具有提高的轉(zhuǎn)化活性的l?阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體及利用該變異體生產(chǎn)d?塔格糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于蛋白質(zhì)分子建模法的來源于嗜熱菌的一種新阿波羅棲熱袍菌DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068)的L?阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體(L?arabinose isomerase variant)的開發(fā)。并且，涉及一種利用所述酶或表達所述酶的棒狀微生物由D?半乳糖生產(chǎn)D?塔格糖的方法。KCCM11378P20130214KCCM11379P20130214KCCM11380P20130214
【專利說明】
具有提高的轉(zhuǎn)化活性的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體及利用該變 異體生產(chǎn)D-塔格糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)及一種來源于新阿波羅棲熱袍菌DSM 5068(The;rmotoga neapolitana DSM 5068)的心阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體、表達該變異體的微生物、W及利用運些由D-半乳糖 生產(chǎn)D-塔格糖的方法，所述^阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體是利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)（protein engineering)來生產(chǎn)的，從而對D-半乳糖具有提高的轉(zhuǎn)化活性。
【背景技術(shù)】
[0002] D-塔格糖是既具有低熱量、無離齒性等特征，又具有相當(dāng)于白糖的約90%的甜度 的單糖，其可W用作健康甜味劑而不會引起由現(xiàn)有的甜味劑誘發(fā)的各種成人疾病問題。
[0003] 由于運些特性，D-塔格糖作為替代白糖的甜味劑而受到關(guān)注，并且被認(rèn)為是在食 品市場中擁有巨大市場潛力的物質(zhì)。但是，塔格糖并不大量存在于自然界中，而是僅W微量 存在于乳制品或一些植物中的稀有糖，因此為了用作低熱量的功能性甜味劑，需開發(fā)能夠 大量生產(chǎn)的技術(shù)。
[0004] D-塔格糖是愛氏晨犧(Aria化ods)公司于2003年利用W化(0H)2作為催化劑的化 學(xué)異構(gòu)法由D-半乳糖(D-galactose)生產(chǎn)的，并WGaio-塔格糖(Gaio-tagatose)的產(chǎn)品名 市售。但是，已知化學(xué)異構(gòu)法雖然在異構(gòu)化轉(zhuǎn)化產(chǎn)量方面優(yōu)異，但是難于回收及精制，工序 復(fù)雜，因此考慮到工序整體產(chǎn)量的情況下，收率反而比利用酶的異構(gòu)法低。
[0005] 心阿拉伯糖異構(gòu)酶化-arabinose isomerase;EC 5.3.1.5)是促進由心阿拉伯糖 轉(zhuǎn)化為k核酬糖的異構(gòu)化反應(yīng)的酶。并且，已知為，k阿拉伯糖異構(gòu)酶不僅使原始底物心阿 拉伯糖進行異構(gòu)化，而且使與k阿拉伯糖結(jié)構(gòu)相似的底物D-半乳糖進行異構(gòu)化而轉(zhuǎn)化為D- 塔格糖(D-tagatose)。
[0006] 在利用k阿拉伯糖異構(gòu)酶由D-半乳糖生產(chǎn)D-塔格糖的工序中，能夠?qū)μ岣呱a(chǎn)性 作出貢獻的最重要的因素是通過異構(gòu)酶的改良而開發(fā)出反應(yīng)性好且能成功適用于生產(chǎn)工 序中的酶。生產(chǎn)性的提高對基于降低成本的利潤最大化和產(chǎn)業(yè)的成敗起到?jīng)Q定性作用，因 此對阿拉伯糖異構(gòu)酶進行持續(xù)性改良的必要性呈上升趨勢。
[0007] 來源于作為高溫性微生物的新阿波羅棲熱袍菌DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068)屬的阿拉伯糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性非常優(yōu)異，但為了確保葡萄糖異 構(gòu)酶(glucose isomerase)水平的經(jīng)濟生產(chǎn)性，需要進行進一步的改良。
[000引一般而言，為了提高酶的活性或?qū)π碌牡孜镔x予活性而制備變異型酶的方法大體 上可分為隨機變異法（random mu1:agenesis)和合理設(shè)計法（rational desi即）。隨機變異 法因可在不用了解關(guān)于作為對象的酶的特別信息的情況下也可適用而被廣泛利用，但需要 具備能夠調(diào)查大量個體變異型酶的篩選(screening)系統(tǒng)。另一方面，基于合理設(shè)計的酶的 改良由于只生成有限數(shù)量的變異型酶，因此不需要?？诘暮Y選系統(tǒng)，但需要對對象酶的催 化作用機理(catalytic mechanism)、底物的結(jié)合特性或底物特異性的決定因素等進行詳 細(xì)地研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 要解決的技術(shù)問題
[0010] 為此，本
【申請人】為了使對生產(chǎn)塔格糖具有潛力的阿拉伯糖異構(gòu)酶能夠具有產(chǎn)業(yè)生 產(chǎn)性，W蛋白質(zhì)工程的分子模擬技術(shù)和酶反應(yīng)機理的分析為基礎(chǔ)，對來源于新阿波羅棲熱 袍菌DSM 5068(The;rmotoga neapolitana DSM 5068)的心阿拉伯糖異構(gòu)酶化-arabinose isomerase)的蛋白質(zhì)S維結(jié)構(gòu)進行變化，從而提高k阿拉伯糖異構(gòu)酶對D-半乳糖的底物特 異性。
[0011] 本發(fā)明的目的在于，提供一種具有提高的轉(zhuǎn)化活性的、來源于新阿波羅棲熱袍菌 DSM 5068(Thermotoga neapoli化na DSM 5068)的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體及編碼該變異體 的基因堿基序列。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種包含所述基因堿基序列的重組載體及用所述 重組載體轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌屬微生物。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于，提供一種由D-半乳糖制備D-塔格糖的方法，所述方法利 用所述阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體或所述轉(zhuǎn)化的微生物或所述轉(zhuǎn)化的微生物的培養(yǎng)物進行。 [0014]技術(shù)方案
[00巧]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種使D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的活性得至順高 的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體及編碼該變異體的基因堿基序列，其中阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體是 來源于新阿波羅棲熱袍菌DSM 5068(The;rmotoga neapolitana DSM 5068)的阿拉伯糖異構(gòu) 酶的第469位亮氨酸（leucine)被脯氨酸（proline)取代、第275位氨基酸被除苯丙氨酸 (地enylalanine) W外的氨基酸取代。
[0016] 本發(fā)明還提供一種包含所述基因堿基序列的重組載體及用所述重組載體轉(zhuǎn)化的 棒狀桿菌屬微生物。
[0017] 本發(fā)明還提供一種由D-半乳糖制備D-塔格糖的方法，其利用所述阿拉伯糖異構(gòu)酶 變異體或所述轉(zhuǎn)化的微生物或所述轉(zhuǎn)化的微生物的培養(yǎng)物。
[0018] 發(fā)明效果
[0019] 利用由本發(fā)明的新型阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體或編碼該變異體的基因堿基序列轉(zhuǎn) 化的棒狀桿菌屬菌株，提高了 D-塔格糖的生產(chǎn)性，從而有效地降低了成本及減少了基礎(chǔ)設(shè) 施的投資費用。
【附圖說明】
[0020] 圖1示出來源于新阿波羅棲熱袍菌的k阿拉伯糖異構(gòu)酶的活性位點及作為輔助因 子的儘離子所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)的圖。
[0021] 圖2示出k阿拉伯糖和D-半乳糖結(jié)合到心阿拉伯糖異構(gòu)酶的活性位點，W及起到 相互作用的功能基團的圖。顯示出D-半乳糖的第6位碳和第275位苯丙氨酸的殘基相互引起 空間位阻。
[0022] 圖3示出通過對^阿拉伯糖異構(gòu)酶的第275位殘基進行飽和誘變（saturated mu化genesis)并利用半脫氨酸-巧挫法通過顯色反應(yīng)對選擇的變異體的相對活性進行比較 所獲得的結(jié)果。與對照組相比，可W確認(rèn)相當(dāng)數(shù)量的變異體顯示了更高的活性。
[0023] 圖4是利用分子模擬技術(shù)預(yù)測的篩選出的變異體F275V/L469P、F275M/L469P、 F275I/L469P的結(jié)構(gòu)圖。
[0024] 圖5示出通過SDS-PAGE對分離精制的新阿波羅棲熱袍菌的k阿拉伯糖異構(gòu)酶變異 體進行分析的圖。
[0025] 圖6是為了確認(rèn)篩選出的變異體的最適溫度而對其在各溫度下的相對活性進行評 價的圖。
[0026] 圖7是在95°C下根據(jù)時間對篩選出的變異體的熱穩(wěn)定性進行測定的圖。
[0027] 圖8是為了確認(rèn)篩選出的變異體的儘依賴性而對其在在多種濃度對相對活性進行 評價的圖。
【具體實施方式】
[0028] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種具有提高的轉(zhuǎn)化活性的、來源于新阿波羅棲 熱袍菌DSM 5068(The;rmotoga neapoli1:ana DSM 5068)的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體及編碼該 變異體的基因堿基序列。
[0029] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種使D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的活性 得到提高的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體及編碼該變異體的基因堿基序列，其中阿拉伯糖異構(gòu)酶 變異體是來源于新阿波羅棲熱袍菌DSM 5068(The;rmotoga neapoli1:ana DSM 5068)的阿拉 伯糖異構(gòu)酶的第275位氨基酸被除苯丙氨酸(phenylalanine) W外的氨基酸取代、第469位 亮氨酸（leucine)被脯氨酸(pro line)取代。
[0030] 本發(fā)明中，所述"將D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的阿拉伯糖異構(gòu)酶"表示W(wǎng)D-半乳糖 為底物催化異構(gòu)化反應(yīng)而生產(chǎn)D-塔格糖的酶。
[0031] 優(yōu)選地，本發(fā)明的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體是阿拉伯糖異構(gòu)酶的第275位氨基酸被 具有非極性脂肪族側(cè)鏈(no噸olar aliphatic side chain)的氨基酸取代。
[0032] 本文中，所述"具有非極性脂肪族側(cè)鏈的氨基酸"表示丙氨酸(Alanine)、鄉(xiāng)氨酸 (￥曰1；[]1日）、異亮氨酸（13〇1日11(3；[]1日）、亮氨酸化日11(3；[]1日）、蛋氨酸（1日1：11；[0]1；[]1日）及脯氨酸 (Proline)。
[0033] 優(yōu)選地，所述阿拉伯糖異構(gòu)酶的第275位氨基酸被選自鄉(xiāng)氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸 中的任一種氨基酸取代。
[0034] 優(yōu)選地，本發(fā)明的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體進一步地是異構(gòu)酶的第469位亮氨酸被 脯氨酸取代。
[0035] 本文中，所述"取代"表示特定位置的氨基酸被其他氨基酸替代而引起突變。適當(dāng) 的誘變方法可W是本領(lǐng)域技術(shù)人員為了所述目的而可W利用的所有方法。尤其是飽和誘變 法（saturated mutagenesis method)、隨機誘變法(random mutagenesis method)及定點 誘變'法（site-directed mutagenesis method) (Evolutionary molecular engineering based on RNA replication,Pure Appl.Chem.1984,56:967-978；Promoters selected from random DNA-sequences'Proc.化tl.Acad.Sci.USA,1986,83:7405-7409;Mutants generated by the insertion of random oligonucleotides into the active-site of the beta-lactamase gene,Biochemistry 1989,28:5703-5707)。
[0036] 優(yōu)選地，本發(fā)明的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體中，利用飽和誘變法來取代第275位氨基 酸，利用定點誘變法來取代第469位亮氨酸。
[0037] 在本發(fā)明的一個實施方案中，W所述來源于新阿波羅棲熱袍菌DSM 5068的野生型 阿拉伯糖異構(gòu)酶（SEQ ID N0:1的氨基酸序列及SEQ ID N0:6的堿基序列）為模板 (template),通過隨機酶變異法（甲巧早I豆么田0|酉），得到了一定數(shù)量的顯示改良的 酶特性的變異體及其基因信息。對變異體進行綜合分析的結(jié)果，可W確認(rèn)所述阿拉伯糖異 構(gòu)酶的C-末端(C-terminal)區(qū)域的氨基酸序列的變化影響酶活性的提高。
[0038] 并且，通過分子模擬確認(rèn)了構(gòu)成野生型阿拉伯糖異構(gòu)酶及阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體 的活性位點的C-末端區(qū)域的氨基酸。結(jié)果可W確認(rèn)所述變異體由于野生型阿拉伯糖異構(gòu)酶 的第469位亮氨酸殘基被脯氨酸取代而引起蛋白質(zhì)的第18位0-片層結(jié)構(gòu)(beta-sheet)消失 和主鏈(bac化one)的角度傾斜，同時使第17位a-螺旋(alpha-he 1 i X)的S維結(jié)構(gòu)的位置向 蛋白質(zhì)本體(body)方向移動，運表明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變。
[0039] 基于上述結(jié)果，利用定點誘變（site-directed mutagenesis)法，將野生型阿拉伯 糖異構(gòu)酶的第469位亮氨酸取代為脯氨酸而制備了變異體化469PKSEQ ID NO: 2的氨基酸 序列及SEQ ID N0:7的堿基序列）。將運些變異體培養(yǎng)后對活性進行測定，結(jié)果可W確認(rèn)，與 野生型阿拉伯糖異構(gòu)酶相比，所述變異體對作為底物的半乳糖具有更高的活性。
[0040] 本發(fā)明的一個實施方案中，為了從阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體化469P)得到轉(zhuǎn)化活性 提高的酶，選擇酶的底物結(jié)合部及活性部的主要殘基并推測反應(yīng)機理，從而最終篩選第275 位氨基酸，并利用飽和誘變法進一步向第275位氨基酸引入變異，并進行篩選，從而篩選轉(zhuǎn) 化活性得到提高的變異體。
[0041] 對篩選出的變異體進行測序，結(jié)果可W確認(rèn)選定的變異體的第275位氨基酸分別 被鄉(xiāng)氨酸化469P/F275V)、蛋氨酸化469P/F275M)、異亮氨酸化469P/F2751)取代。將所述巧中 變異體轉(zhuǎn)化到棒狀桿菌屬微生物并對其進行培養(yǎng)后進行異構(gòu)化反應(yīng)。結(jié)果可W確認(rèn)，與第 469位亮氨酸被脯氨酸取代的變異體L469P相比，3種變異體均顯示提高的活性。
[0042] 為了了解所述3種變異體的特性，從在所述條件下培養(yǎng)的棒狀桿菌屬微生物分離 了所表達的阿拉伯糖異構(gòu)酶。發(fā)現(xiàn)精制的蛋白質(zhì)顯示了對D-半乳糖的阿拉伯糖異構(gòu)酶活 性，并用SDS PAGE確認(rèn)了其分子量與阿拉伯糖異構(gòu)酶的一致。
[0043] 利用所述精制變異體酶，對最適溫度、熱穩(wěn)定性、金屬離子利用性及酶活性進行了 測定。結(jié)果所述=種變異體均在75°C下測到了最高的活性，但熱穩(wěn)定性略微降低，金屬離子 利用性則無很大差異，阿拉伯糖異構(gòu)酶活性顯示比所述變異體L469P分別高約5.5倍 (F275V/L469P)、約5倍（F275M/L469P)、約3.9倍（F275I/L469P)的比活度（specific activity)。
[0044] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種編碼所述阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體的基因堿基 序列。
[0045] 所述序列可^為選自沈9 10側(cè):8、569 10側(cè):9及沈9 10顯：10中的任一條基因 堿基序列。
[0046] 就本發(fā)明的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體而言，只要能夠維持或提高本發(fā)明的阿拉伯糖 異構(gòu)酶變異體的阿拉伯糖異構(gòu)酶的活性，就可W具有編碼與SEQ ID N0:3至5的氨基酸序列 具有80% W上、優(yōu)選為90% W上、更優(yōu)選為95% W上、尤其優(yōu)選為97% W上同源性的蛋白質(zhì) 的基因堿基序列，最為優(yōu)選可W具有SEQ ID NO:8至10所示的基因堿基序列。
[0047] 本文中，所述術(shù)語"同源性"表示兩條氨基酸序列之間的同一性，其可W通過用本 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法例如BLAST 2.0來測定，其中BLAST 2.0用于計算分?jǐn)?shù)(score)、 同一性（identity)、相似性（similarity)等參數(shù)(parameter)。
[0048] 并且，本發(fā)明的多核巧酸可W是編碼阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體的變異型，其可在'嚴(yán) 格條件'下與SEQ ID N0:8至10所示的多核巧酸或來源于所述多核巧酸的探針(probe)進行 雜交并發(fā)揮正常功能。
[0049] 本文中，所述術(shù)語"嚴(yán)格條件(stringent conditions)"表示可W實現(xiàn)多核巧酸之 間的特異性雜交的條件。例如，在65°C的雜交緩沖液（3.5〉55(：，0.02%聚薦糖巧1(3〇11)， 0.02%聚乙締化咯燒酬，0.02%牛血清白蛋白，2.5mM Na出P(k(抑7)，0.5%SDS，2mM EDTA) 中進行雜交。（"molecular Cloning(分子克?。?，A Laboratoir Manual, J.Sambrook et 曰1..Editors , 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press , Cold Spring 化rbor,New 化rk, 1989)或Current Protocols in Mole州lar Biology(分子生物學(xué)現(xiàn)代 實驗室指南）（F.M.Ausubel et al.,Editors,John Wiley&Sons,Inc.,New 化rk)。運里， SSC是抑7的0.15M氯化鋼/0.15M巧樣酸鋼。雜交后，將轉(zhuǎn)移有DNA的膜在室溫下用2〉SSC進 行清洗，然后在68°C的溫度下用0.1-0.5〉SSC/0.1 X SDS進行清洗。
[0050] 在一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種異構(gòu)酶變異體，其具有選自SEQ ID NO: 3、 SEQ ID N0:4及SEQ ID N0:5中的任一條氨基酸序列。具體而言，所述變異體表示第275位氨 基酸被選自鄉(xiāng)氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸中的任一條氨基酸取代同時第469位氨基酸被脯氨酸 取代的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體。
[0051] 但是，根據(jù)微生物的種類或菌株，顯示所述多膚活性的酶的氨基酸序列會存在差 異，因此異構(gòu)酶變異體不限定此。即，就本發(fā)明的變異體而言，只要可W維持或提高所述阿 拉伯糖異構(gòu)酶的活性，則可W是編碼具有W下氨基酸序列的多膚的突變體或人工變型體， 所述氨基酸序列包括在SEQ ID N0:3至5的氨基酸序列中除了第275位及第469位氨基酸W 外的一個W上位置上進行1個或多個氨基酸的取代、缺失、插入或添加等。
[0052] 在運里，"多個"會根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基在立體結(jié)構(gòu)上的位置或種類而不同， 但具體為2至20個，優(yōu)選為2至10個，更加優(yōu)選為2至5個氨基酸。
[0053] 并且，運些氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等包括因根據(jù)含有所述阿拉伯 糖異構(gòu)酶活性的微生物的個體或種類的差異的情況等的自然產(chǎn)生的突變或人工變異 (variant)而發(fā)生的。
[0054] 在一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種W可操作的方式連接有多核巧酸的重組載 體。
[0055] 本文中，所述術(shù)語"載體"表示一種DNA制備物，其含有編碼可操作地連接到合適的 調(diào)控序列的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核巧酸的堿基序列，W在合適的宿主內(nèi)表達目標(biāo)蛋白質(zhì)。 所述調(diào)控序列包括:能夠啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子;用于調(diào)控所述轉(zhuǎn)錄的任一操縱基因序列;編碼 合適的mRNA核糖體結(jié)合位點的序列；調(diào)控轉(zhuǎn)錄及翻譯的終止的序列。一旦載體轉(zhuǎn)化至合適 的宿主內(nèi)后，載體即可W與宿主基因組獨立地實施復(fù)制或發(fā)揮功能，或可W整合到基因組 本身。
[0056] 本發(fā)明中使用的載體，只要在宿主中進行復(fù)制，則不受特別限定，可W利用本領(lǐng)域 已知的任意的載體。通常使用的載體可W例舉如天然狀態(tài)或重組狀態(tài)的質(zhì)粒、粘粒、病毒及 隧菌體。
[0057] 本發(fā)明中使用的載體是轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞從而能夠?qū)⒕幋a目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核巧酸 插入到宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體內(nèi)的載體，優(yōu)選地，可W舉例如，能夠在大腸桿菌和棒狀桿菌中 沿兩方向進行自主復(fù)制的穿梭載體祀CCG112載體化or. Jour.Microbiol .July 1991，pl49- 154.Kap-soo，Noh)，但不限定于此。
[0058] 并且，通過細(xì)菌內(nèi)染色體插入用載體，能夠?qū)⒕幋a染色體內(nèi)內(nèi)源性目標(biāo)蛋白質(zhì)的 多核巧酸替換為新型多核巧酸。將所述多核巧酸插入到染色體內(nèi)的方法可W使用本領(lǐng)域已 知的任意方法，例如可W通過同源重組來實現(xiàn)。
[0059] 本發(fā)明的載體可W通過同源重組來插入到染色體內(nèi)，因此可W進一步包含用于確 認(rèn)是否成功插入到所述染色體的篩選標(biāo)記(selection marker)，篩選標(biāo)記的使用是為了篩 選出用載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞即為了確認(rèn)目標(biāo)多核巧酸的插入與否，因此可W使用能夠賦予諸如 耐藥性、營養(yǎng)缺陷型、細(xì)胞毒素劑的耐受性或表達表面蛋白質(zhì)的可選性表現(xiàn)型的標(biāo)記。在用 篩選劑（selective agent)處理過的環(huán)境下，只有表達篩選標(biāo)記的細(xì)胞生存或顯示不同的 表現(xiàn)型，因此可W篩選出被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
[0060] 在一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種用所述重組載體轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌屬微生 物。
[0061] 本文中，所述術(shù)語"轉(zhuǎn)化"表示將包含編碼祀蛋白（互勾百叫査)的多核巧酸的載 體引入到宿主細(xì)胞內(nèi)，W使得所述多核巧酸所編碼的蛋白質(zhì)能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)表達。就被 轉(zhuǎn)化的多核巧酸而言，只要能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)表達，不管其位置是插入到宿主細(xì)胞的染色 體內(nèi)或染色體外，其都包含全部基因。并且，所述多核巧酸包含編碼祀蛋白的DNA及RNA。就 所述多核巧酸而言，只要能夠引入到宿主細(xì)胞內(nèi)并表達就可，與基因引入的形式?jīng)]有關(guān)系。 例如，所述多核巧酸可表達盒（expression cas sette)的形式引入到宿主細(xì)胞中，所 述表達盒是包含自主表達所需的所有因素的多核巧酸構(gòu)建體。所述表達盒通常包含可操作 地連接到所述基因的啟動子(promoter);轉(zhuǎn)錄終止信號；核糖體結(jié)合位點；W及翻譯終止信 號。所述表達盒可W是能夠?qū)崿F(xiàn)自主復(fù)制的表達載體形式。并且，所述多核巧酸可W是W本 身的形狀引入到宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中可操作地連接到表達所需要的序列。
[0062] 本發(fā)明的微生物，只要是能夠表達所述異構(gòu)酶變異體，則可W包含任意原核微生 物及真核微生物。例如，其可W包含屬于埃希氏菌化scherichia)屬、歐文氏菌化rwinia) 屬、沙雷氏菌（Serratia)屬、普羅維登斯菌（Providencia)屬、棒狀桿菌（Corynebacterium) 屬及短桿菌(Brevibacterium)屬的微生物菌株。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物為屬于棒狀桿菌 屬的微生物，更加優(yōu)選為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteri皿glutami州m)。
[0063] 本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，用具有SEQ ID N0:8、9、10的堿基序列的載體轉(zhuǎn)化具有 L-氨基酸生產(chǎn)力的谷氨酸棒狀桿菌，并將制備的菌株分別命名為谷氨酸棒狀桿菌 (Coiynebacterium glutamicum)pFIS-1-TNAI-2、pFIS-1-TNAI-3、pFIS-1-TNAI-4，并于 2013年2月14日分別W保藏編號分別為KCCM11378P、KCCM11379P及KCCM11380P保藏于位于 韓國首爾西大口區(qū)弘濟1桐361-221號的國際保藏機構(gòu)韓國菌種協(xié)會附屬韓國微生物保藏 中屯、。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供所述棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)物。
[0064] 所述培養(yǎng)物可W是包含所述微生物的菌體的培養(yǎng)原液，并且可W是去除培養(yǎng)上清 液或濃縮培養(yǎng)物而獲得的菌體。所述培養(yǎng)液的組成不僅可W包含通常的棒狀桿菌屬微生物 的培養(yǎng)所需的成分，還可w進一步包含對棒狀桿菌屬微生物的成長具有促進作用的成分， 對于所述的組成，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W很容易地進行選擇。并且，培養(yǎng)物的狀態(tài)可W是 液相狀態(tài)或干燥狀態(tài)，干燥的方法可W使用風(fēng)干燥、自然干燥、噴霧干燥及冷凍干燥，但不 限定于此。
[0065] 本發(fā)明的棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)，可W通過常規(guī)的方法來進行。具體而言，可W 在完全或部分含有原糖（智宮）或葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中接種所述微生物并培養(yǎng)。所 述培養(yǎng)過程可W在本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進行。就運種培養(yǎng)過程而言， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W根據(jù)所選擇的菌株容易地調(diào)整并使用。所述培養(yǎng)方法的例子包括分批 式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)及流加式培養(yǎng)，但不限定于此。培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)貪M足特 定菌株的要求條件。
[0066] 具體而言，本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基使用原糖或葡萄糖作為主要碳源，并且包含大 量原糖的糖漿也可W用作碳源。另外，適量的碳源可W通過各種形式被利用，優(yōu)選使用精制 葡萄糖?？蒞用作氮源的例子包括蛋白腺、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米浸潰液及大 豆豆巧的有機氮源，及諸如尿素、硫酸錠、氯化錠、憐酸錠、碳酸錠及硝酸錠等無機氮源，優(yōu) 選使用蛋白腺。運些氮源可W單獨使用或組合使用。所述培養(yǎng)基包含憐酸二氨鐘、憐酸氨二 鐘及對應(yīng)的含鋼鹽作為憐源。并且，所述培養(yǎng)基可W包含諸如硫酸儀或硫酸鐵的金屬鹽。另 夕h所述培養(yǎng)基還可W包含氨基酸、維生素及適當(dāng)?shù)那败|體等。運些培養(yǎng)基或前軀體可 分批式或連續(xù)式添加到培養(yǎng)物中。
[0067] 具體而言，培養(yǎng)的溫度通常為27°C至37°C，優(yōu)選為30°C至37°C，培養(yǎng)時間可W持續(xù) 到所需要的蛋白質(zhì)表達，優(yōu)選為10至100小時。
[0068] 本發(fā)明提供一種D-塔格糖的制備方法，其包括W下包括:選自具有將所述D-半乳 糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的活性的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體、所述轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌屬微生物或所述 轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)物中的任一種存在的條件下，使包含D-半乳糖的溶液與提 供金屬離子的物質(zhì)進行反應(yīng)，所述金屬離子是選自儘離子、儀離子及鋒離子中的任一種W 上。
[0069] 為了將所述棒狀桿菌屬微生物或培養(yǎng)物制備成能夠引入底物的狀態(tài)，將離屯、分離 而回收的菌體用表面活性劑、溶菌酶、二甲苯進行處理，優(yōu)選用〇.l%P〇ESA處理。
[0070] 本發(fā)明的包含D-半乳糖的溶液可W選自精制D-半乳糖、來源于生物質(zhì)的D-半乳糖 及通過乳糖的水解得到的D-半乳糖，但不限定于此。
[0071] 所述阿拉伯糖異構(gòu)酶是使用金屬離子作為輔助因子的金屬酶(metalloenzyme)的 一種，所述金屬離子可W選自儘離子、儀離子及鋒離子，但不限定于此，可W是與異構(gòu)酶結(jié) 合并能夠進行異構(gòu)化反應(yīng)的所有金屬離子。具體而言，提供所述儘離子的物質(zhì)有氯化儘;提 供儀離子的物質(zhì)有氯化儀;W及提供鋒離子的物質(zhì)有氯化鋒，但不限定于此。
[0072] D-塔格糖生產(chǎn)反應(yīng)液包含諸如S徑甲基氨基甲燒(Tris)緩沖液、憐酸緩沖液的用 于維持抑的緩沖液系統(tǒng)，優(yōu)選使用抑6.5至7.5的S徑甲基氨基甲燒(Tris)緩沖液。所包含 的氯化儘、氯化儀或氯化鋒為O.lmM至lOmM，優(yōu)選為ImM至5mM。添加作為底物的D-半乳糖Ig/ L至300g/L，優(yōu)選添加18g/L至300g/L，在60°C至95°C，優(yōu)選在70°C至80°C，最為優(yōu)選在72°C 至78°C的反應(yīng)溫度下，誘導(dǎo)異構(gòu)化反應(yīng)從而生產(chǎn)D-塔格糖。
[0073] 下面，將通過實施例對本發(fā)明進行更加詳細(xì)的說明。運些實施例是為了更加具體 地說明本發(fā)明而提出的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該很清楚根據(jù)本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明的范 圍并不限定于運些實施例。
[0074] <實施例〉
[0075] 實施例1:用于制備轉(zhuǎn)化活性得到提高的酶的來源于新阿波羅棲熱袍菌的阿拉伯 糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)的建模及主要氨基酸變異的推測
[0076] 來源于新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana)DSM 5068的野生型阿拉伯 糖異構(gòu)酶的=維結(jié)構(gòu)還沒公開，因此維結(jié)構(gòu)已被公開且序列相似性高的大腸桿菌 化scherichia coli)阿拉伯糖異構(gòu)酶為模板，通過蛋白質(zhì)分子建模法，對S維結(jié)構(gòu)進行了 預(yù)測。為了預(yù)測S維結(jié)構(gòu)，使用了比較建模komparative modeling)法，并使用化ipos公司 的分子建模軟件包(molecular modeling package)中的APM模塊(Tripos,USA)得到了結(jié)構(gòu) 模型。
[0077] 所述比較建模(comparative modeling)法是預(yù)測蛋白質(zhì)S維結(jié)構(gòu)時最多使用的 方法。在所需的蛋白質(zhì)氨基酸序列與=維結(jié)構(gòu)已被公開的其他蛋白質(zhì)的序列很相似的情況 下，可W利用所述方法容易地預(yù)測所需蛋白質(zhì)的=維結(jié)構(gòu)，在運種情況下預(yù)測準(zhǔn)確度非常 局。
[0078] 所述來源于大腸桿菌的阿拉伯糖異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)是使用了在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (protein da1:a bank;PDB)中W2HXG.P化登記的、聚物（trimer)的形狀所決定的結(jié)構(gòu)。
[0079] 從建模的結(jié)果，預(yù)測出來源于新阿波羅棲熱袍菌DSM5068的野生型阿拉伯糖異構(gòu) 酶(氨基酸序列:SEQ ID N0:1，堿基序列:SEQ ID N0:6)與所述大腸桿菌的阿拉伯糖異構(gòu)酶 不僅具有非常相似的堿基序列，還具有非常相似的二、=維結(jié)構(gòu)。對于在大腸桿菌的阿拉伯 糖異構(gòu)酶，通過一些研究，關(guān)于底物結(jié)合位點（substrate binding site)、作為輔助因子 (cofactor)的儘離子(Mn2+)結(jié)合位點及組成其的主要氨基酸的信息已被公開(Man jasettyfe 化ance，J.Mol. Biol.，2006.360 : 297-309)，在此基礎(chǔ)上推測了來源于新阿波羅棲熱袍菌 DSM5068的阿拉伯糖異構(gòu)酶的主要殘基。
[0080] 為了分析主要氨基酸殘基，進行了蛋白質(zhì)序列分析（sequence alignment)、分子 對接模擬實驗(molecular Docking simulation)、反應(yīng)機理分析。蛋白質(zhì)序列分析是WlO 種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和新阿波羅棲熱袍菌阿拉伯糖異構(gòu)酶的序列信息為基礎(chǔ)，利用 clustalW算法(clustalW algorithm) (//www.ebi .ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行分 析。
[0081] 從序列分析的結(jié)果可W得知，來源于新阿波羅棲熱袍菌DSM5068的阿拉伯糖異構(gòu) 酶與其他異構(gòu)酶一樣，金屬結(jié)合位點及活性位點的序列被很好地保存得。來源于新阿波羅 棲熱袍菌DSM5068的阿拉伯糖異構(gòu)酶具有包含E302(第302位谷氨酸）、E329(第329位谷氨 酸）、H346(第346位組氨酸）、H445(第445位組氨酸）氨基酸殘基和儘離子的活性位點 (active site)(圖1)，所述E302、E329、冊46、H445氨基酸殘基會影響儘離子結(jié)合。尤其是， E302、E329殘基被預(yù)測為促進異構(gòu)化反應(yīng)的最重要的因素 （Man jasetty&Chance， J.Mol.Biol.,2006.360:297-309)。
[0082] 假設(shè)來源于新阿波羅棲熱袍菌的阿拉伯糖異構(gòu)酶根據(jù)所述活性位點的尺寸、形狀 及組成它們的氨基酸殘基的特性決定底物選擇性。通過利用原始底物k阿拉伯糖的分子對 接模擬實驗（surflexDock; Tripos，USA)，選定了對底物識別重要的殘基。并且，通過反應(yīng)機 理分析（A化ian J.Mu化olland,Drug Discov.Today.2005.10(20): 1393-402)，選定了D-半 乳糖的最合適的結(jié)合位置。在此基礎(chǔ)上篩選出阻礙阿拉伯糖異構(gòu)酶的活性位點和D-半乳糖 的結(jié)合的高可能性的氨基酸殘基。
[0083] 第275位氨基酸由具有芳香族側(cè)鏈、尺寸相對大、柔初性(flexibility)低的苯丙 氨酸組成，可W預(yù)測到此位點與D-半乳糖的第6位碳互相引起空間位阻（steric himlrance)(圖2)。心阿拉伯糖是五碳糖，其與D-半乳糖相比時，除了少一個碳W外，結(jié)構(gòu)基 本相同，因此期望只將第275位取代為其他種類的氨基酸，也能大幅度提高所述阿拉伯糖異 構(gòu)酶對D-半乳糖的反應(yīng)性。
[0084] 對于能夠替代苯丙氨酸的氨基酸，選定了鄉(xiāng)氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸，它們與苯丙 氨酸具有相似的極性，尺寸相對較小，柔初性高，從而使與D-半乳糖的第6位碳的排斥作用 最小化，同時對阿拉伯糖異構(gòu)酶的整體結(jié)構(gòu)所引起的影響較小。
[0085] 它們與包含芳香族的苯丙氨酸相比，因由非極性的脂肪族鏈形式組成而在結(jié)構(gòu)上 自由，同時期望可W取代苯丙氨酸的位置。
[00化]再次用分子建模法對發(fā)生點突變（point mutation)的變異體（氨基酸：SEQ ID N0:3至5,核酸:SEQ ID N0:8至10)的結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果是，上述變異對阿拉伯糖異構(gòu)酶整 體結(jié)構(gòu)引起的影響并不明顯。
[0087] 并且，W所述來源于新阿波羅棲熱袍菌DSM5068的野生型阿拉伯糖異構(gòu)酶為模板 (template),通過隨機的酶變異法（甲耐竿I豈么巧0|酉)，得到了一定數(shù)量的、具有改 良的酶特性的變異體及其基因信息。對運些進行綜合分析，結(jié)果可W確認(rèn)所述阿拉伯糖異 構(gòu)酶的C-末端(C-terminal)部分的氨基酸序列的變化會影響酶活性的提高。
[0088] 通過分子預(yù)測法，確認(rèn)阿拉伯糖異構(gòu)酶的C-末端區(qū)域的鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生大幅度變異的 現(xiàn)象，結(jié)果是，只將作為所述野生型阿拉伯糖異構(gòu)酶的第469位氨基酸的亮氨酸取代為脯氨 酸，也能期望大幅度提高所述阿拉伯糖異構(gòu)酶對D-半乳糖的反應(yīng)性。
[0089] 實施例2:制備所設(shè)計的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體
[0090] (1)作為第469位氨基酸的亮氨酸被脯氨酸取代
[0091 ] 通過利用特定引物的定點誘變（site-directed mutagenesis)法，使來源于新阿 波羅棲熱袍菌DSM5068的野生型阿拉伯糖異構(gòu)酶的第469位亮氨酸被脯氨酸取代。
[0092] 使用具有突變的兩個互補的堿基序列的寡核巧酸(oligonucleotide)即N-末端引 物(SEQ ID NO: 13)和C-末端引物(SEQ ID NO: 14)作為引物。使用質(zhì)粒狀態(tài)的DNA作為模板， 在試管中對發(fā)生新變異的質(zhì)粒進行擴增、合成，然后用化n I限制酶切割并去除原來的野生 型(wild type)DNA。即，作為模板使用的野生型DNA是從大腸桿菌分離的DNA，其會被用于識 別并切割Gm6ATC的化n I切割，但是在試管中合成的變異DNA不會被切割。
[0093] 將DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊alpha而得到變異株，然后對變異基因的堿基序列進行 分析并確認(rèn)發(fā)生了正確的變異。將該變異株轉(zhuǎn)化到作為最終表達菌株的谷氨酸棒狀桿菌 ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)?制備重組菌株，然后將其命名 為L469P。此后，將其用作對照組。
[0094] (2)第259位氨基酸被除了苯丙氨酸^外的氨基酸取代
[00M]為了在所述制備的變異體L469P中誘導(dǎo)進一步的變異，在克隆有異構(gòu)酶的載體上， 利用包含變異的一對引物，實施飽和突變(saturated mu1:agenesis)法。
[0096] 所設(shè)計的一對引物被設(shè)計成第275位氨基酸密碼子被順S (N: A、T/G或C，S: G或C)取 代，通過運種方法得到的變異體可W包含所有20種氨基酸（SEQ ID NO:11及SEQ ID NO: 12)。運些變異體可W通過轉(zhuǎn)化(transformation)制備成單一菌落，對它們進行篩選并分析 活性，可W確認(rèn)根據(jù)相應(yīng)位置的20種氨基酸變異的活性的變化。
[0097] 具體而言，為了構(gòu)建包含20種氨基酸的庫，WlOOul/ml濃度的PECCG117-CJ1- TNAI_L469P質(zhì)粒[韓國公開專利10-2010-0016948]作為模板，添加正向引物、反向引物并進 行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，Polymerase Chain Reaction)ePCR反應(yīng)在如下述表1及表2的條件下 進行。將通過PCR反應(yīng)得到的庫轉(zhuǎn)化(transformation)到大腸桿菌化.coli K12D冊a)菌株 并制備成菌落形態(tài)。所使用的質(zhì)粒由于均能夠在大腸桿菌和棒狀細(xì)菌中進行復(fù)制及表達相 應(yīng)基因，因此在大腸桿菌中的狀態(tài)下表達并直接進行了活性試驗。
[009引對由如所述得到的110個菌落表達的異構(gòu)酶，用半脫氨酸-巧挫（cysteine- carbazol method；Dische,Z.,and E.Borenfreund.,A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses,J.Biol.Chem., 192:583-587,1951)法分析活性，結(jié)果可W確認(rèn)與對照組化469P)相比其多數(shù)克隆具有更高 的活性(圖3)。
[0099] 其中篩選出所測定的活性最高的10個菌落并對它們進行測序而分別確認(rèn)序列的 結(jié)果，如預(yù)期一樣可W確認(rèn)活性W鄉(xiāng)氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸(氨基酸:SEQ ID N0:3至5,核 酸:SEQ ID N0:8至10)的順序提高。并且，從除了第275位氨基酸W外沒有發(fā)現(xiàn)變異的情況 來看，可W確認(rèn)如假設(shè)一樣第275位位置的苯丙氨酸殘基起到阻礙D-半乳糖的反應(yīng)性的作 用。
[0100] 為了解所述變異對異構(gòu)酶會產(chǎn)生何種影響，再次用分子建模法對變異體的結(jié)構(gòu)進 行了預(yù)測（圖4)。根據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，可W確認(rèn)=種變異體均對二維、=維結(jié)構(gòu)沒有引起 大幅度變化，并且代替了苯丙氨酸的位置。因此，可W期望對熱穩(wěn)定性及其他生產(chǎn)指標(biāo)沒有 引起大幅度變化，同時提高了對D-塔格糖的反應(yīng)性。
[0101] 將所述變異株轉(zhuǎn)化到作為最終表達菌株的谷氨酸棒狀桿菌ACTC13032W制備重組 菌株，然后分別命名為"谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)pFIS-1-TNAI-2、 pFIS-1-TNAI-3、pFIS-1-TNAI-4"，并于2013年2月14日分別^保藏編號1(此111378口、 KCCM11379P及KCCM11380P保藏于位于韓國首爾西大口區(qū)弘濟1桐361-221號的國際保藏機 構(gòu)韓國菌種協(xié)會附屬韓國微生物保藏中屯、。
[0102] 表1
[0103] 飽和誘變（Saturated mu1:agenesis)PCR
[0104]

[0105] 表2
[0106] PCR反應(yīng)條件 [01071
[0108] 實施例3:阿拉伯糖異構(gòu)酶在棒狀桿菌屬微生物中的表達
[0109] 為了對篩選出的變異體的活性提高程度及在實際D-塔格糖生產(chǎn)中的適用可能性 進行測定，將所述巧巾變異體在棒狀桿菌屬微生物中表達并進行了關(guān)于生產(chǎn)性及生產(chǎn)相關(guān) 指標(biāo)的研究。
[0110] 將在所述實施例2中篩選出的3種變異體轉(zhuǎn)化到野生型谷氨酸棒狀桿菌（ATCC 13032)而制備了重組菌株。將運些菌株在包含50]ig/ml濃度的卡那霉素化anamycin)的培養(yǎng) 基（葡萄糖20g/L,多價蛋白腺（poly peptone) lOg/L,酵母提取物lOg/L,硫酸錠lOg/L, K出P〇4 5.2g/l，K2HP〇4 lQ.7g/l，MgS〇4 Q.5g/L，尿素 1.5g/l，D-生物素 1.8mg/L，硫胺素9mg/ L，泛酸巧9mg/L，煙酷胺60mg/L)中，在30°C下培養(yǎng)20小時，誘導(dǎo)了重組阿拉伯糖異構(gòu)酶變異 體的表達。
[0111] 為了對表達的阿拉伯糖異構(gòu)酶的活性進行測定，將培養(yǎng)液在8000重力（g-force) 下離屯、分離10分鐘并回收菌體，然后再懸浮在50mMS徑甲基氨基甲燒-鹽酸(Tris-HCl)(抑 7.5)緩沖溶液中。在常溫下，用0.1 %P0ESA對懸浮的菌體進行處理1小時，從而使細(xì)胞壁弱 化。在所述條件下，再次離屯、分離并再次回收菌體，并再懸浮在300g/L D-半乳糖、5mM氯化 儘、50mMS^甲基氨基甲燒-鹽酸(時i S-HC1) (pH 7.5)混合溶液中，W達到4 % (w/v)的濃 度。將其在75°C下進行反應(yīng)1小時，并為了定量D-半乳糖、D-塔格糖，進行了HPLC分析(高效 液相色譜儀（WATERS HPLC),授權(quán)系統(tǒng)化MP0WER system),WATERS Sugarfak ID 6.5- L300mm色譜柱，2414折光率檢測器(Refractive Index Detector))。
[0112] 進行1小時反應(yīng)，結(jié)果可W確認(rèn)在相同條件下，與對照組L469P可W生產(chǎn)35g/L的D- 塔格糖相比，變異體F275V/L469P顯示121g/L ? h的生產(chǎn)性，F(xiàn)275M/L469P顯示117g/L ? h的 生產(chǎn)性，F(xiàn)275I/L469P顯示lOlg/L ? h的生產(chǎn)性。
[0113] 實施例4:在棒狀細(xì)菌中表達的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體的分離精制及活性測定
[0114] 對包含活性得到確認(rèn)的巧巾變異體 F275V/L469P、F275M/L469P、TNAI-F275I/L469P 及對照組L469P的重組菌株進行種菌培養(yǎng)（seed culture)，然后在與實施例3相同的條件 下，在化的燒瓶中培養(yǎng)200mL重組菌株。為了確認(rèn)阿拉伯糖異構(gòu)酶表達與否，利用一部分培 養(yǎng)液，在與實施例3相同的條件下對活性進行了測定。
[0115] 將從培養(yǎng)液得到的菌體再懸浮在包含O.lmM氯化儘的20mM=^甲基氨基甲燒-鹽 酸（Tris-HCl)(pH 7.5)緩沖溶液中，并利用高壓細(xì)胞破碎儀1'-系列4.04￥(1'-36'163 4.OkW:衡量系統(tǒng)(Constant systems)，英國）對細(xì)胞進行破碎。為了去除除了阿拉伯糖異構(gòu) 酶W外的內(nèi)源性蛋白質(zhì)(endogenous protein)，在75°C下進行熱處理20分鐘。在8,000重力 (g-force)下通過進行10分鐘的離屯、分離去除經(jīng)過熱處理的細(xì)胞殘渣bell debris)，然后 在60，000重力（g-force)下進行超高速離屯、分離（BECKMAN COULTER Optima ^80XP 叫tracentri化ge)，盡可能去除了細(xì)胞殘渣及脂質(zhì)成分（lipid)。
[0116] 利用離子交換樹脂層析（陰離子交換樹脂層析（anion exchange chromatogra地y):Mono Q? lO/lOOGL,通用電氣醫(yī)療集團（GE Healthcare))，對如上述得 到的細(xì)胞破碎液（細(xì)胞抽提物（cell extract))進行精制。用結(jié)合液[binding solution, 50mM化Cl，0.1 mM氯化儘，20mMS徑甲基氨基甲燒-鹽酸（Tris-HCl) (pH7.5)]進行預(yù)平衡 (pre-equilibration)，然后結(jié)合過量的細(xì)胞破碎液，提高洗脫液[IM rfeCl，0.1 mM氯化車孟， 20mMS?甲基氨基甲燒-鹽酸(Tris-HCl)(pH7.5)]的比率的同時進行了分級。通過半脫氨 酸-P卡挫-硫酸法（cystein-ca;rbazo；L-sulfu;ricacidmethod)來選擇對D-半乳糖具有活性 的級分，然后通過SDS-PAGE來進行分析。
[0117] 其結(jié)果，可W確認(rèn)精制的蛋白質(zhì)具有約56kDa的分子量，由此可W知道其與目前已 知的來源于新阿波羅棲熱袍菌屬的阿拉伯糖異構(gòu)酶的分子量一致。通過SDS-PAGE選擇精制 度最好的一個級分，并利用脫鹽柱（PD-lODesalting column,通用電氣醫(yī)療集團（GE Healthcare))去除了高濃度的化C1。通過SDS-PAGE分析最終確保的精制酶（圖5)。利用 化a壯ord檢測法對經(jīng)過分離精制的蛋白質(zhì)進行定量，使用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為BSA(牛血清白蛋 白Bovine Serum Albumin)。
[0118] 實施例5:對阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體的特性的研究
[0119] 確認(rèn)了在上述實施例中制備的巧巾阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體與將位于第469位的亮 氨酸取代為脯氨酸的變異體相比具有明顯提高的活性。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上，對與影響D-塔 格糖實際生產(chǎn)的反應(yīng)條件相關(guān)的變量進行了實驗。
[0120] <5-1〉對最適溫度的研究
[0121] 新阿波羅棲熱袍菌阿拉伯糖異構(gòu)酶是高度嗜熱菌的酶，具有相對高的熱穩(wěn)定性和 最適溫度。由D-半乳糖生產(chǎn)D-塔格糖的最合適的溫度條件為55°C至75°C之間，運是因為在 比運個溫度低的溫度下會發(fā)生異種菌株的污染所帶來的問題，并且在高的溫度下會產(chǎn)生所 生產(chǎn)的D-塔格糖的穩(wěn)定性方面的問題。就目前使用的野生型阿拉伯糖異構(gòu)酶或?qū)φ战M L469P而言，最適反應(yīng)溫度為85°C，在可適用于生產(chǎn)工序的溫度下，存在活性相對低的問題。
[0122] 為了確認(rèn)在所述實施例4中經(jīng)過分離、精制的變異型阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適溫度， 在lOOmM D-半乳糖底物中添加經(jīng)過精制的酶，并在包含ImM氯化儘(MnCl2)的50mM立徑甲基 氨基甲燒-鹽酸(TriS-HC1)緩沖溶液(pH 7.5)中，在60°C至90°C的范圍內(nèi)W5°C的間隔對活 性進行了調(diào)查。
[0123] 所述活性測定是用半脫氨酸-巧挫法來進行了測定。如圖6所示，觀察根據(jù)溫度的 酶活性的結(jié)果，3種變異型阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度為75°C，其與L469P相比，移動了 10°C。由此可W確認(rèn)在能夠適用于工序的溫度范圍內(nèi)，異構(gòu)酶的活性在整體上得到了提高， 生產(chǎn)工序的運用范圍也變得更廣。
[0124]并且，從=種變異株均顯示相似模式的特性來看，可W推測作為第275位氨基酸的 苯丙氨酸殘基的特性會影響最適反應(yīng)溫度。由此可W推測，運是為了確保充分的柔初性，W 在不是原始底物的D-半乳糖的反應(yīng)過程中能夠最小化第275位苯丙氨酸與D-半乳糖的空間 位阻。隨著溫度的上升，苯丙氨酸的苯基殘基及其周邊殘基的分子活動也會變得活潑，由此 存在與D-半乳糖的第6位碳的空間位阻減少的可能性。同時可W預(yù)測，在對蛋白質(zhì)的S維、 四維結(jié)構(gòu)不造成大幅度影響的范圍內(nèi)會形成最合適的溫度。因此，基于第275位的變異而空 間位阻在本質(zhì)上減少的變異體中，可W出現(xiàn)最適溫度的變化。但是為了科學(xué)地證明所述內(nèi) 容，需要進行額外的分析和實驗。
[01巧]<5-2〉對熱穩(wěn)定性的研究
[0126] 為了檢測變異型阿拉伯糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性，在50mM = ^甲基氨基甲燒-鹽酸 (化iS-肥1) (pH 7.5)、ImM氯化儘溶液中添加精制成20iig/ml的濃度的酶，并在95°C下，在恒 溫水槽中培養(yǎng)180分鐘。用不同時間點取樣的酶溶液進行酶反應(yīng)，對酶的殘存活性進行了測 定。
[0127] 對熱穩(wěn)定性進行調(diào)查的結(jié)果，如圖7所示，可W確認(rèn)異構(gòu)酶變異體的殘存活性在95 °C下隨著時間的推移會減弱，但是變異體之間的熱穩(wěn)定性差異并不大。為了得到更加定量 的數(shù)據(jù)，對活性的半衰期化alf-life)進行測定，結(jié)果可W確認(rèn)L469P在所述條件下具有約3 小時的半衰期，第275位變異體具有約2小時前后的半衰期(表3)。相對而言，所測定到的第 275位變異體的相對熱穩(wěn)定性比較低，但是差異并不大，考慮到活性提高的部分和降低工序 溫度時的情況，可W判斷為能夠充分抵消的程度。
[012引表3
[0129]在95°C下測定的阿拉伯糖異構(gòu)酶的半衰期 rmr^ol
LU I I」 大了巷了並牌罔了雙米護」7巧'比災(zāi)'kLtfJ例?凡
[0132]很多酶的催化作用需要金屬離子，因此為了確認(rèn)本發(fā)明的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體 的熱穩(wěn)定性對金屬離子的依賴性，利用精制的酶，對基于金屬離子的酶活性變化進行了調(diào) 查。
[01削為了調(diào)查基于濃度的酶活性變化，在lOOmM D-半乳糖底物中添加精制的酶，并在 包含ImM至5mM濃度的氯化儘(MnCl2)的50mMS徑甲基氨基甲燒-鹽酸（化iS-HC1) (pH 7.5) 溶液中，在75°C下進行了 10分鐘的實驗（圖8)。其結(jié)果可W確認(rèn)所有變異體在實驗范圍內(nèi)具 有相似程度的活性，并可W得知儘離子對基于酶活性所需的因素濃度的異構(gòu)酶活性的影響 并不大。
[0134] <5-4〉關(guān)于酶活性的研究
[0135] 為了測定酶反應(yīng)速度，在75°C的反應(yīng)溫度條件下，對阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體的比 活度（specific activity)進行了測定。在抑7.5、75°C下添加 ImM氯化儘、lOOmM D-半乳 糖，然后對Img酶的反應(yīng)性進行了測定。在對應(yīng)的條件下進行反應(yīng)10分鐘后調(diào)查比活度，結(jié) 果第275位變異體的比活度與1469?相比分別高出約5.5倍巧275￥)、約5倍(。2751)、約3.9倍 (F275IK 表 4)。
[0136] 表4
[0137] 變異體的比活度 [013 引
[0139] [保藏編號]
[0140] 保藏機構(gòu)名:韓國微生物保藏中屯、（國外）
[0141] 保藏編號:KCCM11378P
[0142] 保藏日期：20130214
[0143] 保藏機構(gòu)名:韓國微生物保藏中屯、（國外）
[0144] 保藏編號:KCCM11379P
[0145] 保藏日期：20130214
[0146] 保藏機構(gòu)名:韓國微生物保藏中屯、（國外）
[0147] 保藏編號:KCCM11380P [014引保藏日期:20130214
[0149]
[0150] 保藏的微生物或其它生物學(xué)物質(zhì)的表示事項
[0151] (專利合作條約規(guī)則第13條第2項）
[0152]
[i
[0156] 保藏的微生物或其它生物學(xué)物質(zhì)的表示事項[0157] (專利合作條約規(guī)則第13條第2項）
[i
[i
[015 引
[(
[(
[(
[0162] 保藏的微生物或其它生物學(xué)物質(zhì)的表示事項
[0163] (專利合作條約規(guī)則第13條第2項）
[0164]
[0
[0166] PCT/RO/134表(1998年7月；2004年 1 月再版）。
【主權(quán)項】
1. 一種阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體，其使D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的活性得到提高，其中 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的第275位氨基酸被除了苯丙氨酸(phenylalanine)以外的 氨基酸取代，第469位氨基酸被脯氨酸(pro 1 ine)取代。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體，其特征在于，所述第275位氨基酸被 選自繳氨酸(valine )、蛋氨酸(methionine)及異亮氨酸（isoleucine)中的任一種氨基酸取 代。3. -種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1所述的阿拉伯糖異構(gòu)酶變異體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10的堿基序列。5. -種棒狀桿菌屬微生物，其通過包含權(quán)利要求3所述的多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的棒狀桿菌屬微生物，其特征在于，所述棒狀桿菌屬微生物為谷 氨酸棒狀桿菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的棒狀桿菌屬微生物，其特征在于，所述棒狀桿菌屬微生物為谷 氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)pFIS-1-TNAI_2(KCCMl 1378P)、pFIS_l_ TNAI-3(KCCM11379P)或pFIS-1-TNAI-4(KCCM11380P)。8. -種D-塔格糖的制備方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求5~7中任一項所述的棒狀桿菌屬微 生物的步驟。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的D-塔格糖的制備方法，其特征在于，在棒狀桿菌屬微生物存在 的條件下，使包含D-半乳糖的溶液與提供金屬離子的物質(zhì)進行反應(yīng)，其中金屬離子選自氯 化錳、氯化鎂及氯化鋅。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的D-塔格糖的制備方法，其特征在于，所述氯化錳以O(shè).lmM~ 10mM的濃度添加。
【文檔編號】C12P19/02GK106062188SQ201480076841
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年4月25日
【發(fā)明人】吳麟錫, 金昌謙, 曺承鉉, 金成俌, 金良姬, 趙景衍, 梁成才, 金鎮(zhèn)夏
【申請人】Cj第制糖株式會社, Cj第一制糖株式會社