸收。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其特征在于所述乙酸/水是體積比為1: 9 2: 8的乙酸和水的混合物。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1 8任一項所述的一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法，其特征在于將步驟(3)所得蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠用水洗滌至中性，除去殘余的十二烷基磺酸鈉和乙酸，冷凍干燥得蛋白質(zhì)分子印跡干膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)分子印跡水凝膠的制備方法。該方法包括如下步驟將質(zhì)量百分比濃度為2.0～8.0％的羧甲基淀粉-對氨基苯酚接枝物水溶液與質(zhì)量百分比濃度為0.02～0.20％牛血清蛋白水溶液混合，攪拌條件下，依次加入過氧化氫與辣根過氧化酶，8～12秒內(nèi)發(fā)生凝膠化，經(jīng)洗脫除去模板分子牛血清蛋白，即得到對牛血清蛋白具有選擇性吸附特性的分子印跡水凝膠。本發(fā)明具有原料易得、快速凝膠化、反應(yīng)溫和、易控制、獲得的分子印跡水凝膠具有較好的識別性能及優(yōu)良的生物降解和生物相容性，可望在蛋白質(zhì)分離得到應(yīng)用。
文檔編號B01J20/281GK101543766SQ20091003807
公開日2009年9月30日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者唐春燕, 張黎明, 王紅飛 申請人:中山大學(xué)