一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標(biāo)記物的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標(biāo)記物的制備方法及應(yīng)用，涉及納米科學(xué)、生物免疫技術(shù)、電化學(xué)傳感等領(lǐng)域。本發(fā)明利用金納米顆粒和多孔石墨相氮化碳納米片優(yōu)異的催化性能，制備了金納米顆粒負(fù)載的多孔石墨相氮化碳納米片，通過氨基封端的聚乙二醇進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)了發(fā)光試劑魯米諾和生物分子的固定。納米復(fù)合物對共反應(yīng)試劑良好的催化性能極大提升了發(fā)光試劑的發(fā)光效率。多臂聚乙二醇不但提高了發(fā)光試劑和生物分子的固定量，其抗蛋白性質(zhì)降低了非特異性分子的吸附，提高了靈敏度。該標(biāo)記物可以適用于多種電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備，在科研和臨床中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標(biāo)記物的制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及納米科學(xué)、生物免疫技術(shù)、電化學(xué)傳感等領(lǐng)域，具體涉及一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標(biāo)記物的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]物標(biāo)志物檢測是目前唯一無創(chuàng)的早期預(yù)警癌癥等疾病的方法，在臨床中對腫瘤的普查、診斷及判斷預(yù)后等具有十分重要的意義。在眾多的生物標(biāo)志物檢測方法中，電化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前最先進(jìn)的免疫測定技術(shù)，具有操作簡便、樣品量少、快速靈敏、成本低廉且易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，在臨床和科研中得到了廣泛應(yīng)用。
[0003]電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器通常通過對抗原或抗體等生物分子進(jìn)行標(biāo)記來檢測信號，但通常標(biāo)記過程復(fù)雜，操作費(fèi)時，并且信號較低。因此基于具有良好催化性能的納米材料構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光傳感器標(biāo)記物引起了人們極大的研究興趣。電化學(xué)發(fā)光傳感器具有步驟簡單、方便快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
[0004]具有穩(wěn)定發(fā)光性能和良好生物相容性的標(biāo)記物制備是構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器的關(guān)鍵。石墨相氮化碳納米片是一種具有良好催化性能的二維納米材料，近來被用于構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器，與傳統(tǒng)半導(dǎo)體發(fā)光納米材料相比，具有合成簡單，成本低廉，生物相容性好等特點(diǎn)。但依然存在石墨相氮化碳納米片修飾困難、缺乏簡單而有效的標(biāo)記方法等問題。傳統(tǒng)的發(fā)光試劑在生物分子上的固定通常需要復(fù)雜的共價修飾過程，較低的固載量使發(fā)光性能大大降低，同時生物分子識別單元在納米載體上的固定也需要復(fù)雜的修飾過程。
[0005]本發(fā)明利用金納米顆粒和多孔石墨相氮化碳納米片優(yōu)異的催化性能，制備了金納米顆粒負(fù)載的多孔石墨相氮化碳納米片，通過氨基封端的聚乙二醇進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)了發(fā)光試劑魯米諾和生物分子的固定。納米復(fù)合物對共反應(yīng)試劑良好的催化性能極大提升了發(fā)光試劑的發(fā)光效率。多臂聚乙二醇不但提高了發(fā)光試劑和生物分子的固定量，其抗蛋白性質(zhì)降低了非特異性分子的吸附，提高了靈敏度。本發(fā)明的目的之一是提供簡單通用的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用生物標(biāo)記物的制備方法，解決傳統(tǒng)標(biāo)記物標(biāo)記困難、信號差等問題。
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供快速、低成本、通用的生物傳感檢測方法，為電化學(xué)發(fā)光生物傳感器在實(shí)際中的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。
[0007]—種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標(biāo)記物的制備方法及應(yīng)用，包括以下步驟:
(1)多孔石墨相氮化碳納米片的制備:用三聚氰胺和硫脲作為前驅(qū)體通過550°C高溫縮聚反應(yīng)制備多孔石墨相氮化碳，然后將100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超純水中超聲剝離10?24小時，5000轉(zhuǎn)離心去掉未剝離的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳納米片的水溶液；
(2)金納米顆粒的制備:用梓檬酸鈉還原法制備粒徑為10-14nm的金納米顆粒；
(3)將2mL金納米顆粒水溶液加入到5 1^濃度為0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳納米片水溶液中，振蕩12小時，10000轉(zhuǎn)離心得到金納米顆粒與多孔石墨相氮化碳納米片的納米復(fù)合物； (4)在21^濃度為0.5 mg.mL—1的納米復(fù)合物水溶液中加入50 口1^濃度為0.5 mg.mL—1的氨基封端的4臂或8臂聚乙二醇水溶液，振蕩2小時后離心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物；
(5)在聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物水溶液中加入5UL濃度為I mmol.mL—1的魯米諾水溶液，用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，離心；
(6)將上述離心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg.mL—1的二抗溶液，在4攝氏度下孵化2 h，離心，重新分散于2mL、0.1 mo I.L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，即制得一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器二抗標(biāo)記物溶液。
[0008]本發(fā)明的有益成果
(I)該標(biāo)記物制備方法利用石墨相氮化碳納米片的多孔結(jié)構(gòu)很好地實(shí)現(xiàn)了金納米顆粒的負(fù)載，從而便于進(jìn)行氨基封端聚乙二醇的修飾。
[0009](2)該方法制備的標(biāo)記物結(jié)合了石墨相氮化碳納米片和金納米顆粒對雙氧水的雙重催化作用，使魯米諾的電化學(xué)發(fā)光效率大大提升。
[0010](3)該方法制備的標(biāo)記物由于聚乙二醇的抗蛋白作用，避免了生物分子在標(biāo)記物上的非特異性吸附，標(biāo)記后可以直接進(jìn)行傳感器的構(gòu)建。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0012]實(shí)施例1
前列腺特異性抗原二抗標(biāo)記物的制備
(1)多孔石墨相氮化碳納米片的制備:用三聚氰胺和硫脲作為前驅(qū)體通過550°C高溫縮聚反應(yīng)制備多孔石墨相氮化碳，然后將100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超純水中超聲剝離24小時，5000轉(zhuǎn)離心去掉未剝離的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳納米片的水溶液；
(2)金納米顆粒的制備:用梓檬酸鈉還原法制備粒徑為10-14nm的金納米顆粒；
(3)將2mL金納米顆粒水溶液加入到5 1^濃度為0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳納米片水溶液中，振蕩12小時，10000轉(zhuǎn)離心得到金納米顆粒與多孔石墨相氮化碳納米片的納米復(fù)合物；
(4)在21^濃度為0.5 mg.mL—1的納米復(fù)合物水溶液中加入50 口1^濃度為0.5 mg.mL—1的氨基封端的分子量為10 kDa的8臂聚乙二醇水溶液，振蕩2小時后離心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物；
(5)在聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物水溶液中加入5UL濃度為I mmol.mL—1的魯米諾水溶液，用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，離心；
(6)將上述離心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg ^mL-1的前列腺特異性抗原二抗溶液，在4攝氏度下孵化2 h，離心，重新分散于2 mL、0.1 mo I.L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，即制得前列腺特異性抗原二抗標(biāo)記物溶液。
[0013]實(shí)施例2
前列腺特異性抗原電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的構(gòu)建
(1)用移液槍將5UL濃度為1.0 mg.mL.1的氨基化石墨烯溶液滴涂在處理、活化好直徑為4 mm的玻碳電極表面，室溫瞭干；
(2)用移液槍將5UL前列腺特異性抗原捕獲抗體溶液(10 Hg mL—1)滴涂在步驟(I)制得的電極表面，4°C條件下晾干。
[0014](3)非特異性位點(diǎn)封閉:用超純水多次沖洗步驟(2)制得的電極，用移液槍將6 pL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白溶液滴涂在步驟(2)制得的電極表面，4°C條件下晾干，超純水沖洗。
[0015](4)用移液槍滴涂5 UL前列腺特異性抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液或未知樣品溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗。
[0016](5)將4 yL前列腺特異性抗原二抗標(biāo)記物溶液滴至電極表面，置于40C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干。
[0017](6)以步驟(5)制得的電極為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，Pt電極為對電極，用pH為7.4的PBS緩沖溶液配制的20 mmol.mL—1的H2O2溶液作為底液，在電化學(xué)發(fā)光工作站上以循環(huán)伏安模式測定0.2?0.8 V電勢下的發(fā)光信號，制得一種前列腺特異性抗原的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標(biāo)記物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)多孔石墨相氮化碳納米片的制備:用三聚氰胺和硫脲作為前驅(qū)體通過550°C高溫縮聚反應(yīng)制備多孔石墨相氮化碳，然后將100 mg多孔石墨相氮化碳在100 mL超純水中超聲剝離10?24小時，5000轉(zhuǎn)離心去掉未剝離的多孔石墨相氮化碳，制得多孔石墨相氮化碳納米片的水溶液； (2)金納米顆粒的制備:用梓檬酸鈉還原法制備粒徑為10-14nm的金納米顆粒； (3)將2mL金納米顆粒水溶液加入到5 1^濃度為0.5 mg.mL—1的多孔石墨相氮化碳納米片水溶液中，振蕩12小時，10000轉(zhuǎn)離心得到金納米顆粒與多孔石墨相氮化碳納米片的納米復(fù)合物； (4)在21^濃度為0.5 mg.mL—1的納米復(fù)合物水溶液中加入50 口1^濃度為0.5 mg.mL—1的聚乙二醇水溶液，振蕩2小時后離心，重新分散到2 mL水中得到聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物； (5)在聚乙二醇包覆的納米復(fù)合物水溶液中加入5UL濃度為I mmol.mL—1的魯米諾水溶液，用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，離心； (6)將上述離心所得沉淀重新分散于2mL、0.1 mol.Γ\ρΗ 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入0.1 mL、10 yg.mL—1的二抗溶液，在4攝氏度下孵化2 h，離心，重新分散于2 mL、0.1 mo I *L—\pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，即制得一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器二抗標(biāo)記物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標(biāo)記物的制備方法，其特征在于，所述的聚乙二醇為氨基封端的4臂或8臂聚乙二醇，分子量為10?40 kDa。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器標(biāo)記物的制備方法，其特征在于，所述制備的標(biāo)記物用于構(gòu)建一抗/抗原/ 二抗標(biāo)記物的雙抗體夾心型生物傳感器，通過所制備的二抗標(biāo)記物的電致化學(xué)發(fā)光信號實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測。
【文檔編號】G01N21/76GK106066324SQ201610369739
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年5月30日 公開號201610369739.9, CN 106066324 A, CN 106066324A, CN 201610369739, CN-A-106066324, CN106066324 A, CN106066324A, CN201610369739, CN201610369739.9
【發(fā)明人】馬洪敏, 魏琴, 吳丹, 張勇, 龐雪輝, 胡麗華, 杜斌, 范大偉
【申請人】濟(jì)南大學(xué)