專利名稱：：親水的高蛋白結(jié)合的低熒光蛋白質(zhì)印跡膜的制作方法親水的高蛋白結(jié)合的低熒光蛋白質(zhì)印跡膜本申請(qǐng)要求2008年8月18日提交的臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/189，302的優(yōu)先權(quán)，其整體通過援引并入本文。
背景技術(shù)：
："印跡"或"電印跡"是指在電場(chǎng)影響下，用于將生物樣品從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上的方法。該方法需要可固定生物分子樣品用于隨后檢測(cè)的膜。這對(duì)于膜的表面積、孔隙和蛋白結(jié)合能力均提出了特殊要求。蛋白質(zhì)印跡是對(duì)該技術(shù)的一種修飾，其包括在使用單克隆或多克隆抗體檢測(cè)前，將蛋白質(zhì)在膜上固定。在蛋白質(zhì)固定到膜上之前，使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將樣品蛋白分離為天然或變性的蛋白。所述蛋白隨后轉(zhuǎn)移或電印跡至膜上，進(jìn)而采用對(duì)靶蛋白特異性的抗體對(duì)它們進(jìn)行探測(cè)并最終檢測(cè)。蛋白質(zhì)印跡膜通常由硝酸纖維素(NC)或聚偏氟乙烯(PVDF)制備。抗體-抗原作用的特異性能保證在復(fù)雜的蛋白混合物中鑒定單個(gè)蛋白質(zhì)。概述而言，蛋白質(zhì)印跡包括將蛋白質(zhì)樣品(溶胞產(chǎn)物)施用到聚丙烯酰胺凝膠上，隨后通過電泳分離所述復(fù)雜混合物，并且將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移或"電印跡"到第二種基質(zhì)，通常為硝酸纖維素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)移后，膜被"封閉"以防止抗體與膜表面的非特異性結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多抗體標(biāo)記或加標(biāo)簽策略。在最簡單的方案中，轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)與用作探針的第一酶標(biāo)記的抗體孵育或復(fù)合，阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，加入適合的底物以與酶復(fù)合，其一起反應(yīng)形成產(chǎn)色的、化學(xué)發(fā)光的或可熒光檢測(cè)的產(chǎn)物，以允許分別進(jìn)行目測(cè)、化學(xué)發(fā)光或熒光檢測(cè)。最靈敏的檢測(cè)方案利用了化學(xué)發(fā)光或熒光現(xiàn)象。在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中，酶-底物復(fù)合物產(chǎn)生可檢測(cè)的光學(xué)發(fā)射(化學(xué)發(fā)光)。這些發(fā)射被記錄并采用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器例如膠片或光子設(shè)備測(cè)量。信號(hào)存在或不存在表明該溶胞產(chǎn)物中是否有特定的蛋白質(zhì)存在，信號(hào)強(qiáng)度與所關(guān)注的蛋白質(zhì)的水平有關(guān)，其在某些情況下是可定量的。硝酸纖維素膜普遍用于免疫檢測(cè)工作、尤其是蛋白質(zhì)印跡中。其部分是由于歷史原因，部分因?yàn)槠湟子眯?。硝酸纖維素印跡膜不需要有機(jī)液體預(yù)濕潤步驟(采用疏水膜時(shí)需要)。疏水膜在裝配到印跡轉(zhuǎn)移組件之前需要首先用醇預(yù)濕潤，隨后用水交換以除去醇的步驟。本質(zhì)疏水的膜進(jìn)行該裝配的時(shí)間有限，該膜的干燥潛能是顯著的。干燥后，膜不可被重新潤濕，除非重復(fù)進(jìn)行預(yù)潤濕步驟。一旦膜與凝膠接觸，在轉(zhuǎn)移前拿開則會(huì)有效損壞凝膠和其含有的分離蛋白樣品。預(yù)濕潤步驟是耗時(shí)的，是很不利的步驟。親水膜將在更長的時(shí)間內(nèi)保持濕潤，并且如果其在裝配前干燥，可用水重新潤濕。硝酸纖維素印跡膜是水可潤濕的，在多數(shù)印跡應(yīng)用中均顯示了令人滿意的性能。但硝酸纖維素并不如PVDF那樣在機(jī)械性或化學(xué)性上穩(wěn)定。PVDF在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)保持其機(jī)械完整性，而NC將變脆和掉色。PVDF膜印跡可被剝離抗體并被重新探測(cè)，而NC印跡不可。NC有被空氣氧化的傾向，這可能是危險(xiǎn)的。其需要單獨(dú)的廢物流，當(dāng)處理時(shí)需要用濕潤劑(通常為水)濕潤。疏水的PVDF印跡膜具有與NC印跡膜相同的蛋白結(jié)合能力，但顯示出更好的印跡3性能。在同樣的條件下，與NC相比，這些PVDF膜能檢測(cè)到低得多的樣品濃度。低背景熒光疏水PVDF印跡膜在使用熒光檢測(cè)方案的同時(shí)表現(xiàn)出同樣增強(qiáng)的樣品檢測(cè)能力。因此需要提供親水的PVDF膜用于諸如蛋白質(zhì)印跡的免疫檢測(cè)試驗(yàn)，其可以獲得更低的樣品檢測(cè)限和疏水PVDF膜的低背景熒光。本發(fā)明滿足了這些需要。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明概述用于改變基質(zhì)表面能，尤其是關(guān)于意圖接觸生物系統(tǒng)的表面的表面修飾領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)同意，親水表面修飾通常顯示出低的蛋白質(zhì)結(jié)合性質(zhì)。本文中公開的實(shí)施方案偶然且意料不到地發(fā)現(xiàn)，來源自某種單體丙烯酰胺混合物、并且使用自由基聚合反應(yīng)形成的立體聚合物可獲得親水且顯示高蛋白結(jié)合水平的表面修飾。許多現(xiàn)有技術(shù)描述了含羥基單體、通常為含羰基酯的丙烯酸酯聚合物在制備具有親水性質(zhì)和對(duì)蛋白結(jié)合的高度抗性的膜表面修飾中的應(yīng)用。然而，已知這類單體的聚合物不耐強(qiáng)堿溶液。例如1.0當(dāng)量的氫氧化鈉溶液將含羰基的丙烯酸酯聚合物水解為含丙烯酸的聚合物。這樣的含丙烯酸的聚合物在特定PH條件下是帶離子電荷的，并將吸引和結(jié)合相反電荷的蛋白或生物分子，由此增加吸著和膜的污染。此外，含丙烯酸的聚合物在水中膨脹至一定的程度，使得孔通道收縮，由此降低了膜通透性和生產(chǎn)率。而且，由含羥基單體構(gòu)成的聚合物，例如羥基丙烯酸酯進(jìn)一步在強(qiáng)堿溶液中反應(yīng)，降解成可溶的低分子量片段，其溶解并暴露了下面的底物多孔介質(zhì)或膜。在藥學(xué)和生物技術(shù)工業(yè)中，試圖開發(fā)用于過濾或非過濾應(yīng)用的優(yōu)化的膜的從業(yè)者們需要克服重要的問題。面對(duì)嚴(yán)格的費(fèi)用、性能和安全性需要，從業(yè)者必須利用材料，開發(fā)生產(chǎn)這樣的膜的生產(chǎn)方法其不僅具有優(yōu)化了的流動(dòng)和保留特征，還是生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)、符合清潔標(biāo)準(zhǔn)且對(duì)于經(jīng)常遇到的各種化學(xué)環(huán)境穩(wěn)定的，并且依賴于所需的最終目的具有對(duì)生物分子吸附的強(qiáng)烈抗性或強(qiáng)力吸附生物分子。這樣，在這種情況下，非常需要一種膜修飾，其能產(chǎn)生熱穩(wěn)定的、耐受任何潛在的試劑溶液降解的親水、生物分子吸附表面，其所能提取出來的材料水平很低。來自混合丙烯酰胺聚合表面修飾早期研究的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)果表明，當(dāng)用紫外線引發(fā)或電子束引發(fā)的自由基技術(shù)共聚的時(shí)候，親水雙丙烯酰胺交聯(lián)單體和單官能中性或帶電丙烯酰胺的某些混合物能產(chǎn)生高蛋白結(jié)合親水表面修飾。然而，在觀察到滿意的點(diǎn)印跡形態(tài)和印跡轉(zhuǎn)移性能前，每種單體的最初起始水平不得不顯著的下降。本發(fā)明的實(shí)施方案克服了現(xiàn)有技術(shù)的問題，其提供了一種親水性膜，尤其適于印跡使用，優(yōu)選蛋白質(zhì)印跡。更具體而言，預(yù)濕潤的疏水膜基質(zhì)(優(yōu)選由PVDF制備)與單體溶液相接觸，在聚合條件下產(chǎn)生持久親水性的基質(zhì)。所形成的膜顯示低背景熒光、高蛋白結(jié)合、優(yōu)良的蛋白樣品點(diǎn)形態(tài)保持以及擴(kuò)大的動(dòng)態(tài)范圍(高信噪比，提高的樣品可檢測(cè)性)。其中使用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)，未修飾親本膜的固有的背景熒光水平并非是關(guān)鍵的。該膜在蛋白質(zhì)印跡中，尤其在檢測(cè)低樣品濃度檢測(cè)中顯示了比得上常規(guī)硝酸纖維素印跡膜或比常規(guī)硝酸纖維素印跡膜更高的性能，其可以直接用水濕潤，而不需要使用前用醇預(yù)濕潤。所述膜與水接觸后表現(xiàn)出完全、即刻和均一的濕潤，而當(dāng)與飽和的氯化鋁水溶液接觸后表現(xiàn)出延遲的濕潤。即當(dāng)所述膜置于該飽和的氯化鋁水溶液表面時(shí)，其在低于于1秒的最小時(shí)間間隔內(nèi)完全濕潤。圖1為R實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，結(jié)果相應(yīng)于表1提供的實(shí)驗(yàn)條件。圖2為S實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，結(jié)果相應(yīng)于表2提供的實(shí)驗(yàn)條件。圖3為T實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，結(jié)果相應(yīng)于表3提供的實(shí)驗(yàn)條件。詳細(xì)說明根據(jù)本公開文本實(shí)施方式的親水性修飾的膜提供了這樣的免疫檢測(cè)試驗(yàn)平臺(tái)，其具有比得上硝酸纖維素膜或比硝酸纖維素膜更好的印跡性能，尤其是在擴(kuò)展樣品可檢測(cè)性動(dòng)態(tài)范圍下限方面。例如，在圖1中，典型試驗(yàn)得到的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明了本發(fā)明的親水性PVDF印跡膜和對(duì)照(FL-疏水PVDF膜，NC-Whatman/S&SBA-85膜)之間的性能差異。圖中每個(gè)水平條帶含有5個(gè)分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移印跡，三個(gè)印跡在親水性PVDF研制的樣品上，每個(gè)對(duì)照膜各一個(gè)。5個(gè)蛋白質(zhì)印跡的每個(gè)水平條帶均為一次電泳和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(每次實(shí)驗(yàn)中使用5個(gè)凝膠然后5個(gè)印跡)。通過設(shè)計(jì)，電泳和轉(zhuǎn)移前，每次實(shí)驗(yàn)在每個(gè)具有相同量蛋白樣品(每個(gè)凝膠應(yīng)用4個(gè)泳道)的凝膠/印跡方面具備同樣的條件。顯示的結(jié)果為記錄(化學(xué)發(fā)光)的轉(zhuǎn)移印跡，用于從復(fù)雜的樣品混合物(溶胞產(chǎn)物)中檢測(cè)2種蛋白(HSP70和GAPDH)。使用遞減的樣品濃度，每片凝膠上從左到右相應(yīng)于5yg、2.5yg、1.25iig、0.67iig。適當(dāng)?shù)亩嗫啄ぐ切┯煞枷沩烤酆衔?、聚四氟乙烯、全氟熱塑聚合物、聚烯烴聚合物、超高分子量聚乙烯、聚酰胺類(包括尼龍6和尼龍66)以及聚偏氟乙烯形成的多孔膜，尤其優(yōu)選聚偏氟乙烯。多孔膜包括微孔膜和超濾膜，優(yōu)選是片的形式。通常平均孔大小包括那些在0.001和10微米之間的。印跡膜通常是0.45iim孔大小的材料。優(yōu)選的起始膜具有的孔隙率(空體積)范圍為68-73%。印跡膜通常是對(duì)稱的，然而，也可對(duì)不對(duì)稱的膜應(yīng)用涂層。聚合涂層可以是共聚物或三元共聚物，所述共聚物或三元共聚物由至少一種用至少一種親水性官能團(tuán)修飾的多官能單體形成，所述親水性多官能單體選自多官能丙烯酰胺、多官能異丁烯酰胺和二丙烯基哌嗪，和由至少一種用至少一種親水性官能團(tuán)修飾的單官能單體形成，所述親水性單官能單體選自單官能丙烯酰胺、單官能異丁烯酰胺和丙烯基哌嗪。已發(fā)現(xiàn)多孔疏水膜，優(yōu)選由涂層了交聯(lián)丙烯酰胺_亞甲基雙丙烯酰胺共聚物的聚偏氟乙烯制備的膜，可制成高度親水性的。進(jìn)一步的，在本發(fā)明的早期重復(fù)中應(yīng)用于多孔PVDF膜樣品的共聚物水平下，IgG結(jié)合試驗(yàn)表明蛋白結(jié)合的水平在400iig/cm2左右。該水平是典型的親本疏水PVDF膜和常規(guī)硝酸纖維素膜的水平。第一個(gè)令人驚訝的結(jié)果是由此制備的膜均為親水性的，并且是高蛋白結(jié)合的。然而，這些最初樣品(表現(xiàn)該高水平蛋白結(jié)合的那些)的蛋白質(zhì)印跡性能在維持小樣品印跡尺寸(印跡形態(tài))和印跡轉(zhuǎn)移中的樣品捕獲方面是不令人滿意的。通過改變共聚物涂層水平，實(shí)現(xiàn)了滿意的印跡性能。在這些改變的水平下，蛋白質(zhì)結(jié)合水平減少至250和325(00)iig/cm2之間，但蛋白質(zhì)印跡性能升高至硝酸纖維素和優(yōu)選的親本疏水PVDF膜之間的水平。令人驚訝的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)結(jié)合水平并非最佳或唯一的蛋白質(zhì)跡膜性能的預(yù)測(cè)者。通過修飾基質(zhì)上的涂層水平犧牲某些蛋白質(zhì)結(jié)合能力可導(dǎo)致改善的印跡性能。這樣，修飾制劑的成分水平和相對(duì)濃度對(duì)于獲得可接受的免疫檢測(cè)試驗(yàn)性能是重要的。高度特異性的成分比例中低的總固體濃度平衡了水濕潤性能和印跡性能之間的關(guān)系。基質(zhì)膜非常低的背景熒光水平也得以保留。但是，如果表面修飾化學(xué)的水平太低，其結(jié)果是膜的水可濕潤性不能達(dá)到可接受程度。如果表面修飾的水平太高，所得到的膜具有非常高的表面能。如前所述，在較高水平的表面修飾化學(xué)下，測(cè)定的蛋白質(zhì)結(jié)合能力基本上與硝酸纖維素和疏水PVDF膜相同，但得到的電印跡性能較差。根據(jù)特定的實(shí)施方案，修飾/反應(yīng)物溶液中的總固體水平調(diào)節(jié)為按重量計(jì)0.90%和1.10%之間。該范圍內(nèi)的總固體濃度與特定的成分比例一起導(dǎo)致了最佳的印跡性能。該制劑包括紫外光引發(fā)劑成分。在反應(yīng)物溶液中，適量的丙烯酰胺單官能單體和雙丙烯酰胺交聯(lián)單體為按重量計(jì)0.20和2.00%之間(各自)，優(yōu)選量為按重量計(jì)O.30%和0.60%之間(各自)，最優(yōu)選為按重量計(jì)0.40%和0.50%之間(包含端點(diǎn)的，各自)。單體反應(yīng)物溶液優(yōu)選的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺比例為約i:1(質(zhì)量/質(zhì)量)。優(yōu)選的，丙烯酰胺亞甲基雙丙烯酰胺單體反應(yīng)物溶液中的總單體濃度為按質(zhì)量計(jì)0.5%和1.5%之間。適當(dāng)?shù)淖贤夤庖l(fā)劑成分為按重量計(jì)0.01%到0.20%，優(yōu)選按重量計(jì)0.05%到0.15%，最優(yōu)選為按重量計(jì)0.09%到0.11%。適當(dāng)?shù)淖贤夤庖l(fā)劑包括Irgacure500、754、2959和819DW。根據(jù)特定的實(shí)施方案，用于制備所述修飾的多孔膜基質(zhì)的方法包括下列步驟提供多孔膜基質(zhì)，使所述多孔膜基質(zhì)的表面與包含丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺以及適當(dāng)?shù)墓庖l(fā)劑的反應(yīng)物溶液接觸，從溶液中除去膜，以及通過在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔內(nèi)將膜基質(zhì)暴露于適當(dāng)波長和強(qiáng)度的輻射下在膜基質(zhì)上原位聚合所述涂層。優(yōu)選的所述與反應(yīng)溶液接觸的多孔膜用紫外光源照射?？梢允褂脼V光器來減少或消除對(duì)該多孔膜有害的波長。在紫外光下的暴露時(shí)間及其強(qiáng)度對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)物單體溶液的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備如下進(jìn)行將1.OOg丙烯酰胺[H2C=CH-C(0)-NH2]單官能單體，O.80g亞甲基雙丙烯酰胺[H2C(-NH-C(0)CH=CH2)2]交聯(lián)單體和0.20gIrgacure2959光引發(fā)劑溶解于198.OOgMilli-Q⑧水中。需要約2小時(shí)的延長的混合間隔來使得所述交聯(lián)物和光引發(fā)劑完全溶解。更具體而言，所述多孔疏水起始膜通過浸入有機(jī)液體或其水溶液中進(jìn)行預(yù)濕潤，所述有機(jī)液體或其水溶液不使多孔膜膨脹或溶解，并且預(yù)濕潤膜的整個(gè)多孔表面。所述液體可以是低分子量醇，或水和可混合的有機(jī)液體的混合物。合適的液體或組合物包括具有足夠低的表面張力的甲醇、乙醇、異丙醇、其水混合物、丙酮/水混合物以及四氫呋喃/水混合物，以影響對(duì)整個(gè)膜表面的濕潤。該預(yù)濕潤步驟的目的是保證整個(gè)膜表面變成通過水以及隨后的所述水性反應(yīng)物單體溶液可濕潤的。該預(yù)濕潤步驟必須緊跟嚴(yán)格的與水的交換步驟，以除去有機(jī)溶劑。這些預(yù)濕潤溶劑或其水混合物會(huì)對(duì)所需的反應(yīng)物單體聚合作用產(chǎn)生不利影響。隨后將所述水-濕潤的多孔膜浸入反應(yīng)物溶液中，并輕柔攪拌，使得該多孔膜的整個(gè)表面被反應(yīng)物溶液濕潤。只要在浸入反應(yīng)物溶液前從膜上除去過量的水，不會(huì)發(fā)生反應(yīng)物溶液的顯著稀釋。短時(shí)間(2分鐘)后取出樣品，從膜樣品中除去過量的反應(yīng)物溶液。該反應(yīng)物溶6液濕潤的膜在無氧條件下暴露于紫外光輻射下，使得聚合反應(yīng)直接發(fā)生在整個(gè)多孔膜表面上。所得的被涂層的膜表現(xiàn)出當(dāng)與水表面接觸時(shí)，被迅速、完全和徹底均勻濕潤；高水平的蛋白質(zhì)印跡性能；以及高水平的蛋白質(zhì)結(jié)合(>250g/cm2IgG)、由放射標(biāo)記檢測(cè)測(cè)定；以及低背景的熒光(約2000rf滿485nm/535nm激發(fā)/發(fā)射波長，采用TECANGENiosFL熒光讀數(shù)器，檢測(cè)器放大設(shè)定為86，使用Magellan5.0軟件包)、其約為同樣測(cè)量條件下未處理(未修飾的親本疏水)膜背景熒光的2倍。當(dāng)置于飽和的氯化鋁水溶液表面時(shí)，所述膜將在最小時(shí)間間隔(不低于1秒)和最大時(shí)間間隔(可超過60秒)內(nèi)完全濕潤。具體實(shí)施方式實(shí)施例1來自Millipore公司的可商業(yè)獲得的疏水PVDF膜(IPFLOOOOO)浸于甲醇中。取出該膜，浸入水中攪拌1分鐘以提取甲醇。取出膜，浸入新鮮水中另外2分鐘，隨后在浸入反應(yīng)物單體溶液之前再次置于新鮮水中。從膜上除去過量的水，隨后將膜浸入反應(yīng)物單體溶液中，輕柔攪拌2分鐘。隨后在紫外光處理過程中，將膜從兩側(cè)暴露于紫外光下，線速度為15-25fpm?；厥漳ぃ糜谒≈谐ノ捶磻?yīng)的單體和未附著的寡聚物和聚合物。樣品通過以下方式干燥在室溫下空氣中干燥過夜，或在靜力空氣烘箱中于6(TC和8(TC之間干燥10分鐘，或在沖擊式干燥器(imipngementdryer)上以15_25fpm的線速度在90-110。C下干燥。由室內(nèi)TOC(總有機(jī)碳)方法測(cè)定的平均膜可提取物為約1.44iig/cn^，如表1所示。表1-總有機(jī)碳(TOC)_五(5)個(gè)47mm的盤<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用HPLC測(cè)定平均可提取的殘余單體水平。表2中提供了3個(gè)樣品的測(cè)定值。表2.HPLC測(cè)定的可提取單體水平_與表1中所示同樣的樣品。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例2采用實(shí)施例1中所述步驟處理PVDF膜，其洗明、處理?xiàng)l件和反應(yīng)物溶液見表3A-D、4A-D禾卩5A-D所示。COC9CMCMCMCOCOCO彬<z<z<驟驟瞎如<a啦啦4口啦啦<n4n啦如■lisnffl一S^^5S^一起始膜性質(zhì)I流動(dòng)時(shí)間I翁BblPt(psi)孔隙率(%)厚度(Wn)淫抑繼干燥器溫度(F)紫鵬批數(shù)據(jù)長■ml啦驟批次#I登記號(hào)戦薪適邀slf塌&gf5細(xì)daAd長嵌蹈磁啦瞎拔銀SA歐》-5t^啦驟w-^s寸I.zlzool.zo,lIldl寸一.212SHZ0,-;ldlKzl卜ool.卜o,l:kJ一90zl200I.zo.ucil9021200l.zoldd一902卜22H卜01dcJI9S1200Co1Jdl9031Z00l.zcndd一90SlZ00U01:ldlS031/00I.201Jd一902卜22HZ0J!id一寸I.zlZOO1.20l匕d一6§卜C29§2C2i8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3D親水性PVDF蛋白質(zhì)印跡膜的修飾數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5B親水性PVI)F蛋A質(zhì)印跡膜的修飾數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>部分l:診斷部分2:干燥器溫度&線速度變化部分3:孔隙率和厚度變化一起始膜<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[OO54].蛋白質(zhì)樣品使用Bis:Tfis(4-12%)midi梯度凝膠(Invitrogen，WG1402B0X)電泳分離。.使用BioRadtank轉(zhuǎn)移儀(CriterionBlotter#165_6024)在45V下電印跡樣品1小時(shí)15分鐘至實(shí)施例1中制備的親水膜上。將印跡在TBS-T(0.1%吐溫)中洗滌2次(每次3分鐘)。RT下將印跡在含3%NFM(脫脂奶，Carnation)的TBS-T中封閉1小時(shí)。將印跡在TBS-T(0.1%吐溫)中洗滌2次(每次3分鐘)。將印跡與第一抗體在TBS-T中孵育1小時(shí)。將印跡在TBS-T(0.1%吐溫)中洗滌3次(每次5分鐘)。將印跡與第二抗體在TBS-T中孵育1小時(shí)。將印跡在TBS-T(0.1%吐溫)中洗滌4次(每次5分鐘)。采用ECL(MilliporeImmobilon-HRP)禾PX射線膠片可視化蛋白條帶。該方案用于實(shí)施例2中制備的樣品，印跡結(jié)果示于圖1、2和3中。典型的研發(fā)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明了本發(fā)明親水性PVDF印跡膜和對(duì)照(FL-疏水PVDF膜，和NC-Whatman/S&SBA-85膜)的性能差異。圖中每一水平條帶含有5個(gè)分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移印跡；三個(gè)印跡位于親水PVDF開發(fā)的樣品上，每個(gè)對(duì)照膜上一個(gè)。每一條帶的5個(gè)蛋白質(zhì)印跡均來自一個(gè)電泳和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(每次試驗(yàn)使用5個(gè)凝膠)。通過設(shè)計(jì)，電泳和轉(zhuǎn)移前每次試驗(yàn)條件相同，蛋白質(zhì)樣品的量也相同(對(duì)于每個(gè)凝膠應(yīng)用于4個(gè)泳道)。顯示的結(jié)果是從復(fù)雜的樣品混合物(溶胞產(chǎn)物)中檢測(cè)2種蛋白(HSP70和GAPDH)的轉(zhuǎn)移印跡，使用遞減的樣品固體(濃度)，從左到右相應(yīng)于5iig、2.5iig、1.25iig和0.67iig。注意在每一排(單次電泳和電印跡試驗(yàn)的結(jié)果)中，本發(fā)明的三片親水性印跡膜與兩片對(duì)照印跡膜相比較。一片對(duì)照由硝酸纖維素印跡膜(NC)組成，另一對(duì)照是疏水PVDF印跡膜(FL)。在每次單獨(dú)試驗(yàn)的情況下，對(duì)于4個(gè)滴度的分析蛋白質(zhì)溶液，F(xiàn)L膜顯示最高的信號(hào)強(qiáng)度，NC膜顯示了最低的信號(hào)強(qiáng)度?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)比較NC對(duì)照印跡膜和本發(fā)明的親水性PVDF印跡膜的信號(hào)強(qiáng)度時(shí)，在最高的分析樣品滴度下(每個(gè)印跡的左側(cè)端)，NC和親水性PVDF膜顯示了類似的信號(hào)強(qiáng)度。然而，隨著分析樣品滴度(從左到右進(jìn)行)的降低，NC膜的信號(hào)強(qiáng)度下降更快，這表明所述親水性PVDF膜允許檢測(cè)的樣品蛋白質(zhì)濃度比NC膜更低。20權(quán)利要求一種包括聚合基質(zhì)膜的多孔膜，所述聚合基質(zhì)膜表面被包含丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合涂層修飾，其中所述涂層使所述表面成為親水性的，并且其中所述表面具有蛋白質(zhì)結(jié)合能力，其通過IgG結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定為約250-325μg/cm2。2.權(quán)利要求1的多孔膜，其中所述膜的平均總有機(jī)碳水平低于1.5iig/cn^，并且其中由HPLC測(cè)定的可提取單體水平對(duì)于丙烯酰胺來說低于0.02g/cn^，對(duì)于亞甲基雙丙烯酰胺來說低于O.15iig/cm2。3.權(quán)利要求l的多孔膜，其中所述基質(zhì)具有背景熒光值，并且其中所述修飾的膜在同樣測(cè)量條件下顯示約兩倍于所述基質(zhì)背景熒光值的背景熒光。4.權(quán)利要求1或3的多孔膜，其中所述膜基質(zhì)包含聚偏氟乙烯。5.權(quán)利要求1或3的多孔膜，其中單體反應(yīng)物溶液中丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺的比例約為1:1(質(zhì)量/質(zhì)量)。6.權(quán)利要求1或3的多孔膜，其中丙烯酰胺亞甲基雙丙烯酰胺單體反應(yīng)物溶液中總的單體濃度在按質(zhì)量計(jì)0.5%-1.5%之間。7.權(quán)利要求1或3的多孔膜，其中光引發(fā)劑水平在0.01%-0.20%之間。8.—種制備親水性、低背景熒光、高蛋白結(jié)合多孔膜的方法，所述膜包含疏水、低背景熒光、高蛋白結(jié)合的多孔膜基質(zhì)，以及低背景熒光表面修飾，所述方法包括提供疏水、低背景熒光、高蛋白結(jié)合的多孔膜基質(zhì)；使所述多孔膜的表面與單體反應(yīng)物溶液接觸，所述溶液包含丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺以及光引發(fā)劑；從反應(yīng)溶液中除去所述膜；除去過量的反應(yīng)物溶液；在無氧條件下將所述丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺反應(yīng)物溶液直接聚合至整個(gè)疏水多孔膜表面，形成連續(xù)的親水低背景熒光背景涂層；以及干燥所述膜。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述反應(yīng)溶液中丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺的量分別為0.50%和0.40%。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述反應(yīng)溶液中光引發(fā)劑Irgacure2959的量為0.10%。全文摘要本發(fā)明涉及親水的高蛋白結(jié)合的低熒光蛋白質(zhì)印跡膜，所述膜特別適于印跡應(yīng)用、優(yōu)選蛋白質(zhì)印跡。優(yōu)選由PVDF制備的預(yù)濕潤疏水膜基質(zhì)與單體溶液接觸，進(jìn)行紫外光起始的自由基聚合步驟，使得該基質(zhì)具有持久的親水性。所形成的膜顯示低背景熒光、高蛋白結(jié)合、優(yōu)良的蛋白樣品印跡形態(tài)保留以及擴(kuò)大的動(dòng)態(tài)范圍(高信噪比，提高的樣品可檢測(cè)性)。該膜在蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用中，尤其在低樣品濃度蛋白檢測(cè)中顯示了比得上常規(guī)硝酸纖維素蛋白質(zhì)印跡膜或比常規(guī)硝酸纖維素蛋白質(zhì)印跡膜更高的性能，其可以直接用水濕潤，而不需要使用前用醇預(yù)濕潤。文檔編號(hào)B01J20/285GK101703923SQ20091017338公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年8月17日優(yōu)先權(quán)日2008年8月18日發(fā)明者A·彼得斯,A·德代奧,D·布魯斯特,J·查庫迪安,N·索伊斯,P·戈達(dá)申請(qǐng)人:米利波爾有限公司