一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領(lǐng)域，涉及一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑及應(yīng)用。一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑，所述的酶制劑為水溶液或緩沖溶液，包含一種鄰硝基苯甲酸降解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，以及終濃度為0.1-0.3mM的MgCl2，反應(yīng)體系pH值為6.0-8.0。酶制劑為緩沖溶液時，該緩沖溶液一般為pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液。
【專利說明】一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領(lǐng)域，涉及ー種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國化學(xué)エ業(yè)的快速發(fā)展，有機合成所產(chǎn)三廢(廢水、廢氣、廢渣)產(chǎn)生量呈逐年遞增之勢。上述三廢中存在大量對生物體有毒害作用的物質(zhì)，對環(huán)境造成了極為嚴(yán)重的污染和危害，威脅到人類和其它生物的安全和健康。其中，又以硝基芳香化合物的相關(guān)污染問題最為關(guān)出。
[0003]硝基芳香化合物廣泛存在于自然界中，主要應(yīng)用于染料、殺蟲劑、炸藥、農(nóng)藥、醫(yī)藥及其它化工產(chǎn)品的生產(chǎn)。隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，進(jìn)入到環(huán)境中的硝基芳香化合物日益增多，給人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。此外，由于硝基和苯環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，使得硝基芳香化合物比其它化合物更難于生物降解。如何減少和去除此類化合物對生態(tài)環(huán)境的危害，已成為全社會共同關(guān)注的熱點問題。
[0004]硝基芳香化合物的去除主要有物理法、化學(xué)法和微生物降解法三種。物理和化學(xué)方法雖然能夠有效去除此類物質(zhì)，但成本高，需要特制的儀器和裝備，且酸、堿易腐蝕，具有一定的危險性。實際上，硝基芳香化合物在環(huán)境中的降解和轉(zhuǎn)化主要是由微生物完成的(微生物對其的代謝多通過一系列酶促反應(yīng)完成)。因此，如何充分利用好功能微生物資源，去除特異性污染物，成為了修復(fù)相關(guān)環(huán)境的迫切需要。
[0005]鄰硝基苯甲酸(2-NBA)是有機合成和制備染料、香料，潤滑脂和潤滑油的抗氧劑和金銹劑等的重要中間體，其エ業(yè)需求量十分巨大。該物質(zhì)對環(huán)境有危害，會對水體和大氣造成污染，易在大氣化學(xué)和大氣物理變化中形成酸雨。當(dāng)PH值降到5.0以下吋，2-NBA會給動、植物造成嚴(yán)重危害，魚的繁`殖和發(fā)育會受到嚴(yán)重影響。此外，水體酸化還會導(dǎo)致水生生物的組成結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，耐酸的藻類、真菌增多，而有根植物、細(xì)菌和脊椎動物減少，有機物的分解率降低。如何高效、低成本，且環(huán)境友好的去除2-NBA頗具研究意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑。
[0007]本發(fā)明的另ー目的是提供該酶制劑的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0009]一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑，所述的酶制劑為水溶液或緩沖溶液，包含ー種鄰硝基苯甲酸降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，以及終濃度為0.1-0.3mM的MgCl2,反應(yīng)體系pH值為6.0-8.0。酶制劑為緩沖溶液吋，該緩沖溶液一般為pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液。進(jìn)ー步的，所述的鄰硝基苯甲酸降解酶的純酶含量為0.03-0.1mg / mL。所述的MgCl2終濃度為0.2mM。
[0010]一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑的制備方法，其特征在于:取純化酶液樣本20mL和氯化鎂，用pH值7.5的50mM磷酸鈉緩沖液定容至IL制成酶制劑，酶制劑中氯化鎂的終濃度為 0.1-0.3mM0
[0011]所述純化酶液樣本的制備方法如下:挑取含有重組質(zhì)粒的菌株，該重組質(zhì)粒上含有nbaB基因編碼片段，用LB培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)，待A6tltlnm值為0.6時，加入IPTG至終濃度ImM,隨后于20°C過夜表達(dá)，離心收集細(xì)胞，重懸于50mM pH7.5的磷酸鈉緩沖液，在冰水浴中超聲破碎細(xì)胞——功率為400W超聲波破碎5s，暫停15s，共進(jìn)行60個循環(huán)；隨后，于4°C，1000Og離心30min去除細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶提取液；使用ー站式組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對上述粗酶提取液進(jìn)行純化，獲得純化酶液樣本。
[0012]所述的酶制劑在降解土壤中鄰硝基苯甲酸中的應(yīng)用。應(yīng)用所述酶制劑降解土壌中鄰硝基苯甲酸時，體系溫度為18-36°C，pH為6.0-8.5。
[0013]本發(fā)明從Pseudomonas sp.0NBA-17中克隆得到負(fù)責(zé)2-NBA代謝的基因片段——nbaB。本發(fā)明能夠為2-NBA的降解提供有效的生物技術(shù)手段，對于2-NBA污染環(huán)境的修復(fù)具有重要意義。該菌是假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)的菌株0NBA-17,于2013年9月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC N0.8095。保藏單位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，該菌的分類命名為假單胞困 Pseudomonas sp.。
[0014]本發(fā)明酶制劑的有益效果主要體現(xiàn)在以下幾個方面:
[0015](I)通過優(yōu)選添加金屬化合物，使得本發(fā)明的酶制劑酶活高，降解2-NBA效果優(yōu)
巳
升；
`[0016](2)本發(fā)明的酶制劑，所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制備，成本低，有利于大規(guī)模推廣；
[0017](3)本發(fā)明的酶制劑，采用酶法降解2-NBA，不僅效果好，且操作簡單、安全、所需反應(yīng)條件溫和，不形成二次污染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1 是 Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA (Genomic DNA)電泳檢測圖。
[0019]圖2是pH值對NbaB酶活力的影響圖。
[0020]圖3是不同處理土壤樣品中2-NBA含量變化曲線。
【具體實施方式】
[0021]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)ー步的具體說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0022]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量単位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。
[0023]實施例1Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA (Genomic DNA)的提取
[0024]1.1Pseudomonas sp.0NBA-17 的擴大培養(yǎng)
[0025]在無菌操作環(huán)境下，將-70 °C保存的Pseudomonas sp.0NBA-17以接種針挑取小塊，放置、涂布于Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基之上。28°C，靜置培養(yǎng)3d。挑選單菌落，經(jīng)2次轉(zhuǎn)接，觀察發(fā)現(xiàn)平板上菌落形態(tài)一致(無雜菌)。這里所述的“平板”和Luria-Bertani (LB)固體/液體培養(yǎng)基等均為微生物研究/生產(chǎn)領(lǐng)域常見術(shù)語、培養(yǎng)基、技術(shù)和方法，具體參見《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，等著.分子克隆實驗指南(第三版)[M].黃培堂，等譯.北京:科學(xué)出版社，2008)。下文中如無特別備注或說明，均為微生物研究常用技術(shù)、方法、培養(yǎng)基、試劑和藥品，且均在《分子克隆實驗指南》中有所記錄。
[0026]1.2Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA 的提取
[0027]菌體總DNA的提取采用SDS高鹽沉淀法。挑取LB平板上的單菌落，接至IOOmL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至穩(wěn)定期。離心收集菌體，加等體積的TEN溶液[IOmMTris-Cl (pH8.0), ImM EDTA(pH8.0),0.1M NaCl]洗滌菌體，離心收集菌體，懸浮于 IOmLTE[IOmM Tris-Cl (pH8.0), ImM EDTA(pH8.0)]溶液中，加入 100 y L 溶菌酶(IOOmg / mL)，37°C水浴 lh，加入 40ii L 蛋白酶 K(20mg / mL)，再加入 300 y L20% (w / v% )的 SDS，37°C水浴過夜(約12h)。加入I / 2體積飽和NaCl劇烈振蕩，12000g離心lOmin，上清用等體積酚:氯仿抽提2次，12000g離心lOmin，收集上清，加入等體積TE溶液(稀釋調(diào)整NaCl濃度)，0.6倍體積異丙醇沉淀，12000g離心15min，70% (v / v% )こ醇洗滌沉淀，こ醇揮發(fā)后溶于IOOii L TE中。
[0028]將提取到的菌體總DNA適當(dāng)稀釋后，經(jīng)0.75% (w / v% )瓊脂糖電泳檢測其質(zhì)量(如圖1所示)，發(fā)現(xiàn)所提取的總DNA大部分集中在23kb左右，基本上沒有RNA存在，純度較好，濃度較高。
[0029]實施例22-NBA降解酶編碼基因nbaB的獲得
[0030]經(jīng)過大量的分析實驗，從24對自行設(shè)計的引物中篩選出一對有效擴增引物(分別記為 SEQID N0.3 和 SEQ ID N0.4)。
[0031]nbaB-f, 5，-ACGACCATATGAGTTACCAAAACTTAG-3，(下劃線為 NdeI 酶切位點，基因序列為 SEQ ID N0.3)；
[0032]nbaB-r，5 ’ -CATCAGAATTCGGAAGACCAGGAGC-3 ’(下劃線為 EcoRI 酶切位點，基因序列為 SEQ ID N0.4)。
[0033]25 ii L 擴增體系:10 X Taq DNA 聚合酶反應(yīng)緩沖液 2.5 ii L ;dNTP (25mM) 2 ii L ;引物(25pmol / ii L)各 0.5 ii L ；Mg2+ 緩沖液(25mM) 2.5 u L ;實施例1 中所得總 DNA0.5 y L (約IOOng) ;Taq 酶(5U / u L)0.3u L ；ddH2016.2 u L0 反應(yīng)參數(shù):95°C 預(yù)變性 5min，94°C 變性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸lmin，擴增25個循環(huán)，最后72°C終延伸5min。
[0034]擴增產(chǎn)物經(jīng)0.75% (w / v%)瓊脂糖電泳檢測，發(fā)現(xiàn)擴增片段與預(yù)期大小(1.9kb左右)相符。切取含有nbaB基因擴增片段的凝膠，放入無菌1.5mL離心管中稱重，使用BIOMIGA膠回收純化試劑盒進(jìn)行目的片段回收，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0035]所得PCR產(chǎn)物參照《分子克隆實驗指南》，進(jìn)行TA克隆和后續(xù)操作，克隆用載體PMD19-T及相關(guān)試劑均購自寶生物生物技術(shù)有限公司(TaKaRa，大連)。挑取質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證插入片段大小正確后，挑取克隆子交上海生エ測序。所得nbaB編碼基因序列如SEQ ID N0.2所示，其相應(yīng)氨基酸序列如SEQID N0.1所示?；蛐蛄斜葘ο仁堑卿浢绹鴩疑锛夹g(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站，再經(jīng)BLAST搜索引擎搜尋GenBank完成。
[0036]結(jié)果顯示，同nbaB編碼基因序列同源的功能基因最高序列同源性僅為84%(U49504.1)，且U49504.1指代基因未見其關(guān)于2-NBA降解的報道。而同NbaB氨基酸序列同源的蛋白最高序列同源性僅為82% (YP_987297.1)，且YP_987297.1所指代的雙加氧酶未見其關(guān)于2-NBA降解的報道。
[0037]實施例3表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與純化
[0038]用Nde I和EcoRI消化上述實施例2中的nbaB基因擴增產(chǎn)物，再將片段插入到用上述同種限制性內(nèi)切酶消化過的pET21b(+)載體中。在重組質(zhì)粒中，nbaB基因由17啟動子啟動，表達(dá)產(chǎn)物C端帶有6個組氨酸標(biāo)簽，氨芐青霉素為篩選標(biāo)記。聯(lián)入片段經(jīng)上海生エ測序驗證，以確保PCR過程中沒有引入突變。
[0039]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Escherichia coli BL21 (DE3)，隨后挑取含有重組質(zhì)粒的菌株(編號為Y-6)，經(jīng)上海生エ測序驗證外源基因?qū)肭闆r。Y-6用LB培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)，待A6tltol值為0.6時，加入IPTG至終濃度ImM，隨后于20°C過夜表達(dá)，以避免包涵體產(chǎn)生。離心收集細(xì)胞，重懸于50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，在冰水浴中超聲(功率為400W)破碎細(xì)胞——超聲波破碎5s，暫停15s，共進(jìn)行60個循環(huán)。隨后，于4°C，1000Og離心30min去除細(xì)胞碎片。上清液即為粗酶提取液，低溫保存。該步驟實驗進(jìn)行同時，設(shè)置未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的E.coliBL21 (DE3)作為對照，并同樣進(jìn)行誘導(dǎo)、離心、破碎和收集粗酶提取液等步驟。
[0040]使用ー站式組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(N1-NTA Spin Kit，QIAGEN)對上述粗酶提取液進(jìn)行純化，獲得純化酶液樣本(其中鄰硝基苯甲酸降解酶的純酶含量為2.5mg /mL)，所有操作均在低溫環(huán)境下進(jìn)行。
[0041 ] 實施例4NbaB對2-NBA的作用效果
[0042]采用上述實施例3中的純化酶液樣本，向0.5mL的反應(yīng)體系(含50mM的磷酸鈉緩沖液，pH7.5，25°C )中加入終濃度為200 y M的2-NBA作為反應(yīng)底物，并測定NbaB酶活力。ー個酶活力単位(U)定義為:25°C條件下，毎分鐘轉(zhuǎn)化lymol2-NBA所需的酶量。比活力表示為每毫克蛋白的酶活力單位。`蛋白濃度以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)參照，通過Bradford法測定。2-NBA 含量測定參照 Yoshie Hasegawa 等人的方法(Yoshie Hasegawa et al.2000.A novel degradat ive patnway of2-nitrobenzoate via
[0043]3-hydroxyanthrani late in Pseudomonas fuorescens strain KU-7.FEMSMicrobiology Letters, 190:185-190)進(jìn)行(下同)。
[0044]結(jié)果顯示，上述純化酶液樣本對2-NBA的酶活力為3446U / mg (該值為5次實驗重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1U / mg)，對照(實施例3中提到的未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒E.coliBL21的粗酶提取純化物)無2-NBA降解能力，這也進(jìn)一步證實了實施例2中所得基因片段的功能作用。
[0045]將純化酶液樣本在50°C水浴60min后，再通過上述方法測定酶活力。結(jié)果顯示，酶活力較為穩(wěn)定，保持了 82.1% (該值為4次實驗重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6% )的初始酶活力。
[0046]實施例5反應(yīng)體系pH對酶活性的影響
[0047]參照實施例4準(zhǔn)備反應(yīng)體系，緩沖液仍為50mM的磷酸鈉緩沖液(測試pH值分設(shè)
5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，以 200 ii M 的 2-NBA 為底物，并添加實施例 3 和 4 中提及的純化酶液樣本，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)體系pH值介于6.0和8.0之間時，酶活力保持在較高水平(較高水平指最大酶活性的75%及以上)。實施例6添加金屬化合物對酶活性的影響[0048]參照實施例4準(zhǔn)備反應(yīng)體系，緩沖液為50mM的磷酸鈉緩沖液(pH值7.5)，以200 ii M的2-NBA為底物，添加實施例3_5中提及的純化酶液樣本，以及終濃度為0.2mM的易溶于水的金屬化合物(測試金屬離子包括:氯化鋰、氯化鎂、硝酸銀、氯化鎳、氯化鋅、氯化鎘、氯化銅、氯化亞鐵、氯化鋇和氯化鈷)。同吋，設(shè)置不添加上述測試金屬化合物的處理作為對照。結(jié)果如表1所示，鎳、銀、鋰、銅和鈷離子對酶活有明顯的抑制作用，鋅、亞鐵、鋇和鎘離子對酶活力影響不顯著，鎂離子添加可使酶活力較對照提高28%，達(dá)顯著差異水平。
[0049]表1、金屬離子對酶活力的影響
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑，其特征在于:所述的酶制劑為水溶液或緩沖溶液，包含一種鄰硝基苯甲酸降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，以及終濃度為0.1-0.3mM 的 MgCl2,反應(yīng)體系 pH 值為 6.0-8.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶制劑，其特征在于:所述的鄰硝基苯甲酸降解酶的純酶含量為 0.03-0.1mg / mLo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶制劑，其特征在于:所述的MgCl2終濃度為0.2mM。
4.一種去除鄰硝基苯甲酸的酶制劑的制備方法，其特征在于:取純化酶液樣本20mL和氯化鎂，用pH值7.5的50mM磷酸鈉緩沖液定容至IL制成酶制劑，酶制劑中氯化鎂的終濃度為 0.1-0.3mM0
5.權(quán)利要求1所述的酶制劑的制備方法，其特征在于:所述純化酶液樣本的制備方法如下:挑取含有重組質(zhì)粒的菌株，該重組質(zhì)粒上含有nbaB基因編碼片段，用LB培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)，待A6tltlnm值為0.6時，加入IPTG至終濃度ImM，隨后于20°C過夜表達(dá)，離心收集細(xì)胞，重懸于50mM pH7.5的磷酸鈉緩沖液，在冰水浴中超聲破碎細(xì)胞——功率為400W超聲波破碎5s，暫停15s，共進(jìn)行60個循環(huán)；隨后，于4°C，10000g離心30min去除細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶提取液；使用ー站式組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對上述粗酶提取液進(jìn)行純化，獲得純化酶液樣本。
6.權(quán)利要求1所述的酶制劑在降解土壤中鄰硝基苯甲酸中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用權(quán)利要求1所述酶制劑降解土壤中鄰硝基苯甲酸時，體系溫度為1 8-36°C，pH為6.0-8.5。
【文檔編號】B09C1/10GK103497937SQ201310454350
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】虞方伯, 管莉菠, 駱林平, 單勝道 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)