專利名稱：用于傳感的固定化生物層的形成的制作方法
技術領域：
公開了用于制造固定化生物層的裝置和方法。該技術在即時臨床診斷領域和更多 領域中能夠用于傳感液體樣品中的分析物。還公開了用于形成固定化生物層的重要的可固 化組合物。
背景技術：
用于測量生物流體中生物學上重要的分析物種類的小型化傳感器的開發(fā)正變得 越來越重要，這尤其是因為對容許在現(xiàn)場或在室內(nèi)進行這類分析物種類測量的越來越小儀 器的需要。盡管在傳感器制造領域已有進展，但在這類傳感器的小型化和制造方面仍存在 主要的挑戰(zhàn)。一種這類挑戰(zhàn)是大量生產(chǎn)商業(yè)上可行的包含生物活性分子的傳感器的復雜程 度。主要關注的是與現(xiàn)有半導體制造方法相關的固有苛刻的物理和化學過程與敏感的有機 化合物和不穩(wěn)定的生物活性分子之間的相容性，敏感的有機化合物和不穩(wěn)定的生物活性分 子兩者包含功能性生物傳感器的部分。圍繞這類傳感器的小型化和制造的另一主要挑戰(zhàn)是 靈敏的并且能夠以高度再現(xiàn)性大量制備的傳感器的生產(chǎn)。因此，存在對形成考慮到傳感器 中所用的生物活性分子的靈敏性的傳感器的工藝的需要，以及對大量生產(chǎn)傳感器時高度均 一的傳感器的需要。附圖簡述根據(jù)下列非限制性圖將更好地理解本發(fā)明，其中

圖1顯示在與參比電極組合的硅晶片上制造的血液尿素氮(BUN)傳感器的拓撲立 剖面視圖；圖2 (a)-(c)如下顯示在不同制造步驟的硅芯片(2mmX3mm)上的BUN傳感器的平 面視圖圖2 (a)是銀-氯化銀裸電極353 ；圖2 (b)就(a)而論具有微分散的銨離子選擇性 膜355 ；圖2(c)就(b)而論具有紫外線點固化的(spot-cured)丙烯酰胺脲酶層356。圖3(a)-(C)如下顯示成品BUN傳感器的電子顯微視圖圖3(a)顯示通過常規(guī)的 ELVACE方法(由親水區(qū)和疏水區(qū)構成的乙酸乙烯酯乙烯共聚物)形成的固定化酶層；圖 3(b)具有所期望的均一圓頂形狀的UV點固化丙烯酰胺脲酶酶層；和圖3(c)UV泛光固化的 (flood cured)丙烯酰胺脲酶酶層；圖4顯示使用圖14(a)中所述的組合物的丙烯酰胺BUN傳感器由在校準流體中轉 為在血液中的傳感器輸出數(shù)據(jù)(計時電位圖)；圖5顯示圖4中所示類型的丙烯酰胺BUN傳感器(EIL)在用于加熱的和未加熱的 芯片的全血(WB)中的傳感器相關數(shù)據(jù)與基于ELVACE (木膠)的酶固定化膜的比較；圖6顯示分散裝置和UV點固化子系統(tǒng)的視圖；圖7顯示點固化子系統(tǒng)和UV燈箱的細節(jié)；
5a)分散子系統(tǒng)和(b)點固化子系統(tǒng)的細節(jié)；圖9顯示分散與點固化的過程算法步驟和時間控制；圖10是傳感器套筒罩(cartridge cover)的等距頂視圖；圖11是傳感器套筒罩的等距底視圖；圖12是用于傳感器套筒的帶形墊圈(tape gasket)的設計的頂視圖；圖13是傳感器套筒底部的等距頂視圖；圖14(a)_(b)顯示用于具有優(yōu)選的實際混合物組合物的基質的試劑表，其中圖 14(a)顯示用于含脲酶的酶固定層的組分，其中脲酶為僅有的酶，并且圖14(b)類似于 14(a)，只是添加了碳酸酐酶；圖15(a)_(b)顯示從使用以下物質產(chǎn)生的酶固定層所產(chǎn)生的信號的計時電位數(shù) 據(jù)(a)作為單體的丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、聚(乙二醇)丙烯酰胺(PEGA)和N-[3-( 二甲 氨基)丙基]-甲基丙烯酰胺(DMAPMA)和作為二聚體的1，4_雙(丙烯酰)哌嗪；(b)作為 單體的丙烯酰胺和作為二聚體的1，4_雙(丙烯酰)哌嗪、乙二醇二丙烯酸酯聚(乙二醇) 二丙烯酸酯(PEGDA) ,N, N' -(1,2- 二羥亞乙基)雙-丙烯酰胺(DHEBA)和三羥甲基丙烷 乙氧基化三丙烯酸酯(TMPETA)；圖16顯示暴露于不同強度和不同的時間的310nm的UV光后從基于丙烯酰胺/1， 4_雙(丙烯酰)哌嗪的酶固定層產(chǎn)生的信號的電位計時數(shù)據(jù)，其未表明在此實驗中使用的 暴露于UV光的時間和強度的范圍的顯著影響；圖17顯示具有不同的貨架期和儲存條件的不同濃度的濕潤劑的影響的數(shù)據(jù)；并 且圖18展示了 EIL膜的印刷厚度對使用5種不同的含水對照流體的傳感器性能的 影響相對較小。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于制造供傳感器中使用的固定化生物層的裝置和方法，所述傳感器 用于測量生物流體中的生物學上重要的分析物種類。所述方法和裝置有助于生產(chǎn)在大批量 制造時具有更均一的性能特征的儀器。所述方法和裝置的另一有價值的特征是它們提供在 與諸如校準流體(calibrant fluid)、對照流體和血液此類液體接觸時基本上耐溶脹的生 物層。不受任何具體理論束縛，據(jù)信使用所述方法和裝置生產(chǎn)的生物層耐溶脹，因為在所述 層中存在顯著水平的交聯(lián)。已發(fā)現(xiàn)以這種方式耐溶脹的膜是操作傳感器所希望的，因為表 現(xiàn)出顯著溶脹的生物層可能給出不一致的信號并且甚至從表面脫層。在一個方面，本發(fā)明涉及形成傳感器的方法，所述方法包括以下步驟(a)形成包 含以下物質的基本上均勻的含水混合物在含水混合物中的一種或多種酶、丙烯酸基單體、 水溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑；(b)施加足以覆蓋基部傳感器的受控體積 的所述混合物到所述基部傳感器上；以及(c)將所述施加的體積暴露于足夠的UV輻射以形 成粘附在所述基部傳感器上的固定化酶層。任選地，所述酶選自由以下組成的組脲酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、肌酸酶、 肌酸酐酶、肌氨酸氧化酶、觸媒、碳酸酐酶、NAD (P)H氧化酶、膽固醇氧化酶、醇氧化酶、膽堿 氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、硫胺素氧化酶、丙酮酸氧化酶、吡哆醛氧化酶、D-氨基酸氧 化酶、L-氨基酸氧化酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶以及它們的組合。所述單體可以選
6自例如，丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-[3_( 二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸 羥乙酯以及它們的組合。所述有機光引發(fā)劑可以選自2_羥基-l-[4-(2-羥基乙氧基)苯 基]-2-甲基-1-丙酮、(權利要求8的插入方法)以及它們的組合。所述交聯(lián)劑任選地選 自1，4-雙丙烯酰哌嗪、N，N-(1，2-二羥亞乙基)雙-丙烯酰胺、N，N，-雙(丙烯酰)胱 胺、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、乙二醇二丙烯酸酯、(+)-N，N’ - 二烯丙基酒石酰胺以及它們 的組合。基部傳感器任選地選自由以下組成的組電極、離子選擇性電極、電位測定電極、電 流型電極、電導電極、酶電極、生物傳感器、光學傳感器、光纖傳感器、聲表面波傳感器、消逝 傳感器(evanescent sensor)、表面等離子體共振傳感器和光波導傳感器。在優(yōu)選的實施方 式中，所述酶為脲酶并且所述基部傳感器為銨離子選擇性膜。含水混合物任選地還包含選自由以下組成的組的一種或多種穩(wěn)定組分pH緩沖 劑、二硫鍵還原劑、二價離子螯合劑、蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋白、鹽、殺生物劑和濕潤劑。 含水混合物任選地包含脲酶、2-羥基-l-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、雙 丙烯酰哌嗪、甘油和丙烯酰胺單體。施加混合物的方法可以通過微分散在約5nL至約1 μ L的范圍內(nèi)的受控體積來進 行。施加混合物的方法可以通過選自由以下組成的組的手段來進行旋涂、浸涂、噴涂、絲網(wǎng) 印刷、噴墨印刷、激光印刷、涂抹和接觸印刷。UV輻射可以在例如約185至400nm的波長范圍內(nèi)并且任選地具有約100至400mW/ cm2范圍內(nèi)的強度。所述UV輻射步驟是在分散循環(huán)中的分散步驟之后立即進行的點固化。 所述UV輻射步驟任選地是在分散步驟之后預選的時間延遲后進行的點固化，并且可以進 行約0. 1至10秒的一段持續(xù)時間。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及形成尿素傳感器的方法，所述方法包括以下步 驟(a)形成包含下列物質的基本上均勻的含水混合物脲酶、甘油、2-羥基-l-[4-(2-羥 基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、雙丙烯酰哌嗪和丙烯酰胺單體；(b)將足以覆蓋銨離 子選擇性膜的受控體積的所述混合物分散到所述膜上；以及(c)將所述分散的體積暴露于 足夠的UV輻射以形成粘附在所述膜上的固定化脲酶層。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及用于在基本上平坦的表面上形成固定化酶層的裝 置，所述裝置包括用于在所述表面上的預選位置分散受控體積例如約5nL至約1 μ L范圍 內(nèi)的光可形成的含酶基質的分散頭；和具有套準和對齊器件的UV輻射源，例如汞燈，所述 套準和對齊器件能夠在所述基質被分散后，在預定的時間以預定的強度將輻射束聚焦在基 本上覆蓋所述預選位置的區(qū)域并且進行一段預定的持續(xù)時間。任選地，所述裝置還包括用 于改變所述表面相對于所述分散頭和所述UV輻射源的相對位置的步進重復器件以用于在 一組預選的位置形成固定化酶層陣列?；旧掀教沟谋砻嫒芜x地選自硅晶片、氧化鋁晶片、液晶基底、玻璃基底和塑料 基底以及柔性塑料基底。分散頭可以包括例如，具有用于所述基質的儲器的注射器針和用 于控制從所述注射器到所述表面上的分散體積的排放器件。光可形成的基質任選地為包含下列物質的組合物在基本上均勻的含水混合物中 的一種或多種酶、濕潤劑、丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑。預選的位置優(yōu)選地具有約10平方微米至約75平方毫米的范圍內(nèi)的面積。任選地， 預選的位置為基本上圓形的，并且具有為約5 μ m至約5mm范圍內(nèi)的半徑尺寸。
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任選地，套準和對齊器件容許光束被聚焦在所述表面的所選區(qū)域上并照射約10 平方微米至約75平方毫米范圍內(nèi)的區(qū)域。電腦程序可以控制分散的時間控制和位置和/ 或相對于分散的時間控制的施加UV輻射的時間控制和位置。任選地，分散頭能夠在所述表面上的一組預選的位置分散一系列受控體積的光可 形成的基質，并且所述UV輻射源能夠在各受控的體積被分散后，在預定的時間將輻射束按 順序聚焦在基本上覆蓋各所述預選位置的區(qū)域一段預定的持續(xù)時間。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及用于在基本上平坦的表面上的傳感器陣列上形成 固定化酶層的陣列的裝置，所述裝置包括用于在所述表面上的一組預選的位置分散一系 列受控體積的光可形成的含酶基質的分散頭，以及具有套準和對齊器件的UV輻射源，所述 套準和對齊器件能夠在各受控的體積被分散后，在預定的時間將輻射束按順序聚焦在基本 上覆蓋所述各所述預選位置的區(qū)域一段預定的持續(xù)時間。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及在基本上平坦的表面上的傳感器上形成固定化層 的方法，所述方法包括以下步驟(a)在所述表面上的預選位置分散受控體積的光可形成 的基質，其中所述光可形成的基質包含生物活性材料；以及(b)在所述體積被分散后的預 定時間開始將UV輻射束施加到基本上覆蓋所述預選位置的區(qū)域上并且以預定的強度進行 一段預定的持續(xù)時間以形成所述固定化層。光可形成的基質任選地包含在含水混合物中的一種或多種酶、丙烯酸基單體、水 溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑。生物活性材料任選地選自由以下組成的組 蛋白質、酶、抗體、抗體片段、RNA、單鏈DNA和雙鏈DNA。固定化層優(yōu)選為酶層。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及在基本上平坦的表面上的傳感器陣列上形成固定 化層的陣列的方法，所述方法包括以下步驟(a)在所述表面上的一組預選的位置分散一 系列受控體積的光可形成的基質；以及(b)在各受控的體積被分散后預定的時間(例如約 0. 1秒至約10秒的范圍內(nèi))開始，將UV輻射束按順序施加到基本上覆蓋各所述預選位置的 區(qū)域上，并且以預定的強度施加所述輻射一段預定的持續(xù)時間(例如約0. 1秒至約10秒的 范圍內(nèi))以形成所述固定化層陣列。UV輻射優(yōu)選是在約185至400nm的波長范圍內(nèi)并且UV 輻射強度可以在約100至400mW/cm2的范圍內(nèi)。平坦的表面任選地為硅晶片并且所述預選 的位置組是在所述晶片上的傳感器陣列。UV輻射束任選地被施加至Nth減X的預選位置， 而分散發(fā)生在Nth預選位置，其中X等于1至10的整數(shù)。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及傳感器，所述傳感器包含電極，并且具有覆蓋所述 電極的包括離子選擇性膜的第一層、和覆蓋所述離子選擇性膜的包含UV固化基質的第二 層，所述UV固化基質由下列物質的基本上均勻的含水混合物形成一種或多種酶、濕潤劑、 丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑。發(fā)明詳述在一個方面，本發(fā)明涉及酶固定組合物，所述酶固定組合物包含在基本上均勻的 含水混合物中的一種或多種酶、濕潤劑、丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯 酸基交聯(lián)劑。酶本發(fā)明的組合物中所包含的一種或多種酶可以廣泛地變化。在一些實施方式中， 所述一種或多種酶包含脲酶。脲酶特別地很適于摻入到在測定中定量血液尿素氮(BUN)含
8量的生物傳感器中。BUN測定用于測量血液中的尿素氮的水平，尿素氮是被腎清除的蛋白代 謝廢產(chǎn)物。因此BUN測定評估腎的功能。臨床上有用的BUN值為2-140mg/100mL(dL)。稱 為氮血癥的病癥(即，BUN水平增加)可能指示腎功能受損、充血性心力衰竭、脫水、休克、 胃腸道出血、壓力、急性心肌梗塞或蛋白吸收過度?？蛇x擇地，BUN值降低可能指示肝衰竭、 營養(yǎng)不良、促蛋白合成類固醇的使用、懷孕和乳糜瀉(siliac disease)。全血中的尿素是以兩步法檢測的。首先，尿素經(jīng)由不完全了解的機制在“脲酶反 應”中被酶促轉化為產(chǎn)物NH4+和HC03_。檢測尿素的第二步是通過NH4+離子選擇性電極(ISE) 以電位法測定銨離子活性。參見，D. Freifelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology(物理生物化學生物化學和分子生物學的應 用)第4章(第2版，1982)。BUN傳感器反應，即由于NH4+濃度改變而引起的電位改變，是 在血液中尿素的已知水平校準的。由此可以使用傳感器反應曲線圖(作為時間的函數(shù)的以 毫伏為單位的計時電位圖)來指示傳感器膜內(nèi)銨離子的濃度，這提供了對血液中尿素濃度 的間接估計。由于脲酶對尿素的酶促降解產(chǎn)生了作為HC03_分解的副產(chǎn)物的種類H+和C02，所以 可以使用檢測H+或CO2改變的傳感器來測定BUN含量。銨離子的檢測是優(yōu)選的，因為血液 中存在相對較低背景濃度的銨離子。相反，血液具有明顯的H+、CO2和HCO3-背景。脲酶反 應期間離子的產(chǎn)生還增加了樣品的電導率，該電導率可以用電導率傳感器來檢測。脲酶的理想性質是具有低殘余水平的關聯(lián)產(chǎn)物(銨離子< 0. 00001 μ mol/酶單 位)和其他含氮化合物。用于本發(fā)明的酶固定組合物中的脲酶理想地應不含污染性蛋白酶 并且應在25°C具有大于500U/mg蛋白的比活性。此外，該酶還應為高純度的。在一些實施 方式中，脲酶應具有在約ImM至約IOOmM范圍內(nèi)的Km，例如約ImM至約50mM或約25mM至約 75mM,并且優(yōu)選地為約50mM。此外，脲酶應具有大于16，000 (微摩爾/ml/min)的Vmax。最 后，脲酶應具有約5 X IO5Hiirr1或更大的Kcat。在優(yōu)選的實施方式中，脲酶為刀豆脲酶(E. C. 3. 5. 1. 5) (Biozyme Laboratories, San Diego, CA)。刀豆脲酶(E. C. 3. 5. 1. 5)的其他來源包括(i) Sigma-Aldrich Canada Ltd. (Oakville, Ontario, Canada) ； (ii)Toyobo (Tokyo, Japan) ； (iii)Worthington Biochemical Corporation(Lakewood, NJ) ； (iv)Genzyme Diagnostics(Cambridge, MA)。在一些實施方式中，本發(fā)明的酶固定組合物包含碳酸酐酶和脲酶。碳酸酐酶將由 脲酶反應所形成的碳酸氫鹽轉化為二氧化碳，從而增加銨離子產(chǎn)率，如在美國專利申請系 列第11/216,041號中所述的，通過引用將其整體并入本文。用于這些組合物中的碳酸酐 酶理想地應具有低殘余水平的含氮化合物，不含污染性蛋白酶并且應另外為高純度的。此 外，碳酸酐酶應具有在0°C大于2500 Wilbur-Anderson單位/mg蛋白的比活性(Wilber， K. Μ.和 N. G. Anderson，Journal of Biological Chemistry 176 147-154 (1948)) 在一 些實施方式中，碳酸酐酶應具有ImM至50mM之間的&值，其中優(yōu)選的&為1至5。此外， 碳酸酐酶應具有大于50 (微摩爾/ml/min)的Vmax，優(yōu)選大于10，000 (微摩爾/ml/min)。最 后，碳酸酐酶應具有大于Τδπ ιΓ1的Keat值，優(yōu)選大于5 X IO5Hiirr1t5在優(yōu)選的實施方式中，碳酸酐酶是牛碳酸酐酶(E.C.4. 2. 1. 1) (Sigma-Aldrich Canada Ltd.，Oakville, Ontario, Canada ;Km 1. 31mM ；Vmax 64. 4 ^ /K /ml/min ；Kcat 76. 24min_1)。牛碳酸酐酶(E. C. 4. 2. 1. 1)的另一來源是 Worthington BiochemicalCorporation(Lakewood, NJ)。盡管在一些優(yōu)選的實施方式中，用于本發(fā)明的酶固定組合物的酶為脲酶，但是可 以單獨或與另一種酶(例如，脲酶和碳酸酐酶)組合使用與固定組合物相容的任何其他 酶。在一些實施方式中，所述酶選自由以下組成的組葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、肌酸酶、 肌酸酐酶、肌氨酸氧化酶、觸媒、NAD (P)H氧化酶、膽固醇氧化酶、醇氧化酶、膽堿氧化酶、甘 油-3-磷酸氧化酶、硫胺素氧化酶、丙酮酸氧化酶、吡哆醛氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基 酸氧化酶、脲酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶以及它們的組合?？梢岳斫馑玫拿笢y定被 傳感的分析物。因此，例如葡萄糖氧化酶可以在檢測葡萄糖的傳感器中使用；乳酸氧化酶可 用于檢測乳酸根；并且脲酶和碳酸酐酶的組合可用于同時檢測BUN含量。單體、光引發(fā)劑和交聯(lián)劑如上面所討論的，本發(fā)明的酶固定組合物包含丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā) 劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑。在一些實施方式中，丙烯酸基單體包括丙烯酰胺。在其他實 施方式中，所述單體包括甲基丙烯酰胺、聚(乙二醇)丙烯酸酯、N-[3_( 二甲氨基)丙基] 甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯或它們的混合物。有機光引發(fā)劑可以為能夠聚合單體的任何光引發(fā)劑。在一些實施方式中，光引 發(fā)劑選自由以下組成的組2，6_雙(4-疊氮苯亞甲基)環(huán)己酮；2，6_雙(4-疊氮苯亞甲 基)-4_甲基環(huán)己酮；4，4_ 二疊氮均二苯乙烯_2，2' - 二磺酸二鈉鹽；重鉻酸銨；1-羥 基-環(huán)己基-戊基-酮(Irgacure 907) ；2-甲基_1[4_(甲硫基)苯基]_2_嗎啉代丙 燒-1-酮(Irgacure 184C) ；2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙燒-1-酮(Darocur 1173)； 50wt%&lrgacure 1S4C 與 5Owt % 的二苯甲酮的混合光引發(fā)劑(Irgacure 500) ；20wt% 的 Irgacure 184C 與 80wt % 的 Darocur 1173 的混合引發(fā)劑(Irgacure 1000) ；2-羥 基-l-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(Irgacure 2959)；苯甲酰甲酸甲酯 (Darocur MBF) ； α , α - 二 甲氧基-α -苯基苯乙酮(Irgacure 651) ；2_ 節(jié)基 _2_( 二甲 氨基)-1-[4-(4-嗎啉基)苯基]-1-丁酮(Irgacure 369) ；30wt % 的 Irgacure 369 與
Irgacure 651的混合引發(fā)劑(Irgacure 1300) ；二苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰 基)_ 氧化膦(Darocur ΤΡ0) ；50wt% 的 Darocur TPO 與 50wt% 的 Darocur 1173 的混合引 發(fā)劑(Darocur 4265)；氧化膦；苯基雙(2，4，6_三甲基苯甲?；?(Irgacure 819) ；5wt% 的 Irgacure 819 與 95wt % 的 Darocur 1173 的混合弓I 發(fā)劑(Irgacure 2005) ；IOwt % 的 Irgacure 819 與 90wt % 的 Darocur 1173 的混合引發(fā)劑(Irgacure 2010) ； Irgacure 819 與Darcocur 1173 的混合引發(fā)劑(Irgacure 2020)；雙(乙 5-2，
4_環(huán)戊二烯-1-基)雙[2，6-二氟-3-(1!1-吡咯-1-基)苯基]鈦(Irgacure 784)；含有 二苯甲酮的混合引發(fā)劑(HSP188)；以及它們的衍生物。在優(yōu)選的實施方式中，光引發(fā)劑包 括2-羥基-l-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮。在其他實施方式中，光引發(fā) 劑包括2-羥基-3- (3,4- 二甲基-9-氧代-9H-噻噸-2-基氧基)-N, N, N-三甲基-1-氯化 丙銨。另外，這些光引發(fā)劑可以組合使用。在優(yōu)選的實施方式中，交聯(lián)劑是能夠促進由單體所形成的聚合物的交聯(lián)的任何化 學實體。在一個實施方式中，交聯(lián)劑包括1，4_雙丙烯酰哌嗪(BAP)。在其他實施方式中，交 聯(lián)劑包括N，N’ -(1，2-二羥亞乙基)雙-丙烯酰胺、Ν，Ν’ -雙(丙烯?；?胱胺、Ν，Ν’ -亞 甲基雙丙烯酰胺、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯、(+)_Ν，
10N' -二烯丙基酒石酰胺或它們的混合物。濕潤劑、緩沖劑和其他組分除丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑外，酶固定基質 可以任選地還包含其他穩(wěn)定組分，所述其他穩(wěn)定組分包括例如，pH緩沖劑、二硫鍵還原 劑、二價離子螯合劑、蛋白酶抑制劑、白蛋白、鹽、糖、殺生物劑、濕潤劑和增塑劑。在優(yōu)選的 實施方式中，酶固定基質包含TRIS緩沖劑、雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸鹽、蔗 糖、抑肽酶、牛血清白蛋白、氯化鈉、氯化鉀、疊氮化鈉和甘油。參見圖14。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物包含濕潤劑。當添加濕潤劑時，所述濕潤劑 優(yōu)選地選自甘油、丙二醇、三乙酸甘油酯、山梨醇、木糖醇、麥芽糖醇、聚葡萄糖、皂角、乳酸、 氯化鋰和1，2_丙二醇。在一個實施方式中，組合物中濕潤劑的濃度為約2-20%，例如約 2-15%、約2-10%或約2-8% (ν/ν) 0在一些情況下，已發(fā)現(xiàn)在過高濃度濕潤劑能夠降低產(chǎn) 品的貨架期。添加如甘油的濕潤劑是為了防止基質在微分散過程期間和固化步驟前干燥。 如果微分散的小滴干燥過快，則制劑的組分可能從溶液中沉淀出來，并且這會不利地影響 交聯(lián)和固化。由于分散到基底上的小滴尺寸小，所以在低濕度制造環(huán)境中的微分散易趨于 快速干燥。因此，控制環(huán)境溫度和濕度是重要的。此處所述過程的優(yōu)選范圍是4°C至25°C 和5%至30%的相對濕度。本發(fā)明的制劑優(yōu)選地包含可用于維持和優(yōu)化酶活性的生物化學緩沖劑組分。示 例性緩沖劑包括三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、巴比妥鈉、4-(2_羥乙基)-1_哌嗪乙磺 酸(HEPES)、哌嗪二乙磺酸(PIPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸 (MOPS)、曲辛、BIS-TRIS、磷酸鹽、磷酸鹽鹽水、檸檬酸鈉鹽水(SSC)、磷酸鈉乙二胺四乙酸鹽 水(SSPE)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、三羥甲基氨基甲烷(tris)乙酸 乙二胺四乙酸(TAE)、三羥甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸(TBE)以及它們的混合物。在優(yōu) 選的實施方式中，緩沖劑為TRIS。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物任選地包含還原劑。示例性的還原劑包括二 硫蘇糖醇(DTT)、2_巰基乙醇、鹽酸三(2-羧乙基)膦、二硫赤蘚糖醇、谷胱甘肽以及它們的 混合物。在優(yōu)選的實施方式中，還原劑為DTT。添加還原劑至本發(fā)明的組合物中以防止組合 物中所包含的酶形成非活性的多聚體可能是有利的。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物任選地包含陽離子粘合劑，優(yōu)選為二價陽離 子粘合劑。示例性的二價陽離子粘合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸鈉、乙二醇四乙 酸、二亞乙基三胺五乙酸、乙二胺和它們的混合物。添加這種陽離子粘合劑作為金屬螯合劑 以防止金屬離子失活以及防止蛋白酶活化。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物包含蛋白酶抑制劑。示例性的蛋白酶抑制劑 包括抑肽酶、雞卵白半胱氨酸蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶、胱胺二鹽酸鹽、胰凝乳蛋白酶抑制 劑、3，4-二氯異香豆素、E-64、依布硒、Gly-Gly-Tyr-Arg合成肽、亮抑酶肽、α 2-巨球蛋 白、N- α -甲苯磺?；?L-賴氨酸氯甲酮鹽酸鹽、N- α對甲苯磺?；?L-苯丙氨酸氯甲酮 鹽酸鹽、胃蛋白酶抑制劑A、pesinostr印tin、ε -氨基-正己酸、4_(2_氨乙基)苯磺酰氟 鹽酸鹽、抗凝血酶III、博待啉、補體Cl酯酶抑制劑、3，4_ 二氯異香豆素、二異丙基氟磷酸 (diisopropyl fluorophosphage)、彈性蛋白酶抑制劑、甲磺酸加貝酯、亮抑酶肽、α 2_巨球 蛋白、N-乙?；?glu-ser-met-asp-al、Ν-乙?；?_ile-gly-thr-asp-al、二異丙基氟磷酸、
11Na-T-Boc-去乙酰亮抑酶肽、乙酰基-胃蛋白酶抑制劑、富組蛋白5、Cbz-Leu-Leu-Phe-al, Cbz-LeU-LeU-LeU-B(OH)2^L胱素、clasto-乳胱素β -內(nèi)酯、二異丙基氟磷酸、苯甲基磺酰 氟、胃蛋白酶抑制劑 A、D-His-Pro-Phe-His-Leu-psi -(CH2NH) -Leu-Val-Tyr、二亞乙基三胺 五乙酸、1，10-二氮雜菲一水合物、膦酰二肽、二異丙基氟磷酸、N-乙酰基-水蛭抑制劑C、甲 磺酸加貝酯、蛭素、Na-(2-萘磺?；拾滨?-4-脒基-DL-苯丙氨酸(pheylalanine)哌 啶、D-Val-Leu-Lys-氯甲酮、對氨基苯甲脒二鹽酸鹽、大腸桿菌素、胰蛋白酶抑制劑、胰蛋白 酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑和Glu-Gly-Arg-氯甲酮。在優(yōu)選的實施方式中，添加抑肽酶作為 在血樣分析時可與膜接觸以及也可能存在于影響產(chǎn)物貨架期的基質制劑中的任何蛋白酶 的蛋白酶抑制劑。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物包含殺生物劑。示例性的殺生物劑包括疊氮 化鈉、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、硫柳汞、次氯酸鹽 以及它們的混合物。在優(yōu)選的實施方式中，添加疊氮化鈉作為殺生物劑以預防性保護制劑 在點固化前或點固化后免受微生物污染。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物包含增塑劑。示例性的增塑劑包括甘油、丙 二醇、聚乙二醇以及它們的混合物。在優(yōu)選的實施方式中，增塑劑為甘油。應了解如甘油的 一些增塑劑可以作為增塑劑和濕潤劑二者起作用，從而使本發(fā)明的組合物更柔韌。這防止 固化的丙烯酸樹脂在溫度改變期間和在可能將材料置于應力下的其他條件下開裂和脫層， 所述其他條件稱為環(huán)境應力開裂(ESC)。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物包含鹽。示例性的鹽包括氯化鈉、氯化鉀、 磷酸鈉、磷酸鉀以及它們的混合物。發(fā)現(xiàn)低濃度的鹽優(yōu)選氯化鈉和氯化鉀的添加降低了脫 層率，即降低了隨后接觸校準流體或血樣時膜粘附力的損失。盡管不受任何理論束縛，據(jù)信 這種改善是由于添加內(nèi)源鹽后樣品與膜之間滲透濃度差的降低所致。由于離子選擇性電極 (ISE)對鈉離子和鉀離子敏感，所以對該濃度進行優(yōu)化以降低這種背景對ISE的影響。在一 些實施方式中，鹽濃度為約0. ImM至約140mM，例如，約30mM至約140mM、約0. ImM至約ImM、 約20mM至約50mM或約20mM至約40mM。在優(yōu)選的實施方式中，使用包含0. 9mM KCl和35mM NaCl的本發(fā)明的組合物。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物包含脫水保護劑(anhydrobiotic protectant)。示例性的脫水保護劑包括蔗糖、海藻糖、甘露醇和它們的混合物。在優(yōu)選的 實施方式中，脫水保護劑為蔗糖。優(yōu)選地添加蔗糖作為脫水保護劑以增強膜的穩(wěn)定性從而 使其中包裝傳感器的測試套筒表現(xiàn)出延長的貨架期，例如6-12個月或更長時間。還可以添 加牛血清白蛋白(BSA)，因為已觀察到其增加筒的貨架期并確保良好的膜粘附力。組合物的制備在一些實施方式中，將本發(fā)明的組合物混合、等分并且然后冷凍儲存直到將等分 試樣解凍并用于微分散。在優(yōu)選的實施方式中，將單體(例如丙烯酰胺)和交聯(lián)劑(例如 BAP)在溶液中混合在一起。向單體/交聯(lián)劑溶液中添加光引發(fā)劑(例如，Irgacure 2959)。 在一些實施方式中，希望最后添加光引發(fā)劑，因為它是最具反應性的并且這種措施減少其 暴露于光。在優(yōu)選的實施方式中，將樣品在-60°C冷凍，并且發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定達至少4個月。樣 品冷凍可在-20°C至-120°C的范圍內(nèi)，其中較冷的溫度是優(yōu)選的。在這些深低溫下，制劑可 以保持穩(wěn)定達數(shù)年。
12
盡管本發(fā)明的組合物優(yōu)選地用于固定酶，本領域的那些技術人員將認識到它們還 可以用于固定其他生物活性材料而不是酶，或者其他生物活性材料以及酶，例如，抗體、抗 體片段、RNA、單鏈 DNA 禾口雙鏈 DNA。參見，例如，Rehman 等人，1999，“ Immobilization of aeryIamide-modified oligonucleotides by co-polymerization(通過共聚固定丙烯酉先 胺改性的寡核苷酸)，"Nucleic Acids Research, 27 :649_655 (1999)，通過引用將其整體并 入本文。當配制本發(fā)明的酶固定組合物時，有必要考慮組合物的溶解性和緩沖作用。酶一 般需要接近PH 7的含水緩沖溶液，但是也有例外，例如，堿性磷酸酶。例如，據(jù)報道脲酶的 最適 pH 為 8. 0 (Wall & Laidler, The Molecular Kinetics of the Urea-Urease System IV The Reaction in an Inert Buffer (尿素-脲酶系統(tǒng)的分子動力學IV在惰性緩沖劑 中的反應)，Archives of Biochemistry and Biophysics 43:307—311 (1953))。然而，已 發(fā)現(xiàn)為了在本發(fā)明的組合物中獲得最佳的酶活性，有利的是使用小于PH 8. 0的pH。在一些 實施方式中，本發(fā)明的組合物的PH為約6. 5至約7. 4?？梢酝ㄟ^使用熟知的緩沖劑將組合 物的PH維持在該范圍內(nèi)。示例性的緩沖劑包括但不限于IOOmM TRIS，pH 7.6。10至200mM 范圍內(nèi)的TRIS緩沖劑也可用于約pH 6. 5至約8.0的pH范圍?？捎糜诒景l(fā)明的其他緩沖 劑包括磷酸鈉、磷酸鉀、TRIS(三羥甲基氨基甲烷)，例如，TRIS-H2SO4, HEPES, TRIS-HCl緩 沖劑和巴比妥。大部分光引發(fā)劑還在含水類溶劑中具有有限的溶解度。此外，丙烯酸樹脂交聯(lián)劑 也僅略溶于含水溶液。例如，發(fā)現(xiàn)光引發(fā)劑2-羥基-l-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-甲 基-1-丙酮在溶解于包含單體和交聯(lián)劑的丙烯酸樹脂溶液中時溶解度略高并且其可溶解 在含水溶液中。較高濃度的光引發(fā)劑是優(yōu)選的。然而，重要的是光引發(fā)劑不從溶液中沉淀 出來。因此，鑒定合適的濃度范圍是重要的。在一些實施方式中，光引發(fā)劑的濃度范圍是約 0. 5%至約10%，例如約0. 5%至約5%或約0. 5%至約4. 0%。包含脲酶、2-羥基-l-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-甲基丙酮、雙丙烯酰哌 嗪和丙烯酰胺單體的優(yōu)選基質的微分散層顯示在圖2(c)和3(b)中。將基質以足以覆蓋銨 離子選擇性膜的受控體積分散到該膜上(參見圖2(b))，然后將其暴露于足夠的UV輻射下 以形成粘附在該膜上的固定化脲酶層。微分散的基質的標稱體積優(yōu)選為約50nL，但是可以 使用廣泛的體積范圍。對于具有圖2中所顯示的尺寸的傳感器，該范圍優(yōu)選為10-200nL。圖3顯示了圖解使用不同方案產(chǎn)生的典型印刷物的掃描電子顯微照片(SEM)。對 于點固化(參見圖3(b))，在微分散事件后以預定的時間間隔將各微分散小滴暴露于UV下。 對于圖3(b)，各單獨的印刷膜的時間域的控制如下、分散膜，、施加UV，t2停止UV，其中 、至、為0.5秒，并且、至、為0.6秒。對于圖3(b)中所顯示的固定化酶層，UV輻射波 長為310nm并且UV強度為2W/cm2。優(yōu)選地，分散膜基質步驟、至、的范圍是約0. 05秒 至約2. 0秒，例如約0. 1秒至約1. 0秒。UV輻射步驟范圍優(yōu)選為約0. 05秒至120秒，例如 約0. 1秒至約60秒。UV輻射波長可以在例如約260nm至約360nm變化，并且優(yōu)選地對光引 發(fā)劑具有特異性。優(yōu)選地，對于2-羥基-l-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮 光引發(fā)劑，UV波長為310nm。UV輻射強度可以從約0. 005W/cm2至約50W/cm2變化，例如，約 O.OlW/cm2至約lOW/cm2。UV輻射的強度和時間是該過程的相關特征，其中一個參數(shù)的減少 通常使另一個參數(shù)的增加成為必要。此外，較短的UV輻射波長可能對敏感的生物材料具有
13負面影響。因此，約300nm以上的波長是優(yōu)選的。通過比較，圖3(c)描繪了使用UV泛光系統(tǒng)(flood UV system)的固化步驟。UV 泛光固化系統(tǒng)需要在執(zhí)行泛光固化步驟之前所有基質小滴都被微分散到基底上，例如，晶 片上。這意味著較早的小滴干燥(或凝結(set-up))的時間長于較晚的小滴。這種延遲可 能導致時間依賴性的固化結構變化。由于印刷小滴的尺寸很小，所以它們能夠快速干燥， 同時組分變?yōu)椴豢扇艿牟⑶乙虼瞬惶菀妆籙V固化。為了比較，圖3(a)顯示了由常規(guī)的 ELVACE方法形成的酶層。“ELVACE”為由親水區(qū)和疏水區(qū)構成的乙酸乙烯酯乙烯共聚物。 ELVACE方法不包括UV固化步驟。注意到使用ELVACE結構的可變表面可能不希望地促成性 能的可變性，圖3(c)中所示的結構也如此。已發(fā)現(xiàn)UV點固化方法提供了最符合圓頂?shù)慕Y構，如在圖3(b)中所示，并且驚奇地 且出乎意料地產(chǎn)生了優(yōu)異的傳感器性能特征。圖4顯示由在校準流體中轉為在血液中的點 固化丙烯酰胺BUN傳感器的典型傳感器輸出數(shù)據(jù)，并且圖5顯示在血液中點固化的丙烯酰 胺BUN傳感器的典型傳感器相關數(shù)據(jù)。注意這些具有優(yōu)異的粘附力的結構與其他結構相比 在機械方面也更穩(wěn)健。在圖4中，計時電位圖顯示了當校準溶液在時間點200處測量時的電位差，然后在 時間點201將測試樣品或在這種情況下具有低尿素濃度和高尿素濃度的兩種不同的血液 樣品添加至傳感器。在傳感器輸出穩(wěn)定的短時間之后，在時間點202測量電位差。可以使 用時間點202與時間點201之間的電位差來確定樣品中的尿素濃度。這是基于能斯特方程 (Nernstequation)，其中由經(jīng)驗確定斜率和截距。可以將時間點202和201的電壓改變對 分析物濃度的對數(shù)進行半對數(shù)作圖從而得出電壓基于分析物濃度的線性反應圖。在圖5中，比較了新的UV固化的酶固定層(EIL)與在ELVACE (也稱為成膜乳膠) 中配制的現(xiàn)有技術酶。實驗使用了兩種不同的生物傳感器芯片，一種是加熱的(BCL4-5)，另 一種是未加熱的(BCL3-5)。使用兩種不同的血液供體樣品169M(雄性)和658F(雌性)。 一些樣品在不用額外的尿素增敏(spiking)的條件下測試，而其他的樣品通過添加尿素來 修正，識別為低增敏和高增敏。對于每種測試條件建立5個套筒，并且記錄以mV為單位的 原始電位差。對于每種測試樣品計算5個樣品的標準偏差(SD)。這些數(shù)據(jù)顯示了與現(xiàn)有技 術基于ELVACE的方法相當?shù)臉藴势?。重要的是，對于EIL方法，發(fā)現(xiàn)具有一致地再現(xiàn)的傳感器的影響是精確度的增加、 印刷厚度的再現(xiàn)性、改進的制造容易性和改進的產(chǎn)物產(chǎn)率。例如，圖18顯示對于一定范圍 內(nèi)的印刷厚度，測量的電位差不受印刷厚度顯著影響，證明了這種EIL方法的穩(wěn)健性。CV1、 CV2、CV3、CV4和CV5是分別含有如下濃度的尿素的標準測試流體152. 5,57. 8,10. 7、5. 9和 3. 4mg/dL BUN。除了尿素之外，這些溶液還含有其他鹽和緩沖組分。在圖18中，測得印刷 厚度為57.3、71.4、97.3μπι并且進行作圖。當配制包含在基本上均勻的含水混合物中的一種或多種酶、丙烯酸基單體、水溶 性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑的酶固定組合物時，通常需要考慮溶解度和緩沖 作用二者。酶一般需要接近ρΗ 7的含水緩沖溶液，但是也有例外，例如，堿性磷酸酶。大 部分光引發(fā)劑還在含水類溶劑中具有有限的溶解度。此外，丙烯酸樹脂交聯(lián)劑也僅略溶于 含水溶液。發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的1-[4_ (2-羥基乙氧基)_苯基]-2-羥基-2-甲基-1-丙烷-1-酮 (由Ciba-Geigy制造，Irgacure 2959)在溶解于丙烯酸樹脂溶液(單體和交聯(lián)劑)中時溶
14解度略高并且其可溶解在含水溶液中。較高濃度的光引發(fā)劑是優(yōu)選的。然而，重要的是光 引發(fā)劑不從溶液中沉淀出來并且鑒定適當?shù)臐舛确秶苤匾?。范圍在約0. 5%至約4. 0% (w/v)的濃度是優(yōu)選的。由于這種光引發(fā)劑對310nm的UV光敏感，發(fā)現(xiàn)其一般對室內(nèi)光不 敏感，并且由此發(fā)現(xiàn)其可用于生產(chǎn)過程而不需要紅室或黃室制造條件。圖14(a)和(b)顯示用于點固化的具有優(yōu)選的實際混合物組合物的基質的試劑 表。第一個實例是僅有的酶為脲酶的點固化傳感器(圖14(a))，而第二個實例是脲酶與碳 酸酐酶組合的傳感器(圖14(b))。在優(yōu)選的脲酶混合物中，混合次序如下與本申請中優(yōu)選采用的丙烯酸樹脂制劑相比，通常用于電泳凝膠的丙烯酸樹脂具 有高的單體與交聯(lián)劑濃度比。電泳型樹脂(例如，丙烯酰胺和雙-丙烯酰胺)通常的單體 濃度和交聯(lián)劑濃度分別為0. 2g/ml和0. 007g/ml，而本發(fā)明的優(yōu)選基質具有單體濃度和交 聯(lián)劑濃度分別為0. 05g/ml和0. 02g/ml的丙烯酸樹脂制劑。認為這種較高的交聯(lián)劑與單體 的比率有利于在固化和干燥期間減少微分散印刷的物理改變。在多個實施方式中，組合物 包括大于約0.04 1的交聯(lián)劑與單體的重量比率，例如大于約0.1 1或大于約0.3 1。 這些比率還有利于傳感器與生物樣品(例如，血液)水合。為了實現(xiàn)所期望的單體交聯(lián) 劑的比率和防止從溶液沉淀出來，在優(yōu)選實施方式中用表現(xiàn)出較高的水溶性的1，4_雙(丙 烯酰)哌嗪(BAP)代替典型的凝膠電泳交聯(lián)劑雙-丙烯酰胺。晶片制造和牛物傳感器優(yōu)選使用硅晶片作為在其上產(chǎn)生生物傳感器芯片的固體基底。其他材料如塑料氧 化鋁和玻璃可代替硅，然而前者是用于高體積(例如每年數(shù)百億的儀器)制造平坦結構的 方便材料。在硅上，在特定位置添加材料層以產(chǎn)生一組單個的芯片。這些方法是本領域的那 些技術人員所熟知的。對于本發(fā)明，優(yōu)選通過熱解在硅上形成二氧化硅薄層。然后將鈦或 鈦-鎢合金濺射下來并且光形成(photoform)于二氧化硅層頂上。這用作粘附銀和其他金 屬的層。在此實例中，使用熟知的方法將銀和氧化銀形成于芯片上，如圖2(a)所描繪的。在 圖2(a)中，用于連接至分析儀儀器的接觸墊350與多個傳感器和電連接器連接。具體地， BUN傳感器353的下層含有銀和氯化銀。氯離子傳感器352也具有銀/氯化銀層。接地電 極351是與樣品具有多個接觸點的光形成的氯化銀電極。它形成接地電位以供芯片上其他 傳感器的電測量。參比電極結構由354描繪，并且詳細描述于美國專利第4，933，048號和 公開的美國申請第20070015977號中，通過引用將它們整體并入本文。這些層優(yōu)選在它們 的處理中使用若干光可界定(photo-definable)的掩膜以容許材料在特定位置準確沉積。圖2(b)描繪該過程中的下一步，其中將銨離子載體層355沉積在圖2(a)所顯示 的BUN銀/氯化銀沉積物頂上。銨離子載體層及其制備方法描述在美國專利第5，200，051 號中，通過引用將其整體并入本文。這之后是微分散圖2(c)中所顯示的氯離子(CL)傳感 器352以及圖14中所述組合物的基于UV的BUN EIL膜356。圖1以拓撲方式描繪根據(jù)本發(fā)明的一個非限制性實施方式的BUN傳感器的橫切 層。所顯示的BUN傳感器包括附圖2(a)-(c)中所表現(xiàn)的方法中所描述的參考傳感器。硅 晶片320覆蓋有二氧化硅層315，以及鈦或鈦-鎢合金310，繼而是銀305和氯化銀304。在 銀/氯化銀層之上印刷PVC離子載體組合物325，繼而是含有脲酶酶的EIL酶層311。在圖1中，參比電極也含有發(fā)現(xiàn)直到銀/氯化銀層304的所有上述層，但是還含有電解質層312、氣體透性膜308并且任選地經(jīng)光致抗蝕帽(photoresist cap) 309處理。自動化集成的微分散和點固化系統(tǒng)在本發(fā)明的優(yōu)選方面，本發(fā)明的微制造方法是自動化系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在感興趣 的傳感器中所用的平坦表面材料的選擇區(qū)域微分散精確的且可編程的量的材料并且還通 過UV輻射的方法提供集成的固化，優(yōu)選點固化。本方面中的關鍵概念是控制關于微分散步 驟的時間域以及隨后UV暴露步驟的時間控制和持續(xù)時間。此處，時間域的控制通常為百分 之幾秒。這與對于微制造的儀器所熟悉的高體積制造方法是一致的。在一個實施方式中，分散頭包括具有基質儲器的注射器針和用于控制來自注射器 并到達所選表面上的分散體積的排放器件。該裝置還包括用于相對于分散頭和所述UV輻 射源二者移動表面(例如硅晶片)的步進重復機構，從而使得能夠在一組預選位置形成固 定化酶層陣列。優(yōu)選地，被分散的受控體積在約InL至約10 μ L的范圍內(nèi)，例如，約5nL至約1 μ L 或約50nL至約0. 1 μ L，并且分散的體積將覆蓋約10平方微米至約75平方毫米的范圍內(nèi)的 區(qū)域。優(yōu)選地，此區(qū)域基本上為圓形的，其半徑尺寸范圍是約5μπι至約5mm。在優(yōu)選的實施方式中，該系統(tǒng)提供了通過在表面上一組預選的位置分散一系列受 控體積的光可形成的基質(例如，本發(fā)明的上述酶固定組合物)在基本上平坦的表面上形 成固定化層的有組織的陣列的方法。這之后在基本上覆蓋各預選位置的區(qū)域上施加UV輻 射束。重要的是，這是按順序發(fā)生的，在分散每個受控體積后的預定時間開始并且以預定的 強度施加所述輻射一段預定的持續(xù)時間，從而形成固定化層的所述固定化陣列。優(yōu)選地，預 定的時間在約0. 1秒至約10秒的范圍內(nèi)，并且預定的持續(xù)時間在約0. 1秒至約10秒的范 圍內(nèi)。優(yōu)選地，該方法使用的UV輻射波長范圍是約185nm至約400nm并且具有約IOOmW/ cm2至約lOW/cm2范圍內(nèi)的強度。如本領域的專業(yè)人士所已知的，固化可以通過在所選位點 產(chǎn)生特定劑量的UV輻射來實現(xiàn)。熟知的是時間、強度和距離參數(shù)全都會影響UV輻射劑量 并且可以調節(jié)它們來產(chǎn)生特定的UV劑量。通常，高強度能夠產(chǎn)生更多熱并且能夠對該過程 有其他影響。優(yōu)選的方法還使用為硅晶片的平坦表面，并且預選的位置組為通?；赬-Y 陣列中的單元電池的所述晶片上的傳感器陣列。關于印刷步驟后的UV暴露的定序，該方法 優(yōu)選以如下的方式操作其中將UV輻射束施加至Nth負X預選位置同時分散發(fā)生在Nth預 選位置。通常，X等于從1至10的整數(shù)。在脲酶膜(311和356)的優(yōu)選實施方式中，參數(shù) UV暴露參數(shù)包括310nm波長、暴露于4. 2ff/cm2的輻射0. 56秒。圖6圖解根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的微分散系統(tǒng)。如所顯示的，微分散系統(tǒng)包 括真空吸盤(vacuum chuck) 106和注射器102與105，它們的每一個都連接在單獨器件上， 所述單獨器件用于改變這些元件的垂直、水平、側向或旋轉移位中的一個或多個。出于經(jīng)濟 的原因，只要人們可以多個方向地改變真空吸盤的位置，則具有改變注射器垂直移位的器 件就足夠了。兩種元件的移動均可以經(jīng)由個人電腦來控制。在一個方面，真空吸盤的位置 可能在士51微米內(nèi)可再現(xiàn)或在χ和/或y方向的任一方向或兩方向更佳，并且吸盤的平面 度在1微米之內(nèi)?？梢詫⒈景l(fā)明優(yōu)選實施方式的基質制劑加載到微注射器組件102中用于以可控 方式建立層的目的。微注射器組件優(yōu)選配備有25至30個內(nèi)徑為150 μ m且外徑為300 μ m 的規(guī)針(gauge needle) 105。通常，包括細長構件和針尖的微注射器針105由金屬材料制
16成，例如像不銹鋼?？梢詫㈩~外的層涂覆到針上以改變其表面性質。此外，也可以采用諸如 合成的聚合物的其他材料來制造針的主體本身。依據(jù)電極表面的預處理和所應用的流體的 體積量，可以一致地獲得厚度范圍在約1 μ m至約200 μ m的膜層。UV固化微分散子系統(tǒng)(圖6)任選地包括與管道連接的閥101，所述管道連接至針 夾持器和筒102以及針105。微分散的小滴可以使用顯微鏡100進行光學監(jiān)測。微分散的 小滴使用來自聚焦透鏡組件104的UV光進行固化，該聚焦透鏡組件104使用來自任選的光 導纖維103的輻射。非限制性圖7顯示在使用來自光導纖維103的輻射的聚焦透鏡組件104中聚焦的 輻射，該輻射是由UV燈箱150中的UV燈泡151產(chǎn)生的。如所顯示的，光輻射的量和暴露時 間是使用燈箱150中的遮光器/縫隙(shutter/aperture) 152來控制。后者任選地使用電 腦算法來進行。微分散系統(tǒng)的一個非限制性實施方式還在圖8 (a)中圖解，其中氣動閥101產(chǎn)生壓 力用于系統(tǒng)沿管道132進入針夾持器和筒102。如所顯示的，針夾持器和筒102由握持注射 器130的注射器殼體131握持。注射器130容許微分散的小滴穿過針105傳遞。UV聚焦透鏡組件104的任選實施方式還在圖8(b)中圖解，其中經(jīng)由光導纖維103 將UV光通過光導管(light guide) 405提供給集中器殼體(concentrator housing) 401 集中器殼體401是使用固定架400附連至光導纖維103。在此實例中，光是用兩個透鏡403 聚焦的，這兩個透鏡由透鏡架402中的透鏡定位架(lense spacer)404保持在適當位置。一 個透鏡可能就足夠，但是其他任選的透鏡是任選的并且為本領域的那些技術人員所理解。用于微分散和UV固化的任選的電腦控制過程可以通過圖9中所描繪的算法進行， 其中針上移并遠離X-Y盤，X-Y盤繼而被置于第一印刷位置。針下移到極接近于印刷位置， 然后產(chǎn)生印刷壓力達一段短暫的時間。然后在印刷壓力完成分散微滴后將針升起。與微分 散過程同時發(fā)生的是，一旦X-Y盤將其本身設置在新的印刷位置，拖動的UV固化過程便開 始并在X-Y盤再次移動之前完成。在每個印刷位置重復這個過程直至所有的位置都被印刷 和固化?？梢员辉佻F(xiàn)地分散的小滴大小在廣泛的范圍內(nèi)延伸。對于約5至約500納升(nL) 之間的體積大小，可以優(yōu)選地應用具有約5%的精確度的小滴。具有0. 精確度等級的螺 線管足以用于此目的。取決于待分散的體積，傳感器上方注射器針尖的高度優(yōu)選在約0. Imm 至約Imm之間。一般地，小滴體積越小，則針距離傳感器的上升高度就越低。注射器針與傳 感器預選區(qū)域的精確對準可以借助于照相機和十字線(reticle)從光學上實現(xiàn)。這種操作 可以通過操作員手動進行或借助于視覺識別系統(tǒng)自動進行。后者是優(yōu)選的。當單個流體滴形成并被排出針時，考慮所涉及的動力學是有用的。隨著更多流體 從針尖排出，小滴尺寸將增大直到作用于小滴質量的重力超過維持小滴與針尖接觸的反作 用力。這些反作用力包括針尖與流體或液體之間的粘附力和液體自身的表面張力。已經(jīng)充 分確定在完全形成不連續(xù)的小滴的低液體流速下，小滴體積是固定的。然而，可以通過改變 上面所討論的任何流體相關參數(shù)或通過改變針尖的直徑由此改變用于流體粘附的可用表 面積來改變該體積。例如，將疏水的聚四氟乙烯(PTFE)涂層施加于針尖通過降低小滴與針 尖之間的粘附力而降低含水類基質材料的天然小滴尺寸。在其中必須將受控體積微分散到 表面上的情況下，有可能使微注射器尖設置在平坦的表面上方一段高度上，該高度不容許
17小滴完全形成(并且然后在重力的影響下落到表面)，但是部分形成的小滴實際上接觸表 面并且液體與表面之間的新的粘附力開始使小滴展開。如果現(xiàn)在針尖在Z-方向上遠離表 面縮回一段足夠的距離，則液體的內(nèi)聚力被克服并且小于固定小滴尺寸的液體體積保持與 表面接觸。這種技術可以用于從千分之一或更大的固定小滴大小再現(xiàn)性地分散任何體積的 液體。純液體與其汽相之間的表面張力可以通過添加試劑來改變。例如，添加至水中的 脂肪酸降低表面張力，而添加的鹽則可增加表面張力。本發(fā)明的可微分散的流體組合物優(yōu) 選被制備成具有受控的優(yōu)化的表面張力。在需要時可使用合適的添加劑。流體的疏水性或 親水性以相同的方式被控制。當需要固化膜作為終產(chǎn)物時，優(yōu)選地小心調節(jié)固體含量和揮 發(fā)性溶劑含量。此外，還使用這些組分的比率來控制粘度。用于銨離子傳感器的優(yōu)選的可微分散的組合物包含PVC聚合物、增塑劑、離子載 體和溶劑，其粘度一般高于用于膜的平面澆注(例如，旋涂)的那些組合物的粘度。這些較 高粘度的組合物固化或干燥而不使膜層變形。這些組合物還減輕了相關的問題，例如，確保 高粘度基質的均勻性并由此防止一段時間后(即，關于貨架期的考慮)材料的相分離。還 使用其他添加劑來防止膜的長期降解。除了與具有優(yōu)化的表面張力(與指定的組合物相關)的流體的受控體積分散有關 的上述因素外，調整基底或表面(其上分散流體)的表面自由能提供了對所得層的最終尺 寸尤其是厚度的控制。所得的方法是高度多用的，容許具有不同組合物和效用的層的陣列 的沉積。為了確定膜厚度(例如，40-60 μ m厚)，優(yōu)選地調整表面使得微分散的流體與該表 面所成的接觸角很大。例如，在微分散含水類酶基質之前，可以首先對表面進行等離子體處 理以給出受控的接觸角。對于優(yōu)選的脲酶基質，四氟化碳等離子體步驟產(chǎn)生50° -70°范 圍內(nèi)的接觸角。此處所述的微分散系統(tǒng)的改良方面是自動的點固化部件的集成。EXFO Omnicure UV系統(tǒng)是集成所優(yōu)選的，因為其能夠連續(xù)地監(jiān)測和調節(jié)光縫隙來確保整個過程中輻射強度 保持一致。這通過使用50%強度作為設置點而改善了典型的UV燈泡強度隨其壽命(約 2000工作小時)而降低的問題。因為在固化時間和燈泡強度之間存在關聯(lián)，所以需要相當 高的設置來降低產(chǎn)物處理時間。UV固化方法的另一方面是希望將光束聚焦在特定傳感器以避免UV暴露于其他傳 感器。需要適當?shù)木劢构馐员苊膺^于有限。這是因為用于對準被處理的各傳感器的顯像 系統(tǒng)需要足夠的柔性來確保在它們沒有被準確對準的情況下的穩(wěn)健過程。強度與UV光束 距固化位點的距離相關，因此，通過更接近固化位點增加強度并且降低產(chǎn)物處理時間。盡管本發(fā)明主要從具有微制造的離子選擇性電極的硅晶片方面來描述，但是可以 制造其他類型的傳感器來摻入到表面，本公開的組合物可以被分散或涂布到所述表面上。 這些傳感器包括光學傳感器、光纖傳感器、聲表面波傳感器、消逝傳感器、表面等離子體共 振傳感器和光波導傳感器。它還包括各種基部傳感器(base sensor)，例如，電極、離子選擇 性電極、電位測定電極、電流型電極、電導電極、酶電極、生物傳感器、光學傳感器、光纖傳感 器、聲表面波傳感器、消逝傳感器、表面等離子體共振傳感器和光波導傳感器。用于傳感器 的制造的基本上平坦的表面可以包括硅晶片、氧化鋁晶片、液晶基底、玻璃基底和塑料基底 以及柔性塑料基底。在優(yōu)選的實施方式中，將成膜組合物暴露于足以引起明顯交聯(lián)的UV輻
18射中，從而在表面上形成粘附的非溶脹性固定化酶層。優(yōu)選地對集成的微分散和UV固化儀器自動編程以便優(yōu)化制造過程的時間并實現(xiàn) UV固化。微分散和UV固化的步驟優(yōu)選地串聯(lián)進行。在優(yōu)選的方面，UV固化步驟進行約0.5 秒，而微分散步驟進行約0. 3至0. 4秒。因此，微分散步驟的速率通常受印刷位點之間約0. 1 秒的轉位時間(indexing time)限制。微分散和UV固化子系統(tǒng)優(yōu)選地在相同的時間段內(nèi) 在兩個不同但相鄰的物理位置操作，其中微分散步驟在UV固化操作之前和前面進行。圖9 提供了優(yōu)選的操作算法。具有集成的UV輻射源的分散裝置優(yōu)選地具有套準和對準器件，該套準和對準器 件能夠將輻射光束聚焦到基本上覆蓋基質滴所分散的位置的區(qū)域上。電腦器件能夠打開和 關閉UV輻射，并且這在基質被分散后在預定的時間發(fā)生并且持續(xù)一段預定的時間(并且還 以預定的強度進行)。套準和對準器件容許光束被聚焦在所述表面的所選區(qū)域并照射約10 平方微米至約75平方毫米范圍內(nèi)的區(qū)域。每個晶片優(yōu)選地用多個芯片制造(通常在5英寸的晶片上約1000個芯片)，每個 芯片含有一個或多個傳感器并且在此情況下每個芯片含有BUN傳感器。希望這些傳感器在 晶片上以均一的X-Y布局排列。對于優(yōu)選實施方式中的晶片處理，芯片優(yōu)選地是通過如下 產(chǎn)生的首先將膠帶置于晶片背面，然后使用例如金剛石切割機(diamond dicing saw)將 晶片裁切成單個芯片。此過程引起與芯片在晶片上的原始位置相比輕度的移位和不均勻的 布局。為了補償此現(xiàn)象，使用如圖6中所描繪的顯微鏡100連同視覺識別軟件一起再次對準 用于微分散過程的芯片。對于UV固化系統(tǒng)的初始對準和套準來說，使用UV敏感性紙來確 定正確的對準?？蛇x擇地，可以在光導管103上方插入可見光源來代替UV光源151以便對 準和聚焦UV固化位點。又一替代方法是使用具有焦點的UV檢測儀器(輻射計)并且使用 強度和活性來對準和聚焦UV位點。注意，可選擇地，切割步驟可以在分散和點固化之后進 行，然而需要小心以確保用于切割刀片的水冷卻劑不會產(chǎn)生損壞固化膜的切割粉塵。在基 底是塑料的而非硅晶片時，切割是通過更簡單的切削過程進行的，其中粉塵損壞不是問題。 此處優(yōu)選在分散和點固化之后切割。使用改良的傳感器的套筒構建然后將上述切割的硅芯片優(yōu)選地用作一次性塑料套筒的子部件。各套筒通常含有 若干部件，這些部件容許其用分析儀器處理患者樣品并測定樣品中分析物如尿素的存在或
Mo參考附圖，用于接受本發(fā)明的芯片的套筒包含罩(兩個視圖)，圖10、圖11 ；基部 (base)，圖13 ；以及設置在基部和罩之間并將它們固定在一起的薄膜粘附墊圈，圖12。具 體地，圖10中所顯示的罩的背側與圖12的墊圈的暴露面匹配，并且墊圈的背側與圖13的 基部的暴露面匹配?，F(xiàn)在參考圖10，罩1由剛性材料優(yōu)選塑料制成并且能夠在柔性鉸鏈區(qū) (flexible hinge region) 5、9、10反復變形而不開裂。罩包括蓋子2，蓋子2通過柔性鉸鏈 9附連至罩的主體。在操作中，將樣品引入樣品保持室34中之后，可以將蓋子固定在樣品 進入口 4的入口上方，借助于可變形的密封件11防止樣品泄露，并且蓋子通過鉤3保持在 適當位置。罩還包括兩個可相對于罩的主體移動的槳6、7，這兩個槳通過柔性鉸鏈區(qū)5、10 附連在罩上。在操作中，當通過泵器件運轉時，槳6對氣囊施加力以在套筒的管道內(nèi)移動流 體，所述氣囊由薄膜墊圈21所覆蓋的腔43構成。當通過第二泵器件操作時，槳7對可以變
19形的墊圈21施加力。套筒適于插入到讀數(shù)裝置中，并且因此為了此目的具有多個機械連接 和電連接。還應明顯的是對套筒進行手動操作是可能的。因此，將套筒插入讀數(shù)裝置中后， 讀數(shù)裝置將壓力傳送到位于腔42中裝有約130 μ L的校準流體的含流體箔包上，在釘38上 使包裝破裂，并將流體排入管道39中，管道39經(jīng)由在基部的短橫切管道連接至傳感器管道 16。當校準流體接觸傳感器時，傳感器潤濕并建立與流體中的校準離子或分子的量相關的 信號。參考圖12，薄膜墊圈21包含多個洞和裂縫以促進基部和罩中的管道之間的流體 轉移，并容許墊圈在需要時在壓力下變形。洞30和33容許在切去部分(cutaway) 35或37 中所容納的一個或多個尿素傳感器和一個或多個參比電極與管道16中的流體接觸。參考圖13，管道34是在組裝的套筒中連接樣品進入口 4與第一管道16的樣品保 持室。切去部分35和37是接納本發(fā)明的芯片的殼體中的位置。任選地，它們還容納用于 測定空氣_液體邊界位置的電導傳感器。凹處42容納含流體的包裝，如可破裂的袋，該包裝 在組裝的套筒中由于插入讀數(shù)裝置中時施加在槳7上的壓力而被釘38刺穿。來自被刺穿 的包裝的流體在39處流入第二管道，然后流入管道16。氣囊由凹處43構成，凹處43在其 上表面被墊圈21密封。氣囊是泵器件的一個實施方式，其通過施加于槳6上的壓力開動， 槳6排放管道40中的空氣，從而將樣品從樣品室34排放入管道16。形成和固定膜陣列的改良方法在一個實施方式中，制造BUN傳感器的方法需要兩個獨立的印刷事件。第一步包 括NH4+離子選擇性電極(ISE)印刷步驟，隨后是脲酶層印刷步驟。如上文所述，印刷過程優(yōu) 選地使用氣動泵和閥，并且在X-Y臺頂上面具有細規(guī)針以將小滴準確地微分散到晶片上的 特定位置。幾種可控因素有利于整體傳感器的性能。這些因素包括(i)在所期望的位置上 印刷的小滴的準確套準、( )小滴的適當粘度和表面張力、(iii)相關的表面疏水性、(iv) 小滴的高度和寬度(或體積)、(ν)小滴在表面上干燥后的高度、以及(vi)良好的粘附力。 此外，晶體的形成(分割)或已干燥的微滴的開裂可能不利地影響傳感器性能?，F(xiàn)有技術的酶膜(參見，例如美國專利第5，200，051號)是由成膜乳膠優(yōu)選 ELVACE (Forbo Adhesives Synthetic Polymers,Morris, Illinois)構成。然而，這禾中不均 勻材料可能易于干燥并且阻塞微分散針尖，這可能對制造具有不利影響。ELVACE的表面張 力還可能產(chǎn)生不規(guī)則形狀的結構，這可能影響傳感器的性能。參見圖3(a)。此外，ELVAC為 由親水區(qū)和疏水區(qū)構成的乙酸乙烯酯乙烯(VAE)共聚物，它可能隨時間降解，最可能產(chǎn)生 使材料酸性更強的乙酸根。這種時間依賴性過程降低了材料的使用壽命。結果，希望用實 質上更穩(wěn)定的組合物代替這種不均勻基質，所述更穩(wěn)定的組合物優(yōu)選地為均勻含水基質， 所述均勻含水基質可以光形成的并且為酶如脲酶提供穩(wěn)定的固定環(huán)境。本發(fā)明解決了幾種壽命問題，包括原材料的壽命、印刷前含水基質的壽命以及在 成品傳感器中的印刷基質和固化基質的壽命。它還經(jīng)受得住與終產(chǎn)物中血樣的接觸而不會 溶解掉。這提供了對于可靠的傳感器性能所高度希望的良好粘附特征的證據(jù)。對于可靠的制造方法來說最重要的是，本發(fā)明提供了在約4°C至約35°C范圍內(nèi)的 儲存溫度下保持在溶液中而沒有亞組分沉淀的可微分散的基質。它還可以冷凍儲存，并融 化以供使用而無有害作用。有利的是，基質組合物在延伸至約至少200 μ m的范圍內(nèi)的厚度 下印刷還具有足夠的UV透射以便在整個基質中具有高聚合物轉化度。
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本發(fā)明是有利的，因為基質在印刷過程中以低粘度狀態(tài)存在并且然后通過UV輻 射被可控地轉化為凝膠狀態(tài)或固定狀態(tài)。這種使用UV固化過程的受控方法需要在制劑中 摻入UV光引發(fā)劑。這還需要可以產(chǎn)生導向至被固化的部分的受控的UV輻射的固化系統(tǒng)。 這種UV固化系統(tǒng)的這種具體說明需要提供(i)簡單的自動化；(ii)對與印刷系統(tǒng)相容的 短循環(huán)時間的操作；(iii)避免固化過程期間破壞切割的晶片；(iv)避免對烘箱或熱固化 步驟的需要；和(V)避免對連續(xù)的基質混合的需要。此外，希望避免不必要的材料浪費。如 先前所提到的，從制造觀點來看，如果大批量的材料被制備、預等分并以冷凍形式儲存，本 發(fā)明也是有用的。本發(fā)明容許穩(wěn)健的制造工藝。穩(wěn)健制造工藝的方面容許在該工藝中的每一步驟都 具有某個精確度范圍，同時產(chǎn)生一致的產(chǎn)物結果。對于該工藝的一個步驟，印刷厚度可以略 微不同。從數(shù)據(jù)(參見圖18)有利地發(fā)現(xiàn)平均電位信號不依賴于印刷厚度。此外，在許多 晶片中這些值的標準偏差完全不依賴于印刷厚度。這容許有廣泛范圍的酶層厚度而不影響 產(chǎn)物的性能?？梢允褂枚喾NUV系統(tǒng)，包括光棒(light wand)、具有或不具有烘箱步驟的UV泛光 固定以及光導管系統(tǒng)。UV激光也可以用于這種工藝以將聚焦的輻射束傳遞至印刷的傳感器 位點。對于在硅晶片或諸如玻璃和塑料的類似基底上固化印刷膜的過程，需要將光棒設置 在每個印刷位置上。這可以將固化步驟時間增加nXt，其中η是芯片/印刷位置的數(shù)目并 且t是每個UV固化步驟的以秒計的時間。在一個實施方式中，UV固化步驟是由將光棒準 確地移動到各連續(xù)的印刷位置的系統(tǒng)提供。光棒的移動結合有每個印刷位置的印刷事件。對于其中UV源的移動不依賴于印刷頭的系統(tǒng)，基質首先由印刷針印刷在特定位 置。印刷針移動遠離表面，優(yōu)選在Z方向上。然后UV源移至位置中，隨后是在該印刷位置 的UV固化暴露。在其中UV源拖動一段距印刷位點的固定偏移時，印刷針以打字機型印刷過程的 方式印刷(例如，由左至右，然后返回左側并且轉換到印刷位點的下一行，再次從左至右處 理)。UV源位于遠離印刷針位置的一個或多個印刷位點η。印刷針印刷第一印刷位點，然 后印刷另一印刷位點直至其到達η個印刷位點。跟隨在印刷針后的是UV源。一旦UV源 位于左側第一印刷位點，遠離印刷針η個位點，則UV源暴露并固化印刷位點。當印刷針移 至下一印刷位點時，UV源也移至下一位點，并且當印刷針分散基質時，UV源暴露印刷位點。 這種印刷和拖動UV固化過程持續(xù)到印刷針到達平坦表面的右側。為了完成UV固化過程， 針繼續(xù)向右移動，UV源隨之移動繼續(xù)固化剩余的η個位點?？梢詫τ∷⑨樉幊桃酝Ｖ褂∷?剩余的印刷位點。將印刷針和UV源轉換到待印刷的下一行并且在平坦表面的左側開始設 置。本領域的那些技術人員應了解印刷針和UV源可以被固定在它們的位置，并且可以移動 支持平坦表面的臺以實現(xiàn)印刷針和UV源移動至各單獨印刷位點。本領域的那些技術人員 將認識到可以使用其他工程套準器件來實現(xiàn)確保時間域的一致控制的目的，以使得各分散 層在印刷后固定的時間且以固定的方式被固化。在優(yōu)選的實施方式中，使用光導管。光導管為有效地用于光的導管，其中光被聚焦 到小的晶片區(qū)域上并且其中光不是從UV源以直線傳遞的。UV輻射由光纖連接沿光導管指 引。這具有光棒系統(tǒng)的優(yōu)點，在光棒系統(tǒng)中，燈和濾器被包含在電源盒中并且“閃光燈”使 用在固化位點位置處的極小的足印。此外，UV輻射含有較少的來自紅外輻射的附加熱，并因此保持固化的部分冷卻。在基質中存在的特定光引發(fā)劑需要特定的輻射波長時，這通過選擇適于那種特定 光引發(fā)劑的特定UV燈泡來達成。大部分的標準UV燈泡產(chǎn)生多種波長，一些是希望的而一些 未必是希望的。在具有生物材料的應用中，優(yōu)選的是具有特定輻射波長而在其他波長處沒 有額外的無關輻射。注意，在科學文獻中熟知的是UVC輻射的生物損害性低于UVA或UVB。 因此，避免或限制這些波長對于生物樣品是優(yōu)選的。在使用Irgacure 2959的優(yōu)選基質制 劑中，優(yōu)選的輻射波長為約310nm。常見的UV燈泡使用汞(“H”型)和金屬鹵化物(“D”)， 它們都可用于固化，因為它們產(chǎn)生含IrgaCUre2959光引發(fā)劑的基質所需的UVA和UVB輻 射。然而，“H”燈泡具有較少的無關輻射波長并且是優(yōu)選的。對于UV系統(tǒng)有益的是具有集成的濾光器，該濾光器容許特定波長的非離子輻射 通過同時阻止不希望的波長透射。在優(yōu)選的實施方式中，光引發(fā)劑需要近310nm的輻射。作 為限制傳感器暴露于有害波長的輻射的手段，可使用諸如有效地僅容許約300nm至340nm 波長的 Gilway and International Light Technologies 公司(Peabody，MA)Narrowband Filter NS313的窄帶濾器用于優(yōu)選的實施方式。單獨使用或組合使用影響對于某些其他光 引發(fā)劑特異的合適輻射波長的其他濾光器對于本領域的那些技術人員來說將是明顯的。在優(yōu)選的實施方式中，光導管系統(tǒng)(圖6、7和8b)具有點固化能夠將光導向特定 位置的優(yōu)點。此外，它可以被容易地過濾，并且不產(chǎn)生在過濾紅外(IR)輻射的基于泛光暴 露的系統(tǒng)中所發(fā)現(xiàn)的熱。它也不需要單獨的遮光器系統(tǒng)，因為這種部件已經(jīng)集成到了儀器 中。這種方法對于集成微分散系統(tǒng)來說也是期望的，因為可以將電源設置在微分散殼體的 外側，僅將光導管和集中器殼體及其相關透鏡插入微分散單元內(nèi)部以使足印達到最小。期望UV可固化的酶基質具有下列特征(i)與酶的相容性，并且尤其對于優(yōu)選的 實施方式與酶脲酶的相容性；(ii)表現(xiàn)出適當?shù)牧鲃有院驼扯纫员憔哂辛己玫挠∷⑻卣鳎?(iii)與可以支持高產(chǎn)率制造工藝的可靠化學制劑的相容性，例如摻入用于改善基質貨架 期的抗微生物劑和用于穩(wěn)定酶的試劑；(iv)為支持生物試劑的基于水的技術；(v)UV固化 步驟后得到對表面的可靠粘附力；(vi)當與傳感器結合使用時，提供快速的潤濕；(vii)在 形成作為支持和保持酶反應的層時表現(xiàn)出適當?shù)拿傅孜锿感院屯杆裕?viii)當與電化 學傳感器一起使用時表現(xiàn)出良好的電氣特征；以及(ix)在室溫下或在冷藏時顯示出大于 約6個月的延長的后處理壽命，例如與真正的商購產(chǎn)品要求相符。圖14中所述的組合物具 有這些希望的特征。本文所述的UV固化系統(tǒng)可以與各種UV可固化的制劑一起使用以表征許多操作參 數(shù)，包括固化膜尺寸的精確度和準確度以及膜對表面的粘附力。然后可以將傳感器在套筒 中測試以測定對于給定的基質和固化組合的傳感器性能。這可以包括晶片內(nèi)和晶片間變 動，其中每個晶片可以包含多至一千個傳感器。在圖16中是輻射對基于圖14(a)的基質的傳感器性能的作用。使用泛光燈法和 具有輻射劑量分別為190,380,760和1140mJ的0. 5s、ls、2s和3s點固化UV輻射的方法制 備了多個批次的傳感器。這些數(shù)據(jù)顯示所述方法是穩(wěn)健的，且不同的輻射條件給出可接受 的測試結果。圖15展示含有替代單體和交聯(lián)劑的組合物產(chǎn)生了與測試溶液類似的傳感器信 號。測試的單體包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、聚(乙二醇)丙烯酸酯(PEGA)和N-[3-( 二
22甲氨基)丙基]_甲基丙烯酰胺(DMAPMA)。此外，測試的交聯(lián)劑包括1，4_雙(丙烯酰) 哌嗪、聚乙二醇二丙烯酸酯聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)、N，N' -(1，2-二羥亞乙基) 雙-丙烯酰胺(DHEBA)和三羥甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯(TMPETA)。圖17顯示在加速的壽命儲存條件(例如，30°C或40°C )下缺乏濕潤劑甘油時對性 能有影響的實驗。通過向已有的基質(參見圖14中的組合物)中添加甘油，得到了具有良 好的性能和貨架期的方法。改善的血液尿素氮傳感器的制造在一個方面，本發(fā)明的目的是改善BUN(血液尿素氮)傳感器的制造。新BUN傳 感器的優(yōu)選實施方式是使用薄膜微制造方法與微分散技術的組合制造的。它包括與美國 專利第4，933，048號(通過引用將其并入本文)中所述類型的薄膜銀-氯化銀參比電極 的組合操作的薄膜銀-氯化銀指示電極。更優(yōu)選的參比電極描述于公開的美國申請第 20070015977號中，通過引用將其整體并入本文。在初始步驟中，通過熱氧化用二氧化硅絕緣層覆蓋硅基底晶片。隨后將鈦與 鎢的合金(TiW)的金屬層和銀金屬層沉積到二氧化硅基礎晶片上，然后使用光刻技 術將其圖案化。然后將諸如聚酰亞胺聚合物或另外的二氧化硅的電絕緣層光圖案化 (photo-patterned)以隔離相鄰的傳感器電路。銀-氯化銀指示電極(直徑約200微米) 是在存在氯離子的條件下使用標準技術由圖案化的銀制備的，所述標準技術例如電化學、 氯氣等離子體和通過諸如Cr2O72-或Fe3+的無機氧化劑對Ag°進行的氧化。BUN電極的剩余層包括兩個厚膜結構(i)半透性膜的膜，其包含有機聚合物層 (例如，聚(氯乙烯)-PVC)和銨離子離子載體；和(ii)最外側的生物層，其在此具體傳感 器中包含點光固化的丙烯酰胺脲酶層，該丙烯酰胺脲酶層任選包含碳酸酐酶。這些層通過 美國專利第5，554，339號中所述的微分散技術沉積，通過引用將該專利并入本文。然而在 本發(fā)明中，對‘339專利中所描述的微分散部件進行了實質性改良以使其包括集成的紫外 點固化組分系統(tǒng)從而使得能夠在受控的時間域內(nèi)自動的印刷和固化，如上文所描述的。厚膜的銨離子敏感結構包含聚(氯乙烯)(PVC)粘合劑、作為增塑劑的三(2-乙基 己基)磷酸酯和作為離子載體的無活菌素?？梢酝ㄟ^使用相同的(或類似的)粘合劑和增 塑劑組合物但用不同的離子載體使指示電極對不同的離子具有選擇性。例如，纈氨霉素、莫 能菌素和(甲基)莫能菌素、以及三(十二烷基)氯化銨已被分別用于制備鉀離子、鈉離子 或氯離子選擇性電極。其他離子載體可以包括但不限于冠醚、三烴基胺或磷酸酯以及類似 物?？蛇x擇地，除PVC外可使用其他聚合物粘合劑材料。這些聚合物可以包括例如，硅橡 膠、聚四氟乙烯塑料或含有可電離的官能團(例如，羧酸根)的PVC衍生物。適合于在本發(fā) 明中使用的其他增塑劑可以包括但不限于三(2-乙基己基)磷酸酯、硝基傘花烴、2-硝基 苯基辛醚、癸二酸二丁酯、己二酸二乙酯、鄰苯二甲酸酯、碳酸亞丙酯、5-苯基戊醇或它們的 混合物。本領域的那些技術人員可以知道還有其他的粘合劑和離子載體組合，它們在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。所得的半透性離子選擇膜可以具有約2微米至約200微米，優(yōu)選約10微米至 約30微米范圍內(nèi)的厚度。在優(yōu)選的實施方式中，選擇銨離子選擇性膜溶劑系統(tǒng)以提供適 當?shù)谋砻鎻埩头€(wěn)定性。增塑劑、PVC聚合物和離子載體的固體含量(wt% )優(yōu)選分別為 60-80%、15-40% 和 0. 5-3% ο可以使用多種方法來限定平坦基底上的層。如果需要厚層(約5微米至約200微
23米)，則一般優(yōu)選粘稠的基質的微分散，例如上述的光可固化的脲酶基質。用于在平坦基底 上限定層的其他方法包括但不限于旋涂、浸涂、噴涂、絲網(wǎng)印刷、噴墨印刷、激光印刷、涂抹 和接觸印刷，它們是替代性方法并且可以更好地適用于不同的應用。例如，可以在特定的時 間(t = 0)在單次運行中將優(yōu)選的脲酶光可形成的基質絲網(wǎng)印刷到晶片上。絲網(wǎng)任選具有 300 μ m直徑的開口，其中將各開口套準以便與晶片上的銨離子選擇性膜的陣列對準。在印 刷步驟之后，在t = 1時進行晶片的UV泛光暴露。與上述點固化方法類似，此方法也對各 單個基質給出了從印刷到UV步驟的時間域控制。在這個實施方式中，t = 1優(yōu)選被自動設 置在t = 0后的2-20秒。用于將晶片從印刷地點移動到暴露地點的自動化設備是制造領 域內(nèi)所熟知的。還可以用制造領域內(nèi)廣泛使用的方式將優(yōu)選的脲酶基質旋涂和用掩膜進行 光圖案化?，F(xiàn)在參考圖1中的拓撲圖解，基底晶片320是硅，其具有覆蓋的二氧化硅絕緣層 315。此外，具有聚酰亞胺層301，該層具有用于限制印刷的層的兩個圓環(huán)形印刷孔(302， 303)。第一金屬層310為TiW，并且它發(fā)揮著導體和對晶片的粘附層的功能。隨后的層305 和304是銀和氯化銀層。在圖1的左側，指示電極的剩余層包括(i)半透性膜的膜325，其 包含有機聚合物層(例如，聚氯乙烯(PVC))和銨離子的離子載體；和(ii)最外側的生物層 311，其在此具體實施方式
中包含上文所述的優(yōu)選組合物的丙烯酰胺光固化的脲酶層。單元電池的參比電極部分可以由如圖1中所示的覆層結構構成。在這個具體的實 施方式中，參比電極的金屬層和氯化的層被電解質層覆蓋，該電解質層可以包含能夠保持 高鹽濃度的任何材料，但該材料優(yōu)選為光可形成的。在此方面，聚乙烯醇(PVA)制劑是優(yōu)選 的材料，并且可以首先被光圖案化并形成透水性基質，該透水性基質可以隨后用諸如氯化 鉀的鹽飽和。還可以存在單獨的透氣性膜，該透氣性膜用于減少總分析樣品的電解質或鹽 的損失但容許在開始樣品分析之前參比電極的快速潤濕(即，水或其他小氣體分子通過) 參比電極。圖案化方法可以是美國專利第4，933，048號和公開的美國申請第20070015977 號中所述的方法，通過引用將它們并入本文?？蛇x擇地，可以使用這樣的參比電極結構其 中在液體交匯處與銀/氯化銀表面之間的距離足夠大以便使在緊鄰Ag/AgCl結構的電解質 濃度在一段時間內(nèi)基本上恒定，在該段時間內(nèi)足以進行指示電極與參比電極之間的電位差 測量?，F(xiàn)在參考圖2，指示電極和相鄰參比電極各自通過過鈍化的(overpassivated)信 號線連接至接觸墊。過鈍化層(聚亞酰胺層)包括形成為同心圓的印刷孔302和303。單 元電池被界定在矩形的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域在單個硅晶片上在陣列中重復數(shù)百次。在本發(fā)明的具體實施方式
中，其他指示電極可以存在于單元電池中以便除銨離子外還同時測量其他種 類(例如，Na+、K+、CD。為了制造BUN基部傳感器，將之前已經(jīng)用濃硫酸和過氧化氫的混合物小心清潔過 的具有二氧化硅表層的硅晶片放置到等離子體沉積系統(tǒng)中并且將TiW層(0. ιμπι)和銀層 (Ο.δμπι)連續(xù)地濺射到晶片表面。然后處理銀-鈦雙層使其定位于在最終的儀器中充當銨 離子傳感器的區(qū)域中。該過程是通過標準的平板印刷技術達成的，在該技術中用正型光致 抗蝕劑(Shipley AZ 1370 SF)旋涂晶片。在光致抗蝕劑通過掩膜UV暴露和顯影(Shipley AZ 351)后，通過作為蝕刻劑的硝酸鐵水溶液(0.9mM)移除暴露的銀。然后借助于相同的 光刻步驟處理下面的鈦層，但是使用硝酸(3. 9M)和氫氟酸(0. 78M)的含水混合物作為蝕刻
24劑。然后使用N-甲基吡咯酮溶劑來移除剩余的光致抗蝕劑以暴露所需的銀結構(直徑約 150 μ m)。為了鈍化信號線，將光可界定的聚酰亞胺(DuPont 2703)旋涂到晶片上。一旦晶 片被暴露于UV并用溶劑顯影后，將聚合物在350°C的烘箱中在惰性氣氛下烘烤30分鐘，并 使其冷卻至150°C，然后移出。盡管用于圖案化的掩膜限定了層的周界，其也限定了印刷孔 302和303。這些隨后被用于控制兩個對應的微分散膜的尺寸。然后優(yōu)選通過將整個晶片浸入重鉻酸鉀(12mM)和鹽酸(60mM)的含水溶液中來將 銀氯化。然后洗滌晶片并部分切割。在這些圖案化的氯化銀電極之上放置銨離子敏感的膜。 通過如下制備膜材料將低分子量PVC (Sigma)和高分子量羧化PVC (Type Geon, Goodrich) (1 lw/V)溶解在環(huán)己酮、苯丙酮和N-甲基吡咯烷酮(1 1 lv/v/v)的溶劑系統(tǒng)中至 總固體含量為10g/dL的溶液。溶解是通過在70°C下加熱混合物30分鐘來完成的。向該混 合物中添加增塑劑三(2-乙基己基)磷酸酯(Fluka)以提供35g/dL的總固體含量。然后 使所得混合物冷卻至45°C并以等于混合物中總固體的2%的量添加無活菌素(Fluka)。在 室溫下，將IO-IOOnL的這種終材料微分散到在晶片上的每個氯化銀指示電極上，在四面八 方重疊至少約30 μ m。優(yōu)選使用印刷孔302來限定周界。固化是通過將晶片放置在60°C熱 板上30分鐘來完成。此過程產(chǎn)生了厚度為約15 μ m的穩(wěn)定的粗糙結構。在最后的步驟中，將上述優(yōu)選的脲酶基質微分散到單個膜上并使用該裝置進行UV 點固化。優(yōu)選使用印刷孔303來限定周界。如上面所提到的，在優(yōu)選的制劑中，在使用前將 組分混合在一起并在深低溫冰箱中冷凍。這容許逐日一致地制備產(chǎn)物并且在微分散前具有 長儲存壽命。這種制劑還可以在微分散事件之前進行質量控制(QC)測試，因為可以使用標 準的參考方法利用分光光度計測定混合物的酶活性。這降低了在制造過程中制備產(chǎn)品的成 本和浪費。關于優(yōu)選的標準測定方法，來自融化的冷凍制劑的等分試樣的脲酶酶活性是使用 Kaltwasser & Schlegel 的改良方法評估("NADH-dependent coupled enzyme assay for urease and other ammonia-producing systems (脲酶禾口其他產(chǎn)氨系統(tǒng)的 NADH-依賴性的 偶聯(lián)酶測定)，"Analytical Biochemistry 16:132-138(1966))。該方法在與脲酶偶聯(lián)的 谷氨酸脫氫酶測定中測量了 340nm時NADH至NAD+的分光光度改變。使用改良的BUN傳感器的套筒分析在優(yōu)選的實施方式中，隨后將含有傳感器的成品芯片組裝到測試套筒中并用來進 行血液中的BUN測量。本發(fā)明的套筒的一個實施方式顯示在圖10-13中。套筒優(yōu)選地適于插入到讀數(shù)裝置中，并且因此為了此目的具有多個機械連接和電 連接。還應明顯的是套筒的手動操作是可能的。因此，在將套筒插入讀數(shù)裝置中后，讀數(shù)裝 置將壓力傳送到位于腔42中的裝有約130 μ L的校準流體的含流體箔包中，在釘38上使包 裝破裂，并將流體排入管道39中，管道39經(jīng)由在基部中的短橫切管道連接至傳感器管道 16。當校準流體接觸傳感器時，傳感器潤濕并建立與流體中校準離子或分子的量相關的電 信號。參考圖12，薄膜墊圈21包含多個孔和裂縫以促進基部和罩中管道間的流體轉移， 并容許墊圈在需要時在壓力下變形?？?0和33容許在切去部分35或37中所容納的一個 或多個尿素傳感器和一個或多個參比電極與管道16中的流體接觸。參考圖13，管道34是
25在組裝的套筒中連接樣品進入口 4與第一管道34的樣品保持室。切去部分35和37任選 地容納用于測定空氣_液體邊界位置的電導傳感器。凹處42容納含流體的包裝，如可破裂 的袋，該包裝在組裝的套筒中由于插入讀數(shù)裝置中時施加在槳7上的壓力而被釘38刺穿。 來自被刺穿的包裝的流體在39處流入第二管道，然后流入管道16。氣囊由凹處43構成，凹 處43在其上表面被墊圈21密封。氣囊是泵器件的一個實施方式，其通過施加于槳6上的 壓力開動，槳6排放管道40中的空氣，從而將樣品從樣品室34移入管道16。在優(yōu)選的實施方式中，BUN傳感器被包裝到美國專利第5，096，669號中所公開的 類型的套筒中，該套筒還含有校準溶液。校準溶液被包含在校準包裝(cal-包)中，該校準 包裝在血樣分析期間破裂。典型的事件順序包括cal-包破裂，然后校準溶液流到傳感器 上并潤濕傳感器。通常，現(xiàn)有技術套筒的cal-包含有下列離子鈉離子、鉀離子、鈣離子、氯 離子和碳酸氫根離子并且還含有HEPES緩沖劑、葡萄糖、乳酸根、尿素、肌酸和肌酸酐。作為 用于研究目的的診斷測試，用氨來代替尿素。這容許研究銨離子載體的性能而不依賴于含 脲酶的酶固定層。新的BUN傳感器的cal-包的優(yōu)選組成優(yōu)選地包括鈉、鉀、鈣、氯、尿素、 HEPES緩沖劑、葡萄糖、乳酸根、肌酸和肌酸酐。用于尿素的電位測定化學傳感器可以被看成是由功能上不同的部件構建的系統(tǒng)。 在血液尿素氮(BUN)傳感器的一個實施方式中，與分析物溶液接觸的最外層容許尿素運 輸，同時還用于固定活性酶分子。如上所述，這些酶催化尿素水解為氨。在中性PH值下，由 此產(chǎn)生的氨主要以銨離子存在。通過插入在含酶層和銀-氯化銀指示電極之間含有對銨 離子具有高敏感性和選擇性的離子載體的單獨分層結構，可以測量電極界面處的銨離子濃 度。在這種類型的測量中，記錄指示電極與參比電極之間的電位差。如電化學測量領域內(nèi) 所熟知的，這是用在連接兩個電極的儀器(分析儀)中的電位測定電路進行的。測量的分 析值是源自如下的事實電位差的量值通過Mcolsky方程與分析物的濃度相關，在這種情 況下分析物為尿素E = E。+RT/nF log [Α+ Σ (a, b)k(a, b)B]其中E是測量的電動勢(信號)，R是氣體定律常數(shù)，T是絕對溫度，η是分析物種 類a上的電荷的絕對值(例如，對于銨離子，n= 1)，F(xiàn)是法拉第常數(shù)，A是分析物種類a的活 性，B是干擾化學物種類b的活性，k (a, b)是與化學物種類b的存在對分析物種類a的活性 的電化學電位測定的影響相關的干擾系數(shù)，并且E。是獨立于T、A或B的常數(shù)。參見Amman， D. ,Ion-Selective Microelectrodes (離子選擇性微電極)，Springer，Berlin (1986)第 68 頁以及其中所引用的參考文獻，通過引用將其并入本文。圖4、5和15-18中所示出的數(shù)據(jù)是使用這些原理記錄和/或分析的。這些數(shù)據(jù)使 用商業(yè)的BUN測試系統(tǒng)來呈現(xiàn)以供比較。新傳感器的性能優(yōu)于已確立的技術。
實施例實施例1通過將0. Olg的抑肽酶溶解于50mL去離子水來制備抑肽酶溶液，產(chǎn)生0. 02%濃度 的儲備溶液。通過添加下列物質來制備酶緩沖溶液4. 32g的甘油、130g的去離子水、130g WpH 7. 6 的 IM TRIS、2. 6g 的 pH 8. O 的 0. 5M EDTA、13g 上述 0. 02% 的抑肽酶儲備溶液、 0. 2g ^ 1,4- 二硫赤蘚糖醇、2. 7g的氯化鈉、0. 097g的氯化鉀、0. 05g的疊氮化鈉、92. 8g的
26蔗糖和29g的BSA。漩渦混合物直至完全溶解。然后制備含有丙烯酸樹脂組分的溶液，該 溶液包含72. 2g的丙烯酰胺、150g的去離子水、29. 4g的1，4_雙(丙烯酰)哌嗪和2. 5g的 活性炭?；旌线@種丙烯酸樹脂溶液直至在溶解狀態(tài)中并使用0. 2 μ m濾器過濾到干凈的容 器中。向此溶液中添加17. Sg的1-[4-(2_羥基乙氧基)-苯基]-2-羥基-2-甲基-1-丙 烷-1-酮，混合并將溶液保持在用鋁箔包裹的容器中來防止過度暴露于光。最后，將40g的 脲酶添加至約333g的上述經(jīng)過濾的溶液中并混合。添加約44g的去離子水，最后添加184g 的丙烯酸樹脂溶液(如上所制備的)。保持材料以鋁箔覆蓋并且混合直至在溶解狀態(tài)中。 對于長期儲存，將此溶液等分成Iml的部分并在-60°C下冷凍。實施例2在脲酶的另一實施方式中，酶固定層包含酶碳酸酐酶?；旌洗涡蛉缦峦ㄟ^將 0. Olg的抑肽酶溶解于50mL的去離子水來制備抑肽酶溶液，產(chǎn)生0. 02%濃度的儲備溶液。 通過添加下列物質來制備酶緩沖溶液4. 32g的甘油、130g的去離子水、130g的pH 7. 6的 IM Tris,2. 6g的pH 8. 0的0. 5MEDTA、13g的上述0. 02 %的抑肽酶儲備溶液、0. 2g的1， 4- 二硫赤蘚糖醇、2. 7g的氯化鈉、0. 097g的氯化鉀、0. 05g的疊氮化鈉、92. 8g的蔗糖、29g 的BSA，并將其漩渦直至內(nèi)含物完全溶解。然后制備含有丙烯酸樹脂組分的溶液，該溶液包 含72. 2g的丙烯酰胺、150g的去離子水、29. 4g的1，4-雙(丙烯酰)哌嗪和2. 5g的活性炭。 混合這種丙烯酸樹脂溶液直至在溶解狀態(tài)中并使用0. 2μπι濾器過濾到干凈的容器中。向 此溶液中添加17. Sg的1- [4- (2-羥基乙氧基)_苯基]-2-羥基-2-甲基-1-丙烷-1-酮， 混合并使用鋁箔來防止溶液過度暴露于光。最后，將40g的脲酶和14mg的碳酸酐酶添加至 約333g的上述過濾的酶溶液中并混合。添加約44g的去離子水，并且最后添加184g的以 上所制備的丙烯酸樹脂溶液。保持材料以鋁箔覆蓋并且混合直至在溶解狀態(tài)中。將此溶液 等分成Iml的部分并在_60°C下冷凍。關于任何公開的實施方案所述或要求的任何特征可以在任何組合中與關于任何 其他公開的一個或多個實施方案所述或要求的任何一個或多個其他特征相組合，其程度為 這些特征不必在技術上不相容，并且所有這些組合均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，下面所附的 權利要求列出了在本發(fā)明范圍之內(nèi)的特征的一些非限制性組合，但是在任何可能的組合中 任何兩個或多個權利要求的主題的所有可能的組合也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要該組合 不必在技術上不相容即可。
2權利要求
一種形成傳感器的方法，所述方法包括以下步驟(a)形成包含下列物質的基本上均勻的含水混合物在含水混合物中的一種或多種酶、丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑；(b)施加足以覆蓋基部傳感器的受控體積的所述混合物到所述基部傳感器上；并且(c)將所述施加的體積暴露于足夠的UV輻射以形成粘附在所述基部傳感器上的固定化酶層。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述酶選自脲酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、肌酸 酶、肌酸酐酶、肌氨酸氧化酶、觸媒、碳酸酐酶、NAD (P)H氧化酶、膽固醇氧化酶、醇氧化酶、膽 堿氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、硫胺素氧化酶、丙酮酸氧化酶、吡哆醛氧化酶、D-氨基酸氧 化酶、L-氨基酸氧化酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶以及它們的組合。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述單體選自丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-[3-(二 甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯以及它們的組合。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述有機光引發(fā)劑選自2-羥基-l-[4-(2-羥基乙氧 基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、(權利要求8的插入方法)以及它們的組合。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述交聯(lián)劑選自1，4_雙丙烯酰哌嗪、N，N’-(l， 2-二羥亞乙基)雙-丙烯酰胺、N，N’ -雙(丙烯酰)胱胺、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、乙二 醇二丙烯酸酯、(+)_N，N’ - 二烯丙基酒石酰胺以及它們的組合。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述含水混合物還包含選自由以下組成的組的一種 或多種穩(wěn)定組分PH緩沖劑、二硫鍵還原劑、二價離子螯合劑、蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋 白、鹽、殺生物劑和濕潤劑。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述基部傳感器選自由以下組成的組電極、離子選 擇性電極、電位測定電極、電流型電極、電導電極、酶電極、生物傳感器、光學傳感器、光纖傳 感器、聲表面波傳感器、消逝傳感器、表面等離子體共振傳感器和光波導傳感器。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述酶為脲酶并且所述基部傳感器為銨離子選擇性膜。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述施加混合物的方法是通過微分散在約5nL至約 1 μ L的范圍內(nèi)的受控體積來進行。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述施加混合物的方法是通過選自由以下組成的 組的手段來進行旋涂、浸涂、噴涂、絲網(wǎng)印刷、噴墨印刷、激光印刷、涂抹和接觸印刷。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述含水混合物包含脲酶、2-羥基-1-[4-(2-羥基 乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、雙丙烯酰哌嗪、甘油和丙烯酰胺單體。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述UV輻射是在約185nm至400nm的波長范圍內(nèi)。
13.如權利要求1所述的方法，其中所述UV輻射強度是在約lOOmW/cm2至400mW/cm2的 范圍內(nèi)。
14.如權利要求1所述的方法，其中所述UV輻射步驟是在分散循環(huán)中的分散步驟之后 立即進行的點固化。
15.如權利要求1所述的方法，其中所述UV輻射步驟是在所述分散步驟之后預選的時 間延遲后進行的點固化。
16.如權利要求1所述的方法，其中所述UV輻射步驟是進行了約0.1秒至10秒的持續(xù)2時間的點固化。
17.一種形成尿素傳感器的方法，所述方法包括以下步驟(a)形成包含以下物質的基本上均勻的含水混合物脲酶、甘油、2-羥基-l-[4-(2-羥 基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、雙丙烯酰哌嗪和丙烯酰胺單體；(b)將足以覆蓋銨離子選擇性膜的受控體積的所述混合物分散到所述膜上；以及(c)將所述分散的體積暴露于足夠的UV輻射以形成粘附在所述膜上的固定化脲酶層。
18.一種用于在基本上平坦的表面上形成固定化酶層的裝置，所述裝置包括用于在 所述表面上的預選位置分散受控體積的光可形成的含酶基質的分散頭和具有套準和對齊 器件的UV輻射源，所述套準和對齊器件能夠在所述基質被分散后，在預定的時間以預定的 強度將輻射束聚焦在基本上覆蓋所述預選位置的區(qū)域上一段預定的持續(xù)時間。
19.如權利要求18所述的裝置，其中所述基本上平坦的表面選自由以下組成的組硅 晶片、氧化鋁晶片、液晶基底、玻璃基底和塑料基底以及柔性塑料基底。
20.如權利要求18所述的裝置，其中所述分散頭包括具有用于所述基質的儲器的注 射器針和用于控制從所述注射器到所述表面上的分散體積的排放器件。
21.如權利要求18所述的裝置，其中所述光可形成的基質為包含下列物質的組合物 在基本上均勻的含水混合物中的一種或多種酶、濕潤劑、丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā) 劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑。
22.如權利要求18所述的裝置，其中所述受控體積是在約5nL至約1μ L的范圍內(nèi)。
23.如權利要求18所述的裝置，其中所述預選的位置具有約10平方微米至約75平方 毫米的范圍內(nèi)的面積。
24.如權利要求18所述的裝置，其中所述預選的位置為基本上圓形的，該圓形具有約 5μπι至約5mm范圍內(nèi)的半徑尺寸。
25.如權利要求18所述的裝置，其中所述UV輻射源為汞燈。
26.如權利要求18所述的裝置，其中套準和對齊器件容許光束被聚焦在所述表面的所 選區(qū)域并照射約10平方微米至約75平方毫米范圍內(nèi)的區(qū)域。
27.如權利要求18所述的裝置，所述裝置還包括用于控制分散的時間控制和位置的電 腦程序。
28.如權利要求18所述的裝置，所述裝置包括用于控制相對于分散的時間控制的UV輻 射的施加的時間控制和位置。
29.如權利要求18所述的裝置，所述裝置還包括用于改變所述表面相對于所述分散頭 和所述UV輻射源的相對位置的步進重復器件以用于在一組預選的位置形成固定化酶層陣 列。
30.如權利要求18所述的裝置，用于在所述基本上平坦的表面上形成固定化層的陣 列，其中所述分散頭能夠在所述表面上一組預選的位置分散一系列受控體積的光可形成的 基質，并且所述UV輻射源能夠在各受控的體積被分散后，在預定的時間將輻射束按順序聚 焦到基本上覆蓋各所述預選位置的區(qū)域上一段預定的持續(xù)時間。
31.一種用于在基本上平坦的表面上的傳感器陣列上形成固定化酶層陣列的裝置，所 述裝置包括用于在所述表面上的一組預選的位置分散一系列受控體積的光可形成的含酶 基質的分散頭以及具有套準和對齊器件的UV輻射源，所述套準和對齊器件能夠在各受控的體積被分散后，在預定的時間將輻射束按順序聚焦到基本上覆蓋各所述預選位置的區(qū)域 上一段預定的持續(xù)時間。
32.一種在基本上平坦的表面上的傳感器上形成固定化層的方法，所述方法包括以下 步驟(a)在所述表面上的預選位置分散受控體積的光可形成的基質，其中所述光可形成的 基質包含生物活性材料；以及(b)在所述體積被分散后預定的時間開始，將UV輻射束施加到基本上覆蓋所述預選位 置的區(qū)域上，并且所述施加以預定的強度進行一段預定的持續(xù)時間以形成所述固定化層。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述光可形成的基質包含在含水混合物中的一 種或多種酶、丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑。
34.如權利要求32所述的方法，其中所述生物活性材料選自由以下組成的組蛋白質、 酶、抗體、抗體片段、RNA、單鏈DNA和雙鏈DNA。
35.如權利要求32所述的方法，其中所述固定化層為酶層。
36.一種在基本上平坦的表面上的傳感器陣列上形成固定化層的陣列的方法，所述方 法包括以下步驟(a)在所述表面上的一組預選的位置分散一系列受控體積的光可形成的基質；以及(b)在各受控的體積被分散后預定的時間開始，將UV輻射束按順序施加到基本上覆蓋 各所述預選位置的區(qū)域上，并且以預定的強度施加所述輻射一段預定的持續(xù)時間以形成所 述固定化層陣列。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述預定的時間在約0.1秒至約10秒的范圍內(nèi)。
38.如權利要求36所述的方法，其中所述預定的持續(xù)時間在約0.1秒至約10秒的范圍內(nèi)。
39.如權利要求36所述的方法，其中所述UV輻射是在約185nm至400nm的波長范圍內(nèi)。
40.如權利要求36所述的方法，其中所述UV輻射強度是在約lOOmW/cm2至400mW/cm2 的范圍內(nèi)。
41.如權利要求36所述的方法，其中所述平坦的表面為硅晶片并且所述預選的位置組 是在所述晶片上的傳感器陣列。
42.如權利要求36所述的方法，其中所述UV輻射束被施加至Nth減X預選位置，而分 散發(fā)生在Nth預選位置，其中X等于1至10的整數(shù)。
43.一種傳感器，所述傳感器包含電極，并且具有覆蓋所述電極的包括離子選擇性膜的 第一層和覆蓋所述離子選擇性膜的包含UV固化基質的第二層，所述UV固化基質由下列物 質的基本上均勻的含水混合物形成一種或多種酶、濕潤劑、丙烯酸基單體、水溶性有機光 弓I發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶固定組合物，所述酶固定組合物包含在基本上均勻的含水混合物中的一種或多種酶、濕潤劑、丙烯酸基單體、水溶性有機光引發(fā)劑和水溶性丙烯酸基交聯(lián)劑。本發(fā)明還涉及用于形成包含這類組合物的傳感器的方法并且涉及用于通過將這類組合物分散到基底上而在傳感器陣列上形成固定化層陣列的裝置。
文檔編號B05C11/00GK101971012SQ200880126799
公開日2011年2月9日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權日2007年12月20日
發(fā)明者A·C·內(nèi)梅特, A·王, G·B·科利爾, J·A·麥克勞德 申請人:雅培醫(yī)護站股份有限公司