一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光原理的熒光探針及其制備方法、應(yīng)用和檢測(cè)內(nèi)毒素方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及熒光技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光原理的熒光探針及 其制備方法、應(yīng)用和檢測(cè)內(nèi)毒素方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種成分，又稱之為脂多糖（LPS)，被其污染的臨 床用注射液進(jìn)入人體后可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克以及播散性血管內(nèi)凝血等毒 性反應(yīng)。
[0003] 目前檢測(cè)內(nèi)毒素的方法主要為鱟試驗(yàn)，根據(jù)不同的鱟試劑產(chǎn)品，其具體試驗(yàn)方法 可分為凝膠法、動(dòng)態(tài)濁度法、終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法。凝膠法為半定量檢測(cè) 內(nèi)毒素方法，僅適合樣品內(nèi)毒素的限量檢測(cè)；動(dòng)態(tài)濁度法與動(dòng)態(tài)顯色法需要帶溫育系統(tǒng)的 動(dòng)態(tài)光度測(cè)定儀器及配套軟件；終點(diǎn)顯色法需要配套酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)， 對(duì)軟硬件設(shè)施要求較高，而且動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法所需試劑價(jià)格昂貴，終點(diǎn)濁度法相 對(duì)應(yīng)試劑目前未見(jiàn)商品化產(chǎn)品，其應(yīng)用受到一定限制。
[0004] 目前，上述的內(nèi)毒素檢測(cè)方法中均無(wú)采用熒光分析法，而基于熒光的檢測(cè)方法具 有簡(jiǎn)便、靈敏、快速和直觀的優(yōu)勢(shì)。此外，AIE(aggregation-induced emission，聚集誘 導(dǎo)發(fā)光）特性的熒光探針在分散狀態(tài)時(shí)不發(fā)光，而在聚集狀態(tài)時(shí)發(fā)出強(qiáng)熒光，利用這種特 性研發(fā)了許多檢測(cè)生物活性分子的新方法，例如用于檢測(cè)ATP分子（Manchun Zhao, Ming Wang, Huajie Liu,et al. Continuous on-site label-free ATP fluorometric assay based on aggregation-induced emission of silole. Langmuir 2009,25,676-678 ;Takao Noguchi，Tomohiro Shiraki，Arnab Dawn,et al. Nonlinear fluorescence response driven by ATP-induced self-assembly of guanidinium-tethered tetraphenylethene. Chem. Commun 2012, 48, 8090 - 8092)、檢測(cè)乳酸分子（Xiang Shen，Guanxin Zhang and Deqing Zhang. A new fluorometric turn-on detection of L-lactic acid based on the cascade enzymatic and chemical reactions and the abnormal fluorescent behavior of silole)和檢測(cè)肝素分子（Ming Wang，Deqing Zhang，Guanxin Zhang，et al· The convenient fluorescence turn-on detection of heparin with a silole derivative featuring an ammonium group. Chem Commun 2008,4469 _ 4471)等，原理是利用 AIE 探針 與檢測(cè)底物分子作用后形成聚集體發(fā)出強(qiáng)熒光，從而檢測(cè)ATP、乳酸和肝素等分子。但目前 無(wú)利用ΑΙΕ特性制備用于檢測(cè)LPS熒光探針的報(bào)道，尤其是臨床用注射用液中LPS的定性 和定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光原理的熒光探針及其制備方法、應(yīng)用 和利用熒光探針的聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性和去碘離子熒光淬滅效應(yīng)快速、直觀地定性或定量檢 測(cè)內(nèi)毒素方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)不足的問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光原理的熒光探 針（TPE-Be-I)，其分子式為C 37H3(]INS，結(jié)構(gòu)式為：
[0007]
[0008] 本發(fā)明還提供了上述熒光探針的制備方法，包括下述步驟：
[0009] A、4-(l，2, 2-三苯基乙烯）-苯甲醛（TPE-CH0)的合成：將1-(4-溴苯 基）-1，2,2_三苯基乙烯（TPE-Br)溶于四氫呋喃溶劑中并置于-88°C~_68°C溫度條件下， 緩慢向反應(yīng)瓶中滴加丁基鋰；滴加完畢后，在_88°C~_68°C溫度條件下反應(yīng)，反應(yīng)后將哌 啶緩慢加入反應(yīng)液中形成混合物，之后回到室溫繼續(xù)反應(yīng)；反應(yīng)完畢后，混合物倒入水中， 用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，最后將有機(jī)溶劑蒸干， 以正己烷和二氯甲烷作為洗脫劑通過(guò)柱層析分離得到產(chǎn)物4-(1，2, 2-三苯基乙烯）-苯甲 醛（TPE-CH0);
[0010] B、3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘鹽（Be-I)的合成：將苯并噻唑和碘乙烷溶于 乙腈中進(jìn)行回流反應(yīng)；反應(yīng)完畢后，將沉淀物過(guò)濾，并用乙腈洗滌沉淀物，得到產(chǎn)物3-乙 基-2-甲基-苯并噻唑碘鹽（Be-I ;
[0011] C、熒光探針（TPE-Be-I)的合成：將TPE-CH0和Be-I溶于干燥的乙醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù) 下進(jìn)行回流反應(yīng)；反應(yīng)完畢后，將有機(jī)溶劑蒸干，以二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑通過(guò)柱層析 分離得到產(chǎn)物熒光探針（TPE-Be-I)。
[0012] 在本發(fā)明的熒光探針的制備方法中，在步驟A中，在_88°C~_68°C溫度條件下反 應(yīng)2小時(shí)~4小時(shí)；在常溫下反應(yīng)1小時(shí)~3小時(shí)；在步驟B中，回流反應(yīng)時(shí)間為20小時(shí)~ 28小時(shí)；在步驟C中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行回流反應(yīng)時(shí)間為40小時(shí)~60小時(shí)。
[0013] 在本發(fā)明的焚光探針的制備方法中，在步驟A中，所述1- (4_溴苯基）_1，2, 2_二 苯基乙烯（TPE-Br)與丁基鋰的摩爾比為5 :6 ;所述1-(4-溴苯基）-1，2,2_三苯基乙烯 (TPE-Br)與哌啶的摩爾比為1 :2 ;所述TPE-Br在四氫呋喃溶劑中的摩爾濃度為0. 05mol/ L ~0· 14mol/L〇
[0014] 在本發(fā)明的熒光探針的制備方法中，在步驟B中，所述苯并噻唑與碘乙烷的摩爾 比為1 :2,其中所述苯并噻唑在所述乙腈中的摩爾濃度為0. 25mol/L~0. 4mol/L。
[0015] 在本發(fā)明的熒光探針的制備方法中，在步驟C中，步驟A中得到的產(chǎn)物得到產(chǎn)物 4-(1，2,2-三苯基乙烯）-苯甲醛〇1^-〇10)與步驟8中得到的產(chǎn)物3-乙基-2-甲基-苯 并噻唑碘鹽（Be-I)之間的摩爾比為1 :1，其中步驟A中得到的產(chǎn)物得到產(chǎn)物4-(1，2, 2-三 苯基乙烯）-苯甲醛（TPE-CH0)與步驟B中得到的產(chǎn)物3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘鹽 (Be-I)在所述乙醇中的摩爾濃度分別為0. 03mol/L~0. 04mol/L。
[0016] 本發(fā)明的上述熒光探針可以應(yīng)用于檢測(cè)內(nèi)毒素。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述熒光探針檢測(cè)內(nèi)毒素的方法，包括下述步驟：
[0018] S1、將熒光探針（TPE-Be-I)溶入DMS0溶液中，制備儲(chǔ)存液；
[0019] S2、分別吸取儲(chǔ)存液與待測(cè)溶液進(jìn)行混合，混合均勻得到檢測(cè)反應(yīng)體系；
[0020] S3、對(duì)檢測(cè)反應(yīng)體系的熒光進(jìn)行分析檢測(cè)。
[0021] 在本發(fā)明的熒光探針檢測(cè)內(nèi)毒素的方法中，在步驟S1中，儲(chǔ)存液中熒光探針 (TPE-Be-I)的摩爾濃度為lmmol/L~2mmol/L ;在步驟S2中，所述待測(cè)溶液為臨床用葡萄 糖注射液、HEPES緩沖液或超純水，吸取1 μ L的儲(chǔ)存液與99 μ L的待測(cè)溶液混合，混合均勻 后得到100 μ L的檢測(cè)反應(yīng)體系。
[0022] 在本發(fā)明的熒光探針檢測(cè)內(nèi)毒素的方法中，在步驟S3中，在UV燈激發(fā)下觀察熒光 對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行定性檢測(cè)，UV燈激發(fā)波長(zhǎng)為365nm ;和/或者通過(guò)熒光分光光度儀檢測(cè)熒光強(qiáng) 度，對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行定量檢測(cè)，熒光分光光度儀中使用的激發(fā)波長(zhǎng)為400~450nm，采集500~ 700nm區(qū)間的熒光。
[0023] 實(shí)施本發(fā)明獲得的熒光探針及其制備方法、應(yīng)用和檢測(cè)內(nèi)毒素方法，具有以下有 益效果：
[0024] (1)由于本發(fā)明用于檢測(cè)LPS (內(nèi)毒素）分子的原理是基于該探針的AIE特性和去 碘離子淬滅效應(yīng)，以及熒光探針TPE-Be-I具