佐呂間湖生芽孢八疊球菌及其篩選方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】佐呂間湖生芽孢八疊球菌及其篩選方法與應(yīng)用，涉及廢水處理。佐呂間湖生芽孢八疊球菌(Sporosarcina saromensis)M52篩選方法：取沉積物加入盛有已滅好菌含5mMCr6+的2216L液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖床中富集培養(yǎng)7天；第一個富集周期結(jié)束后，取獲得的富集菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的2216L液體培養(yǎng)基，置于搖床中培養(yǎng)；第二個富集周期結(jié)束后，取獲得的菌液轉(zhuǎn)接到2216L液體培養(yǎng)基，置于恒搖床中培養(yǎng)；將獲得的富集液按體積比10倍等比稀釋，取10-6、10-7、10-8濃度菌液涂布在2216L固體培養(yǎng)基上，反復(fù)平板劃線，分離純化，即得。可在制備六價鉻吸附劑中應(yīng)用，并用于含六價鉻污染廢水的處理。
CCTCC NO：M 2014623
20141204
【專利說明】佐呂間湖生芽孢八疊球菌及其篩選方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及廢水處理，尤其是涉及佐呂間湖生芽孢八疊球菌及其篩選方法與應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鉻是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的重金屬元素。據(jù)中華人民共和國環(huán)境保護部公 布的《2012年中國環(huán)境統(tǒng)計年報》顯示，2012年，工業(yè)廢水中六價鉻及總鉻的排放量分別為 70. 4噸和188. 6噸。六價鉻因具有強氧化性和腐蝕性，又有透過生物膜的作用，容易進入細 胞內(nèi)引發(fā)很強的毒性作用，其毒性比三價鉻大100倍。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC)及美國政 府工業(yè)衛(wèi)生學家協(xié)會（ACGIH)均已明確六價鉻化合物具有致癌性。因此，研究其處理技術(shù) 對保護生態(tài)環(huán)境和人類健康意義重大。
[0003] 傳統(tǒng)的物理化學處理廢水方法主要有沉淀，吸附，電解，膜分離等。但這些方法普 遍存在投資成本高，存在二次污染，對痕量重金屬處理效果差等缺點。隨著分子生物學、基 因工程技術(shù)的發(fā)展，在重金屬廢水治理應(yīng)用中，生物技術(shù)顯現(xiàn)出巨大發(fā)展?jié)摿?，且具有成?低、效益1?、不造成-次污染等優(yōu)點。
[0004] 研究表明，微生物能通過各種機制達到對重金屬的抗性和去除作用。某些微生物 能在極端環(huán)境下存活并生長，表現(xiàn)出對重金屬的抗性；有些微生物還能通過轉(zhuǎn)化或生理代 謝使重金屬從高毒狀態(tài)變?yōu)榈投緺顟B(tài)，這種行為稱為微生物對重金屬的抗性和解毒機制。 因此采用微生物技術(shù)處理含六價鉻的各類廢水具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來，國際上在微 生物處理重金屬廢水的研究中雖然取得了較大進展，但在后續(xù)開發(fā)生物吸附劑方面主要集 中在真菌、藻類和酵母等，而細菌報道較少。細菌因其分布廣、生物量巨大及其顯著的親金 屬特性，實為理想的吸附材料。抗重金屬菌株的分離篩選在重金屬吸附劑制備方面同樣展 現(xiàn)了巨大潛力。
[0005] 中國專利CN104163499A公開一株螯臺球菌在廢水處理中的應(yīng)用，該菌株為螯臺 球菌（Chelatococcus daeguensis)TADl，保藏編號為 CGMCC 勵.5226，螯臺球菌0611〇：5226 用于同步去除廢水中的氮素和六價鉻。該菌株對溫度的適應(yīng)具有廣譜性，在30?50°C均 有較高的去除效率，菌株主要將Cr (VI)還原為毒性較小的Cr (III)、部分氮素還原為N2或 N20,因此該菌株可實現(xiàn)同步脫除氮素、Cr(VI)、碳素，在污染水體修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前 旦 -5^ 〇
[0006] 中國專利CN101429487公開一株對六價鉻有還原作用的間孢囊菌Q5-1及其在凈 化廢水中鉻污染方面的應(yīng)用。從湖南一錳礦土壤中分離得到一株對對六價鉻有還原作用的 間孢囊菌Q5-1。該菌株可以將含鉻廢水中的六價鉻還原為三價鉻，極大地降低了廢水中鉻 的毒性。該菌株被命名為間孢囊菌〇5-1(111^^8口0四叩13〇636 8口.）(>)5-1，是一株新發(fā)現(xiàn)的 鉻還原細菌，其保藏號為CCTCC NO :M208239。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52〇
[0008] 本發(fā)明的第二目的在于提供佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52的篩選方法。
[0009] 本發(fā)明的第三目的在于提供佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52 的應(yīng)用。
[0010] 所述佐呂間湖生芽抱八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52已于2014年 12月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，郵箱430072,保藏 中心保藏編號為：CCTCC NO :M 2014623。所述佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina Sar〇men SiS)M52從廈門市集美區(qū)馬鑾灣近海沉積物中分離篩選得到。經(jīng)鑒定，所述佐 呂間湖生芽抱八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52,其16s rDNA序列與模式菌株 Sporosarcina saromensis HG645(T)AB243859 相似性為 100%。
[0011] 所述佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52的篩選方法如 下：
[0012] 1)取2g沉積物加入盛有30mL已滅好菌含5mMCr6+的2216L液體培養(yǎng)基的錐形瓶 中，隨后置于28°C，200r/min恒溫搖床中富集培養(yǎng)7天；
[0013] 2)第一個富集周期結(jié)束后，取獲得的富集菌液按體積比1 : 30轉(zhuǎn)接到新鮮的 30mL 2216L液體培養(yǎng)基，繼續(xù)置于28°C，200r/min恒溫搖床中培養(yǎng)7天；
[0014] 3)第二個富集周期結(jié)束后，取獲得的菌液按體積比1 : 100轉(zhuǎn)接到新鮮的30mL 2216L液體培養(yǎng)基，繼續(xù)置于28°C，200r/min恒溫搖床中培養(yǎng)7天；
[0015] 4)將獲得的富集液按體積比10倍等比稀釋，取10'10'KT8濃度菌液涂布 在2216L固體培養(yǎng)基上，反復(fù)平板劃線，分離純化，最終得到佐呂間湖生芽孢八疊球菌 (Sporosarcina saromensis)M52〇
[0016] 所述2216L液體培養(yǎng)基的組成可為：乙酸鈉lg，蛋白胨10g，酵母粉2g，普通肉汁 〇. 5g，檸檬酸三鈉0. 5g，硝酸銨0. 2g，過濾海水1L，pH7. 5?7. 6,磷酸二氫鉀0. 5g/L，其中， 磷酸二氫鉀滅菌后加入，母液l〇〇g/L，滅菌后，每升培養(yǎng)基加5ml。
[0017] 所述2216L固體培養(yǎng)基的組成可為：乙酸鈉lg，蛋白胨10g，酵母粉2g，普通肉汁 〇. 5g，檸檬酸三鈉0. 5g，硝酸銨0. 2g，過濾海水1L，pH7. 5?7. 6,瓊脂粉15g/L，磷酸二氫鉀 0. 5g/L，其中，磷酸二氫鉀滅菌后加入，母液100g/L，滅菌后，每升培養(yǎng)基加5ml。
[0018] 經(jīng)試驗，所述佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52在 pH7. 6,溫度 28°C，含 Cr6+ 約 50 ii g/mL 的 2216L 液體培養(yǎng)基中，150r/min 培養(yǎng) 24h，對 Cr6+ 去除率達93. 61 %。其中Cr6+測量方法采用《生活飲用水標準檢驗方法金屬指標》（GB/T 5750. 6-2006)中所述二苯碳酰二肼分光光度法。由此可見，所述佐呂間湖生芽孢八疊球菌 (Sporosarcina saromensis)M52可在制備六價鉻吸附劑中應(yīng)用，并用于含六價鉻污染廢水 的處理。所述佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52具有六價鉻高耐受 性，并可將其用于重金屬六價鉻污染廢水治理及制備高效六價鉻吸附劑，具有便捷、價優(yōu)、 環(huán)境友好等優(yōu)勢。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為所述佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52的菌落宏 觀形態(tài)圖；
[0020] 圖2為所述佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52的系統(tǒng)發(fā) 育分析樹；
[0021] 圖3為所述佐呂間湖生芽抱八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52的24h去 除六價鉻效果圖。

【具體實施方式】
[0022] 以下結(jié)合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0023] 實施例1 :菌株形態(tài)特征
[0024] 1 ?形態(tài)特征
[0025] 將單克隆菌落劃線接種至2216L固體培養(yǎng)基中，將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱，28°C 培養(yǎng)2天，菌落呈圓形，米黃色半透明，表面光滑偏濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，中央凸起， 直徑1mm，見圖1。
[0026] 實施例2 :菌株的篩選和鑒定
[0027] (1)首先，取約2g沉積物加入盛有30mL含5mMCr6+的2216L液體培養(yǎng)基的錐形瓶 中，隨后置于28°C，200r/min恒溫搖床中富集培養(yǎng)7天。
[0028] (2)第一個富集周期結(jié)束后，取獲得的富集菌液按1 : 30比例轉(zhuǎn)接到新鮮的30mL 含5mMCr6+的2216L液體培養(yǎng)基，繼續(xù)置于28°C，200r/min恒溫搖床中培養(yǎng)7天。
[0029] (3)第二個富集周期結(jié)束后，去獲得的菌液按1 : 100比例轉(zhuǎn)接，重復(fù)上述操作再 次培養(yǎng)7天。
[0030] (4)最后獲得富集液十倍等比稀釋，取10_6、10_7、10_ 8濃度菌液均勻涂布在2216L 固體培養(yǎng)基上。在恒溫培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)48h，獲得單菌落。
[0031] 反復(fù)三線法劃線繼續(xù)純化所得單菌落，最后獲得純菌落菌株，命名為M52。
[0032] 其中，2216L液體培養(yǎng)基的組成是：乙酸鈉lg，蛋白胨10g，酵母粉2g，普通肉汁 〇. 5g，檸檬酸三鈉0. 5g，硝酸銨0. 2g，磷酸二氫鉀0. 5g溶于1L過濾海水中，調(diào)節(jié)pH7. 5? 7. 6 ;2216L固體培養(yǎng)基在2216L培養(yǎng)基中加入15g瓊脂；
[0033] 上述的液體和固體培養(yǎng)基均在121°C下滅菌20min后使用。
[0034] 本發(fā)明的菌株M52的16S rDNA序列長度為1423bp，與模式菌株Sporosarcina saromensis HG645(T)AB243859 相似性為 100%。
[0035] 實施例3 :系統(tǒng)發(fā)育分析
[0036] 將所得到的16S rDNA序列通過NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心）的Blast程 序與數(shù)據(jù)庫（醫(yī)w. ncbi.nlm. nih. gov/B last)中已有的16S rDNA核酸序列進行相似性比 較分析。用ClustalX進行序列比對后采用Mega6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。該菌株的系 統(tǒng)發(fā)育分析樹（neighbor-joining tree)見圖2。
[0037] 實施例4 :本發(fā)明的菌株對六價鉻的去除效果
[0038] 本發(fā)明菌株M52在pH7. 6,溫度28°C，含Cr6+約50 ii g/mL的2216L液體培養(yǎng)基中， 150r/min培養(yǎng)24h，分別于4h，8h，12h，16h，20h，24h測量Cr6+的殘留量并計算去除率。結(jié) 果顯示其24h對Cr 6+的去除率高達93. 61%。見圖3所示。
[0039] 實施例5 :本發(fā)明的菌株處理廢水的模擬應(yīng)用
[0040] 將分離純化出的本發(fā)明菌株M52純菌落挑取于2216L液體培養(yǎng)基中，置于28°C， 180r/min的搖床中培養(yǎng)16h。之后將菌液轉(zhuǎn)接入模擬廢水中，在pH7.6,溫度28°C條件下， 處理24h后測定其對六價鉻的去除效果。實驗結(jié)果如表1所示。
[0041] 表 1
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 菌株佐呂間湖生芽抱八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52,已于2014年12月 4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心保藏編號為：CCTCC NO :M 2014623。
2. 如權(quán)利要求1所述菌株的篩選方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 取2g沉積物加入盛有30mL已滅好菌含5mMCr6+的2216L液體培養(yǎng)基的錐形瓶中， 隨后置于28°C，200r/min恒溫搖床中富集培養(yǎng)7天； 2) 第一個富集周期結(jié)束后，取獲得的富集菌液按體積比1 : 30轉(zhuǎn)接到新鮮的30mL 2216L液體培養(yǎng)基，繼續(xù)置于28°C，200r/min恒溫搖床中培養(yǎng)7天； 3) 第二個富集周期結(jié)束后，取獲得的菌液按體積比1 : 100轉(zhuǎn)接到新鮮的30mL2216L 液體培養(yǎng)基，繼續(xù)置于28°C，200r/min恒溫搖床中培養(yǎng)7天； 4) 將獲得的富集液按體積比10倍等比稀釋，取10_6、10_7、10_8濃度菌液涂布在2216L固 體培養(yǎng)基上，反復(fù)平板劃線，分離純化，最終得到佐呂間湖生芽孢八疊球菌（Sporosarcina saromensis)M52〇
3. 如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于所述2216L液體培養(yǎng)基的組成為：乙酸鈉 lg，蛋 白胨l〇g，酵母粉2g，普通肉汁0. 5g，檸檬酸三鈉0. 5g，硝酸銨0. 2g，過濾海水lL，pH7. 5? 7. 6,磷酸二氫鉀0. 5g/L，其中，磷酸二氫鉀滅菌后加入，母液100g/L，滅菌后，每升培養(yǎng)基 加 5ml。
4. 如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于所述2216L固體培養(yǎng)基的組成為：乙酸鈉 lg，蛋 白胨l〇g，酵母粉2g，普通肉汁0. 5g，檸檬酸三鈉0. 5g，硝酸銨0. 2g，過濾海水lL，pH7. 5? 7. 6,瓊脂粉15g/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，其中，磷酸二氫鉀滅菌后加入，母液100g/L，滅菌 后，每升培養(yǎng)基加5ml。
5. 如權(quán)利要求1所述菌株在制備六價鉻吸附劑中應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于所述六價鉻吸附劑用于含六價鉻污染廢水的處 理。
【文檔編號】C02F1/28GK104450589SQ201410819443
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】趙苒, 王碧, 郭東北, 蔡慶濤, 王娟, 閆雙雙, 劉敏, 范春 申請人:廈門大學