一種甲醛熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種甲醛熒光探針其制備方法和應(yīng)用，屬于甲醛探針的制備技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲醛是一種具有特殊刺激性氣味的無色氣體，被確認(rèn)為具有強(qiáng)烈的致癌和促癌作 用，對人的眼睛、鼻、呼吸道和皮膚等易暴露器官產(chǎn)生傷害。目前，環(huán)境中甲醛主要來源于酚 醛及脲醛樹脂、紡織品助劑和防腐劑等人類生產(chǎn)活動，以及某些有機(jī)化合物的代謝和降解。 甲醛也是人體內(nèi)源性物質(zhì)，可以通過氨基脲敏感胺氧化酶和賴氨酸特異性組蛋白去甲基化 酶1等生物酶催化產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，甲醛對人的空間記憶和認(rèn)知能力的形成起著重要作用。 然而，當(dāng)血液中甲醛濃度超標(biāo)時，會導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，比如癌癥、神經(jīng)組織退化、糖尿 病、老年癡呆癥和慢性肝功能紊亂等。因此，發(fā)明一種能快速、方便檢測生理環(huán)境中甲醛具 有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 目前，主要通過分光光度法、電化學(xué)檢測法、氣相色譜法、液相色譜法等檢測手段 來檢測甲醛。這些方法一般適用于檢測水溶液、紡織品和食品中的甲醛，并不適于生物環(huán)境 的甲醛的檢測，因?yàn)樗鼈兊臋z測靈敏度有限并且對生物樣品具有破壞性。近年來，小分子有 機(jī)熒光探針受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注，它與特定目標(biāo)分析物發(fā)生作用后，熒光信號會發(fā)生變 化，以達(dá)到檢測目的。利用熒光探針的熒光分析法具有特異選擇性、高靈敏度、響應(yīng)時間快 等特征，并且對細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)分子進(jìn)行非侵入性成像檢測可以實(shí)時在線，形象具體地觀察到 信號變化。所以，發(fā)明能快速檢測、易觀查信號變化的甲醛熒光探針是非常有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種能快速檢測甲醛的增強(qiáng)型熒光探針，簡稱探針I(yè)I;并 進(jìn)一步提供了探針I(yè)I的制備方法和應(yīng)用。
[0005] 技術(shù)方案 一種甲醛熒光探針，簡稱探針I(yè)I，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0006] 本發(fā)明的甲醛熒光探針，對甲醛的響應(yīng)時間為10秒左右。所述響應(yīng)時間為:本發(fā)明 的甲醛熒光探針作用于含有甲醛的水溶液，采用熒光光譜儀觀察熒光光譜峰值達(dá)到最大所 需時間。
[0007] 本發(fā)明的甲醛熒光探針，能抗乙醛、乙二醛、甲基乙二醛、苯甲醛、丙氨酸、甘氨酸、 絲氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、雙氧水和次氯酸的干擾。特異性好。
[0008] 上述的甲醛熒光探針的合成路線如下：
化合物2即為探針I(yè)I。
[0009] 上述的甲醛熒光探針的制備方法，包括如下步驟： 1) 將羅丹明6G溶解于甲醇中，隨后加入乙二胺，加熱至回流，攪拌反應(yīng)6小時以上;然后 除去反應(yīng)液中的甲醇得到化合物1; 2) 化合物1和四氫鋁鋰混合后用四氫呋喃溶解，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)、常溫和攪拌條件下反 應(yīng)10小時以上;然后加入乙醇、攪拌直到無氣泡冒出，再加入水，之后用二氯甲烷萃取，收集 有機(jī)相;除去有機(jī)相中的水、四氫呋喃和二氯甲烷，得探針I(yè)I。
[0010]上述制備方法，優(yōu)選的， 乙二胺的加入方式為滴加； 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去反應(yīng)液中的甲醇； 步驟2在使用化合物1之前，可以用硅膠層析柱進(jìn)一步純化； 乙醇的加入方式:在攪拌條件下緩慢滴加； 用無水硫酸鈉去除有機(jī)相中的水； 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)相中的四氫呋喃和二氯甲烷； 所得探針I(yè)I，可以用硅膠層析柱進(jìn)一步純化。
[0011] 步驟2中，加入乙醇的作用為消耗過量的四氫鋁鋰。
[0012] 本發(fā)明的上述甲醛焚光探針用于檢測甲醛。包括用于檢測水環(huán)境中的甲醛和生物 樣品的甲醛。
[0013] 上述應(yīng)用，具體的，包括： 觀察加入探針I(yè)I前后待測水環(huán)境的熒光光譜的變化;熒光激發(fā)波長為530 nm; 或者，用肉眼觀察加入探針I(yè)I前后待測水環(huán)境的顏色變化； 或者，在356 nm光源照射下，用肉眼觀察加入探針I(yè)I前后待測水環(huán)境的熒光變化； 或者，觀察加入探針I(yè)I前后待測生物環(huán)境的熒光成像圖的變化。
[0014] 所述生物環(huán)境，可以是活細(xì)胞。
[0015] 所述熒光光譜的變化是指:熒光光譜中，560 nm處的熒光峰值的變化;如果峰值變 大，則說明含有甲醛。優(yōu)選的，采用熒光光譜儀觀察熒光光譜。
[0016] 所述顏色變化是指:含有甲醛的待測水環(huán)境加入探針I(yè)I之后，其顏色變?yōu)榧t色。
[0017] 所述熒光變化是指:在356 nm光源照射下，熒光明顯增強(qiáng)。
[0018] 所述熒光成像圖的變化是指:從觀察不到熒光到觀察到紅色熒光。優(yōu)選的，采用共 聚焦顯微鏡。
[0019] 上述應(yīng)用，具體的，包括以下步驟： (1) 將探針I(yè)I溶于DMF，制成探針母液； (2) 將探針母液加入到待測液中； 用熒光光譜儀測試待測液的熒光光譜，在560nm處的熒光峰值的變化，如果峰值變大， 則說明含有甲醛;其中，熒光光譜儀激發(fā)波長為530 nm; 或者，用肉眼觀察待測液的顏色變化，如果待測液由無色變成紅色，則說明含有甲醛； 或者，在356 nm光源照射下，待測液的熒光增強(qiáng)，則說明含有甲醛； (3)將探針母液加入到生物樣品中，用共聚焦顯微鏡，使用激發(fā)波長為514 nm的光源激 發(fā)，收集550-580 nm范圍的熒光;觀察到紅色熒光，則說明含有甲醛。
[0020]首先，水溶液中的甲醛可以引起探針I(yè)I的熒光光譜變化，因此，可以通過觀察熒光 光譜儀中光譜的變化程度判斷溶液中的甲醛含量，從而定量檢測;其檢測下限為7.7X HT7 mol/L。其次，隨著探針I(yè)I的加入，水溶液中的甲醛與探針I(yè)I反應(yīng)，從而使得含有甲醛的水溶 液的顏色發(fā)生變化；因此，能通過肉眼觀察溶液的顏色變化而判斷溶液中是否含有甲醛及 甲醛的大體濃度。再次，通過共聚焦顯微鏡對孵育了探針I(yè)I和甲醛的活細(xì)胞進(jìn)行熒光成像， 觀察紅色通道熒光信號的變化以達(dá)到比值檢測生物環(huán)境中的甲醛的目的。另外，利用本發(fā) 明的探針I(yè)I，采用熒光光譜儀測試水溶液的甲醛時，在10秒鐘左右熒光光譜的峰值達(dá)到最 大;具備反應(yīng)時間短的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了快速檢測。
[0021 ]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：（1)探針I(yè)I的合成簡單，并且產(chǎn)率較高；（2)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了水溶液中 甲醛的特異性和快速檢測；（3)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞水平中甲醛的檢測。
【附圖說明】
[0022]圖1是實(shí)施例1中化合物1的1H NMR圖譜； 圖2是實(shí)施例1中化合物1的13C NMR圖譜； 圖3是實(shí)施例1中探針I(yè)I的1H NMR圖譜； 圖4是實(shí)施例1中探針I(yè)I的13C NMR圖譜； 圖5是實(shí)施例2中探針I(yè)I隨不同量甲醛的加入熒光譜圖的變化情況；圖中，從下至上，甲 醛濃度依次為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20以111〇1/1的熒光光譜； 圖6是肉眼觀察到探針11(10以111〇1/1)在?83緩沖溶液(濃度25 111111〇1/14!17.4，含50% DMiO與2當(dāng)量甲醛在自然光(上)和便攜式紫外燈365 nm光源照射(下)條件下的變化； 圖7是實(shí)施例3中探針I(yè)I與2當(dāng)量甲醛在2min內(nèi)，560 nm處熒光強(qiáng)度值隨時間變化的變 化圖； 圖8是實(shí)施例4中探針I(yè)I對不同干擾分析物的選擇性柱狀熒光數(shù)據(jù)圖；圖中，1，空白；2， 甲醛;3,乙醛;4,乙二醛;5,甲基乙二醛;6,苯甲醛;7,絲氨酸;8,丙氨酸;9,甘氨酸；10,精氨 酸;11，葡萄糖;12，半胱氨酸;13，谷胱甘肽;14，雙氧水;15，次氯酸； 圖9是實(shí)施例5中探針I(yè)I與HeLa細(xì)胞中甲醛響應(yīng)的熒光成像圖；圖中，（a-c)是加入5 μΜ 探針I(yè)I孵育30分鐘后的熒光成像，（d-f)是隨后加入10 ymol/L甲醛繼續(xù)培育20分鐘后的 熒光成像；（a，d)，明場成像；（b，e)，紅色通道熒光成像；（c，f)，明場與紅色通道熒光成 像圖的置加圖；激發(fā)波長為514 nm，標(biāo)尺為20微米。 【具體實(shí)施方式】 [0023] 實(shí)施例1 化合物1的合成：
將480 mg羅丹明6G (分子式為:C28H31N2〇3Cl)(1.0 mmol)溶解于甲醇中，隨后滴加300 mg乙二胺(5.0 mmol)，將反應(yīng)液加熱至70 °C左右，有物質(zhì)開始回流后保持恒溫，攪拌反應(yīng)6 小時，反應(yīng)完畢。反應(yīng)完畢后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾將溶劑（甲醇）除去得到粗產(chǎn)品。以 體積比為3:1的二氯甲烷與乙醇為洗脫劑，用硅膠(200-300目）層析柱進(jìn)行純化，得到342mg 白色固體(產(chǎn)率為 75 %)。咕 NMR (400 MHz, CDCl3)，（ppm): 1.31-1.34 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.90 (s, 6H), 2.33-2.35 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.17-3.24 (m, 4H), 3.52 (3Η), 6.22 (s, 2Η), 6.34 (s, 2Η), 7.05-7.07 (1Η), 7.43-7.49 (m, 2Η), 7.92- 7.94 (1H); 13C 匪R (100 MHz, CDCl3): δ (ppm): 14.72，16.71，38.34，40.69， 43.57, 65.13, 96.51, 105.95, 118.05, 122.80, 123.84, 128.10, 128.25, 131.08, 132.55, 147.47, 151.67, 153.52, 168.75. 探針I(yè)I的合成： 取50 mg化合物1(0.1 mmol)和50 mg四氫錯鋰
（1.3 mmol)置于圓底燒瓶中，加入3 mL 四氫呋喃(溶劑)使反應(yīng)物完全溶解，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和常溫下攪