專利名稱：：一類共軛鏈上β-位氮取代五甲川菁類熒光染料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類共軛鏈上e-位氮取代五甲川菁類熒光染料，屬于生物熒光分析
技術(shù)領(lǐng)域：
所用的熒光染料。
背景技術(shù)：
：熒光染料作為功能性染料逐漸在各個領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用，尤其在生命科學(xué)、臨床醫(yī)療診斷、熒光免疫分析檢測等方面的研究則更是備受關(guān)注。在細胞生物學(xué)上，熒光光譜被用于跟蹤細胞內(nèi)成分的位置和移動情況，另外，細胞的辨別和分類也是依靠以熒光技術(shù)為核心的流式細胞計。因此，具有優(yōu)異光物理性能的熒光染料的開發(fā)是發(fā)展熒光分析技術(shù)的最具決定性的因素。相比其他熒光染料，菁類熒光染料作為熒光染料中的一員在離子探針、生物標記(DNA和蛋白質(zhì)的標記)、活細胞以及活體組織成像應(yīng)用方面有其突出的優(yōu)點，如摩爾消光系數(shù)大、最大吸收發(fā)射波長可以隨著共軛鏈的增長而增加，如五、七甲川菁染料的最大吸收發(fā)射波長達到600nm以上，尤其是七甲川菁染料的吸收發(fā)射波長達到750nm以上接近近紅外區(qū)，能有效降低生物組織的自發(fā)背景熒光?！銇碚f，菁染料的斯托克斯位移只有20nm左右，這不利于染料在生物的應(yīng)用，因為小的斯托克斯位移會造成以下問題(1)染料的吸收光譜和發(fā)射光譜重疊嚴重，會造成染料的自吸收，染料發(fā)射出來的光被自身吸收會降低染料的熒光量子產(chǎn)率(一般在0.2左右)，造成自淬滅。(2)由于染料的斯托克斯位移小，所以染料的最大吸收波長和最大發(fā)射波長靠近，這樣激發(fā)光的散射光會對檢測造成干擾。(3)為了避開散射光的干擾，就不能采用最大吸收波長作為激發(fā)波長或是不能將檢測波長固定在最大發(fā)射波長處，這會降低檢測的靈敏度。以下兩篇文獻中報道了染料斯托克斯位移小會對檢測造成影響(l)Tolosa，L;Nowaczyk，K.;Lakowicz，J.AnIntroductiontoLaserSpectroscopy,2nded.;Kluwer:NewYork,2002.(2)ZhangZ.，AchilefuS.SynthesisandEvaluationofPolyhydroxylatedNear-InfraredCarbocyanineMolecularProbes.Org.Lett.2004，6(12):2067-2070.為了解決以上問題，開發(fā)處具有優(yōu)良光物理性能的熒光染料是非常有意義的。文獻報道在七甲川菁染料的中位連接上氨基后，染料的斯托克斯位移從原來的20nm左右增加到140nm以上，染料的熒光量子產(chǎn)率也提高了。但是，菁染料的共軛鏈越長其光穩(wěn)定性就越差，這就使得七甲川菁染料的應(yīng)用受到限制。相比之下，五甲川菁染料的光穩(wěn)定性要優(yōu)于七甲川菁染料，但是作生物應(yīng)用在存在一些問題，如(1)染料具有小的斯托克斯位移也會造成上述影響。(2)目前的多甲川菁染料一般都是對稱結(jié)構(gòu)，缺少單一的熒光標記反應(yīng)的活性位點。在熒光標記時，熒光菁染料最好在分子中含有一個單一的可活化基團(如羧基等)，用3于特定地衍生反應(yīng)得到理想的熒光探針分子。而為得到這樣含單一羧基的多甲川菁染料，一般方法是合成出不對稱菁染料，在分子的一端引入一個羧基。但這個方法使得染料的合成和分離提純變得復(fù)雜和困難。五甲川菁染料是波長最短的近紅外菁染料，其光穩(wěn)定性相比七甲川菁染料要好很多，因此本發(fā)明專利主要先合成了一系列具有代表性e-氮取代的五甲川菁染料(IIa-g)，然后測試了他們的光物理性能(光譜和光穩(wěn)定性)以及該類染料左右與蛋白質(zhì)通過非共價作用標識劑的應(yīng)用研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是針對當前五甲川菁類熒光染料的斯托克斯位移過小，染料的吸收光譜和自身的發(fā)射光譜重疊太多，容易引起染料的自吸收和自淬滅，最終導(dǎo)致這類染料在生物應(yīng)用時由于激發(fā)光散射等問題使得靈敏度降低的問題，設(shè)計一類在染料的P-位連接上不同氨基的新結(jié)構(gòu)五甲川菁類熒光染料，期望增大染料的斯托克斯位移，解決染料的自吸收和自淬滅問題，提高染料生物應(yīng)用的效果。IIIR7通式I中X=II;R2=(CH2)nR8、(CH2)m0R9、(CHR10CH20)PR9或CH2C6H4R8;R3、R4、R8=H、S03Ru或C02R12;R5=(CH2)nR8、(CH2)m0R9或(CHR10CH20)pR9;R6=(CH2)nR8、(CH2)m0R9、(Cffi^C^O)pR9、間位或?qū)ξ坏腃6H4R17;R9=H或C卜18烷基；R10=H或CH3;Ru=N(R13R14R15R16);R12=C卜18烷基；R13、R14、R15、R16=H、18烷基；(CH2)m0R9或(CHR10CH20)pR9;R17=H、NH2、NHC0R9或(CH2)nR8;n、m、p=0_18。第一、本發(fā)明主要在前人工作的基礎(chǔ)上設(shè)計出了一條新的合成五甲川菁類染料的方法，該方法未見文獻報道，具體過程是利用半反應(yīng)合成路線和witting反應(yīng)合成了共同的中間體，然后以此中間體為基礎(chǔ)合成出了一系列在共軛鏈偏位氨基取代的五甲川菁染料。第二、本發(fā)明針對現(xiàn)有的染料，合成了一些偏位取代的五甲川菁染料，這些染料能選擇性的與DNA、蛋白質(zhì)生物基質(zhì)等作用后熒光有較大幅度增強，具有較好的細胞通透性，在活細胞內(nèi)能選擇性成像。本發(fā)明的有益效果是設(shè)計合成了一類在染料的e-位連接上各種不同氨基取代基后，染料的吸收發(fā)射波長均發(fā)生不同程度的藍移，斯托克斯位移從原來的20nm左右增加到70nm以上，解決了五甲川菁類熒光染料的自吸收和自淬滅問題。本發(fā)明所合成的染料與傳統(tǒng)五甲川菁類熒光染料的生物應(yīng)用相比，本發(fā)明所報道染料與生物基質(zhì)作用后，熒光強度很明顯增加，該類染料與生物基質(zhì)(蛋白質(zhì)，脂質(zhì)體，DNA)作用，表現(xiàn)出很好的選擇性，染料具有活細胞膜通透性，在活細胞染色中表現(xiàn)出很好的選擇性，染料主要染的是活細胞細胞核周圍的脂質(zhì)體。圖l、染料IIc與傳統(tǒng)Cy5的吸收發(fā)射光譜對比(溶劑乙醇，濃度1.0X10—5mol/L).圖2、13-位(偏位)羥乙基氨基取代Cy5(lib:1.OX10—6M)的磷酸緩沖液(pH=7.4)與牛血清蛋白(BSA)的紫外吸收光譜變化滴定，激發(fā)波長520nm。圖3、13-位(偏位)羥乙基氨基取代Cy5(lib:1.OX10—6M)的磷酸緩沖液(pH=7.4)與牛血清蛋白(BSA)的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長520nm。圖4、13-位(偏位)羥乙基氨基取代Cy5(lib:1.OX10—6M)的磷酸緩沖液(pH=7.4)與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的紫外吸收光譜變化滴定，激發(fā)波長520nm。圖5、13-位(偏位)羥乙基氨基取代Cy5(lib:1.OX10—6M)的磷酸緩沖液(pH=7.4)與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的熒光發(fā)射光譜變化滴定，激發(fā)波長520nm。具體實施例方式實施例l中間體的具體合成路線如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(1)吲哚的合成方法是按照fisher吲哚合成方法稱量苯肼54g(0.5mol)加入到250mL兩口瓶中，攪拌下緩慢滴加3_甲基_2_丁酮43g(0.5mol)加熱到70-80°C，反應(yīng)4小時，分去水層，水層用乙醚萃取，與醚層合并后用無水硫酸鎂干燥過濾，減壓蒸出溶劑，即得到粗制的腙70g，收率80X。將上步粗制的腙70g(0.4mol)與150mL冰醋酸混合，在9(TC油浴中反映3小時，冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉水溶液中和水層至中性，分離水相和有機相，水相用乙醚萃取，萃取液與有機相合并，無水硫酸鈉干燥過濾后蒸出乙醚，再減壓蒸餾，收集130-14(TC(0.08-0.09Mp)沸程的餾分。產(chǎn)品為單換色油狀液體52g(收率82%)。[O(HO](2)季銨鹽(1)的合成將3.2g(20mmo1)的2，3，3-三甲基-3H-卩引哚啉和4.7g碘乙烷混合于100mL圓底燒瓶中，加入約30mL甲苯，于氮氣保護下加熱回流7小時，停止加熱冷卻至室溫，過濾生成的固體，用乙醚洗滌得到粉紅色固體季銨鹽5.4g(收率86%)。(3)中間體2的合成將碘化l-乙基-2，3，3-三甲基-3H噴哚啉季銨鹽(12.6g，40mmo1)溶于100mL20X的NaOH溶液中，室溫攪拌lh后，反應(yīng)混合物用無水乙醚萃取(3X50mL)，無水Na2S04干燥，減壓除去乙醚得到淺黃色油狀液體7g，產(chǎn)率94X。由于該油狀物在空氣中久置變紅，故直接做下一步反應(yīng)。(4)中間體3的合成冰浴下，將三氯氧磷(4.7g，30mmo1)逐滴滴入20mL新蒸餾的DMF中，30min滴完后，繼續(xù)攪拌30min，將1(4.5g，25mmo1)溶于15mLDMF中，逐滴加入上述混合物后，9(TC下加熱2h后冷卻，將反應(yīng)液倒入200mL冰水混合物中，Na2C03中和，二氯甲烷萃取(3X50mL)，無水化2504干燥，旋轉(zhuǎn)蒸出溶劑，硅膠柱層析分離純化(石油醚/二氯甲烷l/l(v/v))得到黃色固體4g，產(chǎn)率74%。'H-NMR(400MHz，CDCl3)1.27(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.66(s，6H，CH3)，3.748(q，2H，CH2，J=6.8Hz)，5.42(d，1H，CH，J=9.2Hz)，6.85(d，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.06(t，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.27(t.1H，ArH，J=7.6Hz)，7.28(d，1H，ArH，J=7.6Hz)，10.02(d，1H，CHO，J=9.2Hz);13C-NMR(100MHz，CDC13):11.21,29.69,37.71,47.66,98.64，108.10，122.03，122.55，128.19，139.74，142.66，172.72，186.75;HRMS:m/zcalcdM+forC14H17NO215.1310;found，215.1314.(5)中間體4的合成此合成步驟在文獻報道基礎(chǔ)上將劇毒的溶劑苯換成二氯甲烷。具體操作過程如下將1(7g，37.4mmo1)和三乙胺(4.9g，48.6mmo1)混合于100mL無水二氯甲烷中，在冰浴條件下，將氯乙酰氯(5.03g，44.9mmo1)溶于約20mL二氯甲烷中逐滴滴入上述混合液中，0.5h滴完，然后移去冰浴，反應(yīng)在室溫下繼續(xù)反應(yīng)2h后，水洗，二氯甲烷萃取(3X50mL)，無水Na2S04干燥，減壓除掉溶劑，硅膠柱層析分離(洗脫劑石油醚/二氯甲烷2/l(v/v))得到淺黃色油狀液，逐漸變成固體6.8g，產(chǎn)率70%。'H-NMR(400MHz，CDC13):1.28(t，3H，CH3，J=7.2Hz);1.72(s，6H，CH3);3.80(q，2H，CH2);4.09(s，2H，CH2)，5.57(s，1H，CH)，6.81(1H，ArH，J=7.6Hz)，7.03(t，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.20(t，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.22(d，1H，ArH，J=7.6Hz);13C-NMR(100MHz，CDC13):11.07,22.66,22.81,37.68,48.71,48.59,88.43，108.07，121.96，122.78，127.60，140.23，142.32，172.40，186.33;匪S:m/zcalcdM+forC15H18N0Cl，263.1077;found，271.1085.(6)中間體5的合成2(6.8g，26.2,1)和三苯基膦(10g，40mmo1)溶于100甲苯中，氮氣保護下加熱回流10h，冷卻至室溫，過濾固體產(chǎn)物，無水乙醚洗滌，得到乳白色固體季膦鹽10.5g，產(chǎn)率76.5%。季膦鹽與濕易壞，未經(jīng)進一步處理直接作下一步反應(yīng)。[OO53](7)中間體5的合成將3(10.5g，20翻l)和4(4.3g，20翻l)加入50mL無水甲醇和25mL無水四氫呋喃的混合溶劑中，在冰浴條件下，NaH(lg)分批加入上述混合物中，lh加完后繼續(xù)反應(yīng)2h，移去冰浴，在室溫下攪拌24h，減壓除去溶劑，殘余物用水洗滌，二氯甲烷萃取，無水Na2S04干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸去溶劑，硅膠柱層析分離純化(石油醚/二氯甲烷2/1(v/v))，得到淺黃色油狀物，在空去中逐漸變成黃色固體4.0g，產(chǎn)率約47%。實施例2目標染料的合成(8)染料IIa的合成5(0.425g，lmmo1)溶于10mL無水四氫呋喃中，向其中加入三氯氧磷(0.616g，4mmo1)，氮氣保護下加熱回流lh，溶液由原來的黃色變成藍色，冷卻至室溫，得到中間體6的四氫呋喃溶液，由于6很活潑故不需分離出來直接進行下一步的處理。減壓將溶液蒸干后，再加入10mL四氫呋喃，向其中加入濃氨水的四氫呋喃溶液，邊加變攪拌，直到溶液有藍色變成橙紅色為止，減壓除去溶劑，水洗滌，二氯甲烷萃取，無水Na2S04干燥，減壓除掉溶劑，硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇50/1(v/v))得到紅色固體0.08g，產(chǎn)率約17%。'H-NMR(400MHz，CDC13):1.19(t，3H，CH3，J=7Hz);1.30(t，3H，CH3，J=7Hz);1.51(s，6H，CH3)，1.54(s，6H，CH3);2.24(2H，NH2);3.80(q，2H，CH2，J=6.8Hz);3.92(q，2H，CH2，J=6.4Hz);5.34(s，lH，CH);5.75(d，lH，CH，J=12.8Hz);6.51(d，lH，CH，J=14Hz);6.84(t，2H，ArH，J=6.4Hz);7.01(t，1H，ArH，J=7.2Hz);7.05(d，1H，ArH，J=7.8Hz);7.16(d，1H，ArH，J=7.2Hz);7.23—7.28(4H，ArH);8.00(t，1H，CH，J=12.8Hz)13C-NMR(100MHz，CDC13):11.56，11.64,28.50,28.65,37.73,47.50,48.18,53.45，96.58，108.05，109.18，114.24，121.92，122.20，122.44，122.53，128.08，128.13，138.75，140.03，142.61，146.76，167.22，168.90HRMS:m/zcalcdM+forC29H36N3+，426.2909;found，426.2901實施例3(9)染料IIb的合成75(0.425g，lmmo1)溶于10mL無水四氫呋喃中，向其中加入三氯氧磷(0.616g，4mmo1)，氮氣保護下加熱回流lh，溶液由原來的黃色變成藍色，冷卻至室溫，得到中間體6的四氫呋喃溶液，減壓將溶液蒸干后，再加入10mL四氫呋喃，向其中加入乙醇胺(0.92g，15mmol)的四氫呋喃溶液，邊加變攪拌，直到溶液有藍色變成橙紅色為止，減壓除去溶劑，水洗滌，二氯甲烷萃取，無水Na2S04干燥，減壓除掉溶劑，硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇50/l(v/v))得到紅色固體O.15g，產(chǎn)率約36X。'H-NMR(400MHz，CDC13):1.07(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.30(s，6H，CH3)，1.34(3H，CH3，J=6.8Hz)，1.52(s，6H，CH3)，3.47(t，2H，CH2)，3.72(q，2H，CH2，J=6.8Hz)3.80(q，2H，CH2，J=6.8Hz)，4.01(t，2H，CH2，J=6.8Hz)，4.87(s，1H，CH)，5.79(d，1H，CH，J=13.2Hz)，6.77(t，lH，ArH，J=8Hz)，6.74(d，1H，CH，J=13.2Hz)，6.83(d，lH，ArH，J=8Hz)，6.70(t，1H，ArH，J=8Hz)，7.04(t，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.10(d，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.23(d，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.25(t，1H，ArH，J=8Hz)，7.27(d，1H，ArH，J=8Hz)，7.78(t，1H，CH，J=13.2Hz)，11.09(s，1H，NH)13C-畫R(lOOMHz，CDC13):11.55，11.79，29.47，29.64，29.80，30.68，37.92，39.98，47.32，47.94，50.32，59.20，81.22，96.81，108.29，108.92，114.58，121.87，122.14，122.41，122.51，128.33，128.95，137.79，139.78，142.73，144.51，148.02，167.17，167.82，171.31;HRMS:m/zcalcdM+forC31H4(lN30+470.3166;found，470.3162.實施例4(10)染料IIc的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>合成方法類似于lib的合成Yield:35%.'H-NMRanc^H」HNMR(400MHz，Acetone-d6):1.09(t，3H，CH3，J=6.4Hz)，1.29(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.29(s，6H，CH3);1.60(s，6H，CH3);3.84-3.96(m，8H，CH2，);4.05(t，4H，CH2，J=6.4Hz)，5.58(s，1H，CH)，5.95(d，1HCH，J=11.2Hz)，6.56(d，1H，CH，J=12.4Hz)，6.88(d，1H，ArH，J=8Hz)，6.97(t，1H，ArH，J=7.8Hz)，7.03(t，1H，ArH，J=7.8Hz)，7.13(d，1H，ArH，J=8Hz)，7.18(t，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.27(d，1H，ArH，J=7.8Hz)，7.30(t，1H，ArH，J=7.8Hz)，7.37(d，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.91(t，1H，CH，J=11.2Hz).13C-NMR(100MHz，Acetone-d6):12.24，12.43，14.35,23.33,28.76,32.63,38.73，40.59,48.37,54.76,54.99,57.43,59.57,59.97,85.17,99.68，109.32，109.96，113.19，122.13，122.80，123.07，123.77，128.82，129.12，138.7，141.14，143.39，145.94，152.96，165.51，169.77，171.61.HRMS:m/zcalcdM"forC33H44N302+514.3434;found，514.3449實施例5(ll)染料IId的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>合成方法類似于lib的合成Yield:31%.'H-NMR(400MHz，CDC13):0.86(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.05(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.26(s，6H，CH3);1.37(s，6H，CH3);1.47(t，3H，CH3);1.54(t，3H，CH3);3.71(4H，CH2);3.85(2H，CH2);4.04(q，2H，CH2);4.80(s，lH，CH);6.41(d，1H，CH，J=13.2Hz);6.67(d，1H，CH，J=12.4Hz);6.72(d，1H，ArH，J=7.6Hz);6.95(d，1H，ArH，J=8Hz);7.00(t，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.05(t，1H，ArH，J=7.6Hz);7.11(d，1H，ArH，J=6.8Hz);7.19(t，1H，ArH，J=7.6Hz);7.25(d，1H，ArH，J=7.6Hz);7.29(t，1H，ArH，J=7.6Hz);7.85(t，1H，CH，J=12.4Hz)13C-NMR(100MHz，CDC13):11.85，12.18，12.87，13.45，14.55，22.89，28.76，31.63，38.03，39.99，49.27，55.16，55.99，59.91，85.07，98.99，109.10，109.97，112.59，122.25，122.65，123.47，123.77，128.93，129.65，138.67，141.84，143.99，145.71，152.69，165.53，169.72，171.66.HRMS:m/zcalcdM+forC33H44N3+482.3530;found，482.0822實施例6(12)染料IIe的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>合成方法類似于lib的合成Yield:29%.'H-畫R(400MHz,CDC13):0.90(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.28(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.29(s，6H，CH3);1.44(s，6H，CH3);3.65(q，2H，CH2，J=6.4Hz);3.79(q，2H，CH2，J=6.4Hz);4.71(s，2H，CH2);4.72(s，1H，CH);5.81(d，1H，CH，J=13.2Hz);6.70(d，lH，CH，J=7.6Hz);6.83(d，lH，ArH，J=8Hz);6.96—7.07(4H，ArH);7.18-7.25(4H，ArH);7.32(t，2H，ArH，J=7.6Hz);7.47(d，2H，ArH，J=7.2Hz);7.76(t，1H，CH，J=12.8Hz);12.2(s，1H，NH)13C-NMR(100MHz，CDC13):11.81，12.31，28.23，29.76，39.53，40.12，54.51，82.97，100.35，108.92，109.52，110.85，122.06，122.55，124.46，126.57，127.15，128.59，128.71，129.63，134.69，137.40，140.52，141.96，168.39，172.09;HRMS:m/zcalcdM+forC36H42N3+，516.3373;found，516.3381實施例7(13)染料IIf的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>合成方法類似于lib的合成Yield:29%;力-NMR(400MHz，CDC13):1.09(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.26(s，6H，CH3)，1.37(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.47(s，CH3，6H)，4.06(q，4H，CH2，J=6.8Hz)，4.92(s，4H，CH2)，5.12(s，1H，CH)，6.33(d，1H，CH，J=12.8Hz)，6.65(d，1H，CH，J=12.8Hz)，6.76(d，1H，ArH，J=8Hz)，7.01(t，2H，ArHJ=7.2Hz)，7.10(q，2H，ArH，J=8Hz)，7.21(q，4H，ArH，J=7.6Hz)，7.31(m，4H，ArH)，7.38(t，2H，ArH，J=7.2Hz)，7.44(t，2H，ArH，J=7.2Hz)，7.89(t，1H，CH，J=12.8Hz).13C-NMR(100MHz，CDC13):11.84，12.41，28.48，29.58，39.23，39.73，54.60，83.07，100.28，108.83，109.32，110.18，121.99，122.45，124.43，126.75，127.35，128.56，128.77，129.62，134.63，137.42，140.55，141.95，168.48，171.81;HRMS:m/zcalcdM+forC43H48N3+606.3843;found，606.3832實施例8(14)染料IIg的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>合成方法類似于lib的合成Yield:32%;力-NMR(400MHz，CDC13):1.20(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.26(s，6H，CH3)，1.32(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.47(s，6H，CH3)，3.87(q，4H，CH2，J=6.8Hz)，4.79(s，1H，CH)，5.08(d，1H，CH，J=12.4Hz)，6.04(d，1H，CH，J=12.4Hz)，6.77(d，1H，ArH，J=7.6Hz)，6.87(d，1H，ArH，J=8Hz)，7.03(q，2H，ArH，J=6.4Hz)，7.10(d，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.16(d，lH，ArH，J=7.2Hz)，7.20(t，lH，ArH，J=8Hz)，7.25(d，2H，ArH，J=8Hz)，7.32(t，2H，ArH，J=7.6Hz)，7.62(d，2H，ArH，J=8.0Hz)，7.85(t，1H，CH，J=12.4Hz).13C-NMR(100MHz，CDC13):11.89，11.99，28.66，29.12，29.69，38.14，40.31，47.61，48.19，85.54，98.32，108.67，108.87，121.85，122.22，122.32，122.98，123.57，126.41，128.17，128.32，128.98，138.68，140.07，142.37，144.31，148.85，165.48，168.27HRMS:m/zcalcd,forC35H4。N3+502.3217;found，502.3241實施例9配置濃度為IX10—^化合物I1a-c溶液(溶劑用10mM的PBS緩沖液(pH=7.4))，取染料溶液3mL置于比色皿中，配置一定濃度的牛血清蛋白(BSA)的水溶液，濃度是50ug/uL(750uM)，取BSA溶液滴加到染料溶液中，每加一次等待5分鐘待熒光穩(wěn)定后測定其熒光強度，所用儀器為紫外可見分光光度計，型號；Hp8453;熒光分光光度計，型號FP_6500。實施例10配置濃度為IX10—6M化合物I1a-c溶液(溶劑用10mM的PBS緩沖液(pH=7.4))，取染料溶液3mL置于比色皿中。配置一定濃度的小牛胸腺DNA的水溶液，通過紫外吸收分光光度計測定其260nm處的吸光度值，標定其濃度為1.5X103mM。然后取標定好的小牛胸腺DNA的溶液滴定上述染料溶液，每滴加一次，等待5分鐘后測其熒光強度。所用儀器為紫外可見分光光度計，型號Hp8453;熒光分光光度計，型號FP-6500。實施例11激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察化合物A對活細胞MCF-7的染色N,N-二甲基甲酰胺三氯氧磷[OWO]加配有化合物lie和傳統(tǒng)Cy5濃度為5uM的PBS緩沖液12pL于培養(yǎng)好MCF-7細胞的六孔板中，在37°C，5%C02的細胞培養(yǎng)箱中孵育30min。然后，PBS震蕩漂洗5minX3，再加入細胞培養(yǎng)基，激光共聚焦掃描顯微鏡(TCS-SP2，Germany)觀察細胞形態(tài)。選取代表性區(qū)域，分別選用Cy5(633nm)通道激發(fā)傳統(tǒng)Cy5和綠光543畫激發(fā)染料IIc，用油鏡(1000X)觀察，重復(fù)三次。表l.染料IIa-g在不同溶劑中的光譜性能<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3摩爾消光系數(shù)單位為cm—^b熒光量子產(chǎn)率的測量染料在不同溶劑中的吸收發(fā)射光譜，參比染料為羅丹明B的乙醇溶液(Of=0.97);所用儀器為紫外可見分光光度計，型號Hp8453;熒光分光光度計，型號FP-6500。1、染料的合成將起始原料對位取代苯肼與3-甲基-2-丁酮在冰醋酸中回流，吲哚化反應(yīng)生成非水溶性的吲哚中間體，再與烷基化試劑于氮氣保護下發(fā)生季銨化反應(yīng)生成烷基取代的中間體吲哚季銨鹽。以生成的季銨鹽為原料分出兩條路線進行后續(xù)合成，首先季銨鹽在堿溶液中常溫攪拌生成費希爾堿，在N，N-二甲基甲酰胺與三氯氧磷條件下生成帶醛基的中間體；另外，費希爾堿與氯乙酰氯在三乙胺作為敷酸劑條件在生成的中間體再與三苯基膦回流反應(yīng)生成witting試劑后，上述兩個中間體再在無水甲醇與無水四氫呋喃的條件下常溫攪拌生成偏位羰基的中間體，此中間體與三氯氧磷反應(yīng)生成偏位帶氯中間體染料，然后與不同胺常溫反應(yīng)生成相應(yīng)偏位氨基取代的五甲川菁類熒光染料。2、染料的光譜特征本發(fā)明專利以II為例分別合成了化合物IIa-g，并對這些化合物的光譜性能進行了測試。通過測試如下實施例中所合成染料的光譜性能可知，該類13位(偏位)氮取代的五甲川菁染料光譜(見圖l)和具體數(shù)據(jù)(表l)。與傳統(tǒng)五甲川菁染料相比，這類新染料的吸收波長和發(fā)射波長均出現(xiàn)藍移，吸收藍移較大，而且吸收光譜與熒光光譜不成鏡像對稱有兩個吸收峰和一個發(fā)射峰，具有較大的斯托克斯位移，最小分別可達60nm和150nm，最大可達90nm和230nm，。染料的摩爾消光系數(shù)減小，熒光量子產(chǎn)率相對傳統(tǒng)五甲川菁染料也降低了。3、染料與生物基質(zhì)的非共價作用這類新菁染料具有較低的熒光量子產(chǎn)率在水中染料IIa，IIb，IIc的熒光量子產(chǎn)率分別只有0.002，0.002，0.001，具有很低的背景熒光，這有利于染料進行生物應(yīng)用。本發(fā)明專利以染料IIa，IIb，IIc為例，分別測試了與生物基質(zhì)DNA和蛋白質(zhì)的作用，染料與蛋白質(zhì)作用熒光強度有較大提高，而與ct-DNA作用熒光基本沒有增加。3.1染料IIa-c分別與具有生物活性的牛血清蛋白(BSA)作用通過牛血清蛋白對染料的滴定結(jié)果表明，luM的染料溶液的熒光強度隨著牛血清蛋白濃度的增加，染料的紫外吸收逐漸降低，說明染料與BSA分子發(fā)生作用并且吸附到BSA分子上所致，熒光強度也得到大幅度提高，其中染料IIb，IIc熒光強度隨BSA濃度的增加而線性增加，熒光強度增加達到30倍以上，測試結(jié)果見附圖2，3是染料lib與BSA的作用圖，IIa，lie與BSA作用的結(jié)果與lib相同。3.2染料IIa-c分別后染變性的牛血清蛋白和胰凝乳蛋白酶原A將牛血清蛋白和胰凝乳蛋白酶原A先在加有十二烷基硫酸鈉和巰基乙醇的沸水中煮十分鐘變性，然后將蛋白通過SDS-PAGE電泳后，將凝膠在1.OX10-4M的染料水溶液中浸泡2小時后，再用去離子水清洗2小時候成像。染料的在凝膠上可以后染蛋白的檢測限分別是20ngBSA，50ng胰凝乳蛋白酶原A。(YoshioSuzukiandKenjiYokoyama，J.AMCHEM.SOC.2005，127，17799-17802.)3.3染料IIa-c分別與小牛胸腺DNA的作用從三種染料與小牛胸腺DNA的作用結(jié)果可知，染料與該DNA作用后熒光基本沒有增強，結(jié)果見附圖4，5是染料IIb與小牛胸腺DNA作用的滴定圖，其紫外吸收降低也說明染料與DNA發(fā)生作用，不同于BSA的作用的是其熒光強度并沒有提高，IIa，lie與DNA作用的結(jié)果與IIb相同。說明染料可以將DNA和蛋白質(zhì)區(qū)分開來3.4染料IIc以及傳統(tǒng)Cy5在MCF_7活細胞中熒光成像染料可以跨過細胞膜進入到活細胞內(nèi)，說明染料可以在活細胞呈祥方面具有潛在的應(yīng)用，染料進入活細胞后與蛋白和DNA作用熒光增加程度不同，表現(xiàn)出對DNA和蛋白質(zhì)的不同選擇性，這對研究活細胞內(nèi)不同組成成分等生物應(yīng)用具有非常重要的意義。1權(quán)利要求一類用于生物熒光分析細胞成像用的大斯托克斯位移β-位(偏位)取代五甲川菁染料，其特征在于該染料具有下列結(jié)構(gòu)通式2(β-)-X基-3-(1”-N-R1甲基-3”，3”-二甲基-6”-R3-2”-3H吲哚銨)-3’-(1’”-N-R2甲基-3’”，3’”-二甲基-6’”-R4-2’”-3H吲哚基)-1，2，3’-戊三烯氯化鹽(I)通式中X為結(jié)構(gòu)通式(R5，R6)氨基(II)；R1、R2為(CH2)nR8、(CH2)mOR9、(CHR10CH2O)pR9或CH2C6H4R8；R3、R4、R8為H、SO3R11或CO2R12；R5為(CH2)nR8、(CH2)mOR9或(CHR10CH2O)pR9；R6為(CH2)nR8、(CH2)mOR9、(CHR10CH2O)pR9、間位或?qū)ξ坏腃6H4R17；R9為H或C1-18烷基；R10為H或CH3；R11為H或M；M＝Na、K、N(R13R14R15R16)；R12為H、M、R7或C1-18烷基；R13、R14、R15、R16為H、C1-18烷基；(CH2)mOR9或(CHR10CH2O)pR9；R17為H、NH2、NHCOR9或(CH2)nR8；n、m、p為0-18。F2010100101343C00011.tif全文摘要一類共軛鏈上β-位氮取代五甲川菁類熒光染料，屬于生物熒光分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。在染料的β-位連接上各種不同氨基取代基后，染料的吸收發(fā)射波長均發(fā)生不同程度的藍移，斯托克斯位移從原來的20nm左右增加到70nm以上，解決了五甲川菁類熒光染料的自吸收和自淬滅問題。該染料與生物基質(zhì)作用后，熒光強度明顯增加，該類染料與生物基質(zhì)(蛋白質(zhì)，脂質(zhì)體，DNA)作用，表現(xiàn)出很好的選擇性，染料具有活細胞膜通透性，在活細胞染色中表現(xiàn)出很好的選擇性，染料主要染的是活細胞核周圍的脂質(zhì)體。此外這類五甲川菁染料光穩(wěn)定性好，背景熒光低，可滿足與其他波長吻合熒光染料并用于單通道激發(fā)，多通道檢測應(yīng)用?？蓱?yīng)用于蛋白標記與檢測，熒光免疫分析以及活細胞選擇性成像等領(lǐng)域。文檔編號C09B23/16GK101787218SQ20101001013公開日2010年7月28日申請日期2010年1月15日優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日發(fā)明者和艷霞,孫世國,宋鋒玲,彭孝軍,楊志剛,樊江莉申請人:大連理工大學(xué)