具有提高的凝乳特性的凝乳酶變體的制作方法
【專利摘要】具有提高的凝乳特性的凝乳酶變體。
【專利說明】
具有提高的凝乳特性的凝乳酶變體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及具有提高的凝乳特性的凝乳酶變體。
【背景技術(shù)】
[0002] 通過乳凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶）的酶促乳凝固是乳酪生產(chǎn)中的最重要工 藝之一。酶促乳凝固是一個(gè)兩階段工藝:第一階段，其中蛋白水解酶凝乳酶或胃蛋白酶攻擊 K-酪蛋白，導(dǎo)致酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的亞穩(wěn)態(tài);第二階段，其中乳隨后凝固并形成凝塊。
[0003] 凝乳酶化C 3.4.23.4)和胃蛋白酶化C 3.4.23.1)(哺乳動(dòng)物胃中的乳凝固酶)是 屬于膚酶中的一大類的天冬氨酸蛋白酶。
[0004] 當(dāng)在胃黏膜細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，凝乳酶和胃蛋白酶分別作為無酶活性的前凝乳酶原 (pre-prochymosin)和前胃蛋白酶原存在。當(dāng)分泌凝乳酶時(shí)，N端膚片段，即前片段（pre- fragmentK信號(hào)膚)被切除W產(chǎn)生包含原片段(pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是該 酶的基本無活性形式酶，但是其在酸性條件下通過原片段的自動(dòng)催化性去除被活化而變成 活性凝乳酶。運(yùn)種活化在適宜的pH條件下在胃腔中體內(nèi)發(fā)生或者在酸性條件下體外發(fā)生。
[0005] 牛(Bos taurus)前凝乳酶原、凝乳酶原和凝乳酶的結(jié)構(gòu)和功能特征已得到廣泛研 究。牛前凝乳酶原分子的前部分包含16個(gè)aa殘基并且對(duì)應(yīng)凝乳酶原的原部分的長(zhǎng)度是42個(gè) aa殘基?；钚耘Ｄ槊赴?23個(gè)aa，是兩種皆具有活性的形式A和B的混合物。
[0006] 凝乳酶在哺乳動(dòng)物物種中天然產(chǎn)生，所述哺乳動(dòng)物例如牛、駱駝、山羊、水牛、綿 羊、豬、人、猴和大鼠。
[0007] 牛凝乳酶已商用于乳品工業(yè)多年。
[000引 W002/36752A2(C虹.Hansen))描述了駱駝凝乳酶的重組產(chǎn)生。
[0009] W02013/174840A1 (化r.化nsen)描述了牛和駱駝凝乳酶的突變體/變體。
[001日]W02013/164479A2(DSM)描述了牛凝乳酶的突變體。
[0011] 下文緊接著列出的參考文獻(xiàn)在本發(fā)明的上下文中可看作描述凝乳酶突變體的參 考文獻(xiàn)：
[0012] -Suzuki等：Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218,Lys220and Asp304in chymosin,Protein Engineering,第4卷，1990年1月，第 69-71 頁(yè)；
[0013] -Suzuki等：Alteration of catalytic properties of chymosin by site- directed mutagenesis,Protein Engineering,第2卷，1989年5月，第563-569頁(yè)；
[0014] -V曰n den Brink等：Incre曰sed production of chymosin by glycosyl曰tion, Journal of biotechnology,第 125卷，2006年9月，第304-310頁(yè)；
[0015] -Pitts等：Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderm曰 reesei,Journal of biotechnology,第28卷，1993年3 月，第69-83頁(yè)；
[0016] -M.G.Williams等：Mutagenesis,biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin,Protein engineering design and selection,第 10卷，1997年9月，第991-997頁(yè)；
[0017] -Strop等：Engineering enzyme subsite specificity:prep曰r曰tion,kinetic characterization,and x-ray analysis at 2.GANG resolution of Vallllphe site mu1:ated calf chymosin,Biochemistry,第29卷，1990年 10月，第9863-9871 頁(yè)；
[0018] -Supannee^ ： Site-specific mutations of calf chymosin B which influence mUk-clotting activity,Food Qiemistry,第62卷 1998年6月，第133-139頁(yè)；
[0019] -Zhang等：Functional implications of disulfide bond,Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin,Biochimica et biophysica acta,第1343卷，1997年12月，第 278-286 頁(yè)。
[0020] 上文提及的現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)均未直接且明確地描述下文中所述/要求保護(hù)的任 一凝乳酶突變體/變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021 ]本發(fā)明要解決的問題是提供具有提高的凝乳特性的凝乳酶變體。
[0022] 如本文的工作實(shí)施例中所討論的一一本發(fā)明人已鑒定出多種經(jīng)改進(jìn)的駱駝(參見 本文中實(shí)施例6)和牛/駱駝(參見本文中實(shí)施例7)凝乳酶變體。
[0023] 基于對(duì)該駱駝和牛變體的比較分析一一本發(fā)明人鑒定出多個(gè)另外的就W下方面 而言在本文中具有重要意義的氨基酸位置:通過制備運(yùn)些位置中一個(gè)或多個(gè)的變體可得到 經(jīng)改進(jìn)的凝乳酶變體。
[0024] 如本領(lǐng)域中已知的一一從不同哺乳動(dòng)物種（例如，如牛、駱駝、綿羊、豬或大鼠）獲 得的不同天然野生型凝乳酶多膚序列具有相對(duì)高的序列相似性/同一性。
[0025] 在本文的圖1中，運(yùn)通過對(duì)本文中相關(guān)的不同凝乳酶序列進(jìn)行比對(duì)來例示。
[0026] 鑒于運(yùn)一相對(duì)密切的序列關(guān)系一認(rèn)為不同的天然野生型凝乳酶的3D結(jié)構(gòu)也是相 對(duì)類似的。
[0027] 在本發(fā)明的上下文中一天然獲得的野生型凝乳酶(例如牛凝乳酶或駱駝凝乳酶） 在本文中可W是親本多膚的一個(gè)實(shí)例一一即對(duì)其進(jìn)行改變W產(chǎn)生本發(fā)明的變體凝乳酶多 膚的親本多膚。
[0028] 不受理論的限制一認(rèn)為本文中所討論的凝乳酶相關(guān)的氨基酸位置就W下方面而 言在本文中任意相關(guān)的目的凝乳酶(例如，例如牛、駱駝、綿羊、豬、大鼠等的凝乳酶）中具有 普遍重要性一通過制備運(yùn)些位置中一個(gè)或多個(gè)的變體一般可得到經(jīng)改進(jìn)的凝乳酶變體(例 如，經(jīng)改進(jìn)的牛、駱駝、綿羊、豬或大鼠凝乳酶變體）。
[0029] 如本文所討論的一作為確定目的親本凝乳酶多膚(例如駱駝、綿羊、牛等）的氨基 酸位置的參照序列，本文中使用公知的牛凝乳酶B前凝乳酶原序列（Genbank登錄號(hào) P00794-在本文中公開為沈Q ID N0:1)。
[0030] SEQ ID N0:1的牛凝乳酶B前凝乳酶原在本文中可另稱為牛(Bos bovis)凝乳酶B 或者簡(jiǎn)稱為牛凝乳酶。該序列也示出在本文的圖1中。
[0031] 本文中相關(guān)的另一凝乳酶序列是公知的本文中SEQ ID ^:2的單峰駝(〔曰111611118 化omedarius)凝乳酶序列。其在本文中可另稱為駱駝凝乳酶。該序列也示于本文的圖1中。
[0032] 在本發(fā)明上下文中，認(rèn)為與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少65%序 列同一性的親本凝乳酶多膚(例如，來自綿羊或大鼠的親本凝乳酶多膚)在本文中可視為與 例如?；蝰橊勀槊妇哂谐浞值慕Y(jié)構(gòu)相關(guān)性W通過制備如本文中所述的任意氨基酸位置 的變體來進(jìn)行改進(jìn)。
[0033] 因此，本發(fā)明的第一方面設(shè)及一種用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其包 括W下步驟：
[0034] (a):在具有凝乳酶活性的親本多膚中的一個(gè)或更多個(gè)位置處產(chǎn)生改變，其中所述 改變包含在至少一個(gè)氨基酸位置的替換、缺失或插入，所述至少一個(gè)氨基酸位置對(duì)應(yīng)于W 下任意位置:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156、163; 212; 222;223;224;238;246;256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、 M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331; 336;346;361;367和379;W及
[0035] (b):產(chǎn)生并分離步驟(a)的經(jīng)改變多膚，從而獲得所述分離的凝乳酶多膚變體，其 中所述變體具有凝乳酶活性；
[0036] 并且其中：
[0037] (i):通過將所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多膚進(jìn)行比對(duì)來確定所述 親本多膚的氨基酸位置--即，使用SEQ ID NO: 1的多膚來確定所述親本多膚的對(duì)應(yīng)氨基 酸序列;且
[0038] (ii):所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少65%的序列 同一性，所述成熟多膚為SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸；
[0039] 并且前提是所述分離的凝乳酶多膚變體不是選自W下的特定變體：
[0040] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0041 ] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0042] Y185F+R213Q+Q246E；
[0043] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0044] G128D+L188I+Y326F；
[0045] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0046] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0047] D117化V261A+R312S;
[0048] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[0049] Y79S+L224V+L311I;和
[0050] R119S+L224V+T297S〇
[0化1] 上述前提可視為與上文所討論的W02013/174840A1 (化r.化nsen)相關(guān)一因?yàn)檫\(yùn)些 特定變體在該文件中進(jìn)行了明確描述。
[0052]如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一該前提僅與特定的提及變體相關(guān)。
[0化3] 例如，僅包含Q24犯替換（即，不包含G309D、S329P和/或D337E)的變體不是在該前 提之內(nèi)的此類特定變體-即，其不是本發(fā)明上下文中放棄要求保護(hù)的。
[0054]如本領(lǐng)域中已知的一技術(shù)人員可基于其公知常識(shí)來常規(guī)地產(chǎn)生并純化凝乳酶及 凝乳酶變體。換言之，一旦技術(shù)人員擁有本文中相關(guān)的具有凝乳酶活性的目的親本多膚(例 如，來自牛、駱駝、綿羊、豬或大鼠），則對(duì)技術(shù)人員來說產(chǎn)生運(yùn)樣的目的親本凝乳酶的變體 是常規(guī)工作。
[0055] 本發(fā)明的第二方面設(shè)及一種分離的凝乳酶多膚變體，其是通過第一方面的方法或 所述方法在本文中相關(guān)的任意實(shí)施方案獲得的。
[0056] 與上述第二方面相關(guān)的術(shù)語"獲得的"應(yīng)理解為該分離的凝乳酶多膚變體已通過 第一方面的方法或所示方法在本文中相關(guān)的任意實(shí)施方案獲得。因此，與第二方面相關(guān)的 術(shù)語"獲得的"不應(yīng)被理解為可獲得的。
[0057] 如文中所討論的一在本文中的工作實(shí)施例中，使用SEQ ID NO: 1(牛）的多膚作為 親本多膚來制備變體一運(yùn)樣的變體在本文中可稱為牛凝乳酶變體。
[0058] 因此，本發(fā)明的第=方面設(shè)及分離的凝乳酶多膚變體：
[0059] (a):其在具有凝乳酶活性的親本多膚中的一個(gè)或更多個(gè)位置處包含改變，其中所 述改變包含對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246； 256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0060] (b):其中所述變體具有凝乳酶活性；
[0061] 并且其中：
[0062] (i):通過將所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多膚進(jìn)行比對(duì)來確定所述 親本多膚的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的多膚來確定所述親本多膚的對(duì)應(yīng)氨基酸 序列;且
[0063] (ii):所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少90%的序列 同一性，所述成熟多膚為SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0064] (iii):所述分離的變體多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有小于 100%的序列同一性；
[0065] 并且前提是所述分離的凝乳酶多膚變體不是選自W下的特定變體：
[0066] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0067] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[006引 Y185F+R213Q+Q246E；
[0069] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0070] G128D+L188I+Y326F；
[0071] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0072] G128化R312S+S313Y+Y326F;和
[0073] D117化V261A+R312S;
[0074] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D [00 巧]Y79S+L224V+L311IW及
[0076] R119S+L224V+T297S〇
[0077] 如本文中所討論的-在本文中的工作實(shí)施例中，使用SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶)的 多膚作為親本多膚來制備變體一一運(yùn)樣的變體在本文中可稱為駱駝凝乳酶變體。
[0078] 因此，本發(fā)明的第四方面設(shè)及分離的凝乳酶多膚變體，其包含：
[0079] (a):在具有凝乳酶活性的親本多膚中的一個(gè)或更多個(gè)位置處的改變，其中所述改 變包含對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入:70; 75; 77; 79; 90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246；256； 261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、 N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0080] (b):其中所述變體具有凝乳酶活性；
[0081] 并且其中：
[0082] (i):通過將所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多膚進(jìn)行比對(duì)來確定所述 親本多膚的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的多膚來確定所述親本多膚的對(duì)應(yīng)氨基酸 序列;且
[0083] (ii):所述親本多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚具有至少90%的序 列同一性，所述成熟多膚為SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0084] (iii):所述分離的變體多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚具有小于 100%的序列同一性；
[0085] 并且前提是所述分離的凝乳酶多膚變體不是選自W下的特定變體：
[00 化]Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0087] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0088] Y185F+R213Q+Q246E；
[0089] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0090] G128D+L188I+Y326F；
[0091] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0092] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0093] D117化V261A+R312S;
[0094] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[00 巧]Y79S+L224V+L311I;和
[0096] R119S+L224V+T297S〇
[0097] 本文中所述的分離的凝乳酶多膚變體可根據(jù)領(lǐng)域而用于例如制備目的食品產(chǎn)品 或飼料產(chǎn)品（例如，如目的乳基產(chǎn)品，例如其可W是乳酪產(chǎn)品）。
[0098] 因此，本發(fā)明的第五方面設(shè)及一種用于制備食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品的方法，其包括 向食品或飼料成分添加有效量的本文中所述的分離凝乳酶多膚變體并進(jìn)行進(jìn)一步的制備 操作W獲得所述食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品。
[0099] 在下文僅通過實(shí)例來描述本發(fā)明的實(shí)施方案。
[0100] 定義
[0101] 本文中相關(guān)術(shù)語的所有定義均根據(jù)技術(shù)人員針對(duì)本文中相關(guān)的技術(shù)背景所理解 的。
[0102] 術(shù)語"凝乳酶"設(shè)及EC 3.4.23.4類的酶。凝乳酶具有高特異性并且其通過切割酪 蛋白K-鏈中的單個(gè)105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108鍵來使乳凝固。本領(lǐng)域中使用的一個(gè)別名 是凝乳素(rennin)。
[0103] 術(shù)語"凝乳酶活性"設(shè)及技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的凝乳酶的凝乳酶活 性。
[0104] 技術(shù)人員知曉如何確定本文中相關(guān)的凝乳酶活性。
[0105] 在本文中的工作實(shí)施例4中，提供了確定凝乳酶比活一另稱為凝固活性或凝乳活 性一的標(biāo)準(zhǔn)方法的一個(gè)實(shí)例。
[0106] 在本文中的工作實(shí)施例5中，提供了確定蛋白水解活性的標(biāo)準(zhǔn)方法的一個(gè)實(shí)例。
[0107] 如本領(lǐng)域中已知的一本文中相關(guān)的所謂C/P比通過將凝固比活(C)除W蛋白水解 活性(P)來確定。
[0108] 如本領(lǐng)域中已知的一較高的C/巧k通常意味著在例如乳酪生產(chǎn)期間由于非特異性 蛋白質(zhì)降解而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)損失降低，即乳酪產(chǎn)量得W提高，并且在熟化期間乳酪中苦味 的生成降低。
[0109] 術(shù)語"分離的變體"意指通過人工修飾的變體。在一個(gè)方面，如通過SDS PAGE確定 的，變體具有至少1 %純度，例如至少5 %純度，至少10 %純度，至少20 %純度，至少40 %純 度，至少60 %純度，至少80 %純度和至少90 %純度。
[0110] 術(shù)語"成熟多膚"意指在翻譯和任何翻譯后修飾(例如，N端加工、C端截短、糖基化、 憐酸化等)之后的最終形式的膚。在本發(fā)明上下文中，本文中相關(guān)的成熟凝乳酶多膚可視為 活性凝乳酶多膚序列一即沒有前部分和/或原部分序列。本文中相關(guān)的成熟多膚實(shí)例是例 如SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚，其為SEQ ID NO: 1的氨基酸第59位氨基酸至第381 位氨基酸氨基酸;或者是SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚，其為SEQ ID N0:2的第59 位氨基酸至第381位氨基酸。
[0111] 術(shù)語"親本"或"具有凝乳酶活性的親本多膚"意指對(duì)其進(jìn)行改變W產(chǎn)生本發(fā)明的 酶變體的多膚。親本可為天然產(chǎn)生(野生型）的多膚或其變體。
[0112] 術(shù)語"序列同一性"設(shè)及兩條氨基酸序列之間或兩條核巧酸序列之間的相關(guān)度。
[0113] 出于本發(fā)明的目的，兩條氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如在EMBOSS軟件 包化MBOSSil'he European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000, Trends Genet. 16 : 276-277 )(優(yōu)選3.0.0版本或更新版本）的Needle程序中執(zhí)行的 化edleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch, 1970, J.Mol.Biol. 48:443-453)來確定。所用 的可選參數(shù)是開放空位罰分10、空位延伸罰分0.5和邸L0SUM62(化0SUM62的EMBOSS版本)置 換矩陣。使用化edle標(biāo)記的"最長(zhǎng)同一性"的輸出（使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一 性并如下計(jì)算：
[0114] (相同殘基X 100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中空位的總數(shù)）。
[0115] 出于本發(fā)明的目的，兩條脫氧核巧酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟 件包（EMBOSS:1116 European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,同 上）（優(yōu)選3.0.0版本或更新版本）的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (化edleman及Wunsch, 1970,如上所述)來確定。所用的可選參數(shù)是開放空位罰分10、空位延 伸罰分0.5和抓NA即LL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)置換矩陣。使用化edle標(biāo)記的"最長(zhǎng)同 一性"的輸出（使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并且如下計(jì)算：
[0116] (相同的脫氧核巧酸x100 )/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中空位的總數(shù)）。
[0117] 術(shù)語"變體"意指在一個(gè)或更多個(gè)(數(shù)個(gè))位置處包含改變（即，替換、插入和/或缺 失）的具有凝乳酶活性的膚。替換意指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸被一個(gè)不同的氨基酸取代;缺 失意指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸的移除;插入意指鄰近占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸添加1至3個(gè)氨 基酸。
[011引氨基酸可W是天然或非天然氨基酸一例如，被例如D-丙氨酸的例如特定D-異構(gòu)體 (或D-形式)替換在理論上是可行的。
[0119] 術(shù)語"野生型"凝乳酶膚意指由天然存在的生物體(例如，自然界中可見的哺乳動(dòng) 物(例如，駱駝或牛））表達(dá)的凝乳酶。
[0120] 附圖
[0121] 圖1:本文中相關(guān)的不同凝乳酶序列的比對(duì)。所示的"牛凝乳酶B"是本文中SEQ ID N0:1的牛凝乳酶并且所示的"單峰駝"是本文中SEQ ID N0:2的駱駝凝乳酶。使用如本文中 所述的SEQ ID NO: 1之牛凝乳酶作為參照序列，可例如看出牛凝乳酶在第10位中具有"V"而 駱駝凝乳酶在相同的第10位中具有"A"。例如還可看出牛/大鼠在第352位中具有而駱 駝/雙峰駝(C._bactt;rianus)在相同的第352位中具有"E"。
[0122] 針對(duì)圖1中所示的凝乳酶序列一一綿羊與牛SEQ ID NO: 1具有94.5%序列同一性； 雙峰駝與牛569 10^:1具有83.2%序列同一性;單峰駝(569 10^:2的駱駝凝乳酶)與牛 SEQ ID NO: 1具有84%序列同一性;豬與牛沈Q ID NO: 1具有80.3%序列同一性，并且大鼠 與牛沈Q ID NO: 1具有71.9%序列同一性。
[0123] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一例如綿羊、雙峰駝、駱駝、豬或大鼠凝乳 酶的成熟多膚序列與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶一即SEQ ID NO: 1的第59至381位氨基酸)之成 熟多膚的本文中相關(guān)的序列同一性百分比相對(duì)類似于上文提及的序列同一性百分比。
[0124] 圖2:牛凝乳酶的3D結(jié)構(gòu)一一3D結(jié)構(gòu)是公眾可獲得的。作為一個(gè)實(shí)例，示出了其中 第296和294位氨基酸在牛凝乳酶中存在的位置。
[01巧]圖3:示出了多種凝乳酶變體的REMCAT和Proteol值的圖示。
[0126] 圖4:各個(gè)替換的效應(yīng)的PCA圖。所有的位置編號(hào)均比文本中所使用的編號(hào)小15。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0127]
[012引確定目的凝乳酶的氨基酸位置
[0129] 如上所討論的一作為用于確定本文中相關(guān)的目的凝乳酶多膚(例如，駱駝、綿羊、 牛等)的氨基酸位置的參照序列，本文中使用在本文中公開為SEQ ID NO: 1的公知牛凝乳酶 序列。
[0130] 出于本發(fā)明的目的，使用SEQ ID N0:1(牛凝乳酶）中公開的多膚來確定另一凝乳 酶多膚中的對(duì)應(yīng)氨基酸殘基。將另一凝乳酶多膚的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1中公開的多 膚進(jìn)行比對(duì)，并且基于該比對(duì)，如本文中工作實(shí)施例1中所述使用ClustalW算法來確定對(duì)應(yīng) 于SEQ ID NO: 1中所公開多膚中的任意氨基酸殘基的氨基酸位置編號(hào)。
[0131] 對(duì)另一凝乳酶多膚中對(duì)應(yīng)氨基酸殘基的鑒定可通過使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS:Hie Eluropean Molecular Biology Open Software Suite,I?ice等，2000,Trends Genet. 16 :276-277)(優(yōu)選3.0.0版本或更新版本）的Needle程序中執(zhí)行的Needleman- Wunsch算法（Needleman和Wunsch，1970，J.Mol. Biol. 48:443-453)來證實(shí)。
[0132] 基于上述公知的計(jì)算機(jī)程序一對(duì)于技術(shù)人員而言，確定本文中相關(guān)的目的凝乳酶 多膚(例如，駱駝、綿羊、牛等)的氨基酸位置是常規(guī)工作。
[0133] 在本文的圖1中示出了比對(duì)的一個(gè)實(shí)例。
[0134] 僅作為一個(gè)實(shí)例一在圖1中，可W例如看出本文中所使用的牛參照SEQ ID NO: 1在 第50位具有"G"而"單峰駝"（本文中SEQ ID N0:2)在該第50位中具有"A"。
[0。引變體的命名
[0136] 在描述本發(fā)明的變體中，為了便于參考，采用W下所述的命名法。采用公認(rèn)的 IUPAC單字母或=字母氨基酸縮寫。
[0137] 在下文該"命名"部分中所討論的特定變體可W不是本發(fā)明的本文中相關(guān)變體一 良P，該"命名"部分僅是為了描述本文中相關(guān)的所使用命名本身。
[0138] 替換:對(duì)于氨基酸替換，使用^下命名法:原始氨基酸，位置，替換的氨基酸。因此， 在第226位蘇氨酸在理論上被丙氨酸替換表示為叮hr226Ala"或叮226A"。多個(gè)突變通過加 號(hào)（叩'）隔開，例如"Gly205A巧+Ser41 IPhe"或"G205R+S411F"表示第205和411位甘氨酸(G) 和絲氨酸(S)分別被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)替換。例如表示為"226A"的替換指第226位親 本氨基酸(例如，T、Q、S或另一親本氨基酸)被丙氨酸替換。
[0139] 缺失:對(duì)于氨基酸缺失，使用^下命名法:原始氨基酸，位置，*。因此，第195位甘氨 酸的缺失表示為％lyl95*"或"G195*"。多個(gè)缺失是通過加號(hào)（"+")隔開，例如/'Glyl95*+ Ser411*"或"G195*+S411*"。
[0140] 插入:對(duì)于氨基酸插入，使用W下命名法:原始氨基酸，位置，原始氨基酸，插入的 氨基酸。因此，在第195位的甘氨酸之后插入賴氨酸表示為％lyl95GlyLys"或％195GK"。多 個(gè)氨基酸的插入表示為[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸# 2;等]。例如，在195位的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸表示為"Glyl95GlyLysAla"或 '它 195GKA"。
[0141] 在運(yùn)樣的情況下，插入的氨基酸殘基通過將小寫字母加到所插入氨基酸殘基之前 的氨基酸殘基的位置編號(hào)來編號(hào)。在上述實(shí)施例中，序列因此是： 「01421
[014引多個(gè)改變：包含多個(gè)改變的變體通過加號(hào)（"+")隔開，例如"Argl70Tyr + Glyl95Glu"或"R170Y+G195E"表示第170和195位精氨酸和甘氨酸分別被酪氨酸和谷氨酸替 換。
[0144] 不同替換：當(dāng)可在一個(gè)位置處引入不同的替換時(shí)，通過逗號(hào)將不同的替換隔開，例 如"Argl70Tyr，Glu"或"R170Y，E"，表示第170位精氨酸被酪氨酸或谷氨酸替換。因此， 叮 yr 167Gly，Ala+Argl 70Gly，Ala"或叮167G，A+R170G，心'表示 W 下變體：
[0145] 。17^67617+4'邑17061/'、'叮7^67617+4'邑17041曰"、'叮7^6741曰+4'邑17061/'和 叮yrl67Ala+Argl70Ala"。
[01W 用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法
[0147]如上文所討論的一如本領(lǐng)域中已知的，技術(shù)人員可基于其公知常識(shí)來常規(guī)地產(chǎn)生 并純化凝乳酶及凝乳酶變體。
[0148] 換言之，一旦技術(shù)人員擁有本文中相關(guān)的具有凝乳酶活性的目的親本多膚(例如， 來自牛、駱駝、綿羊、豬或大鼠），則對(duì)技術(shù)人員來說生產(chǎn)運(yùn)樣的目的親本凝乳酶的變體是常 規(guī)工作。
[0149] 生產(chǎn)并分離凝乳酶（變體或親本）的合適方法的一個(gè)實(shí)例可為如例如W002/ 36752A2(化r.化nsen)中所述通過公知的例如基于真菌重組表達(dá)/生產(chǎn)的技術(shù)來進(jìn)行。
[0150] 在具有凝乳酶活性的親本多膚中的一個(gè)或多個(gè)位置處產(chǎn)生改變對(duì)技術(shù)人員而言 也是常規(guī)工作，其中所述改變包含至少一個(gè)氨基酸位置中的置換、缺失或插入。
[0151] 如技術(shù)人員已知的一運(yùn)可例如通過基于所謂的定點(diǎn)誘變和重組表達(dá)/生產(chǎn)的技術(shù) 來進(jìn)行。
[0152] 確定本文中相關(guān)的親本多膚(例如，駱駝或牛野生型凝乳酶)和/或本文中相關(guān)的 變體是否具有凝乳酶活性對(duì)于技術(shù)人員而言也是常規(guī)工作。
[0153] 如本領(lǐng)域中已知的一凝乳酶活性可通過所謂的C/巧k來確定，而C/巧k通過將凝固 比活(C)除W蛋白水解活性(P)來確定。
[0154] 如本領(lǐng)域中已知的一較高的C/巧k通常意味著在例如乳酪生產(chǎn)期間由于非特異的 蛋白質(zhì)降解而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)損失降低，即乳酪產(chǎn)量得W提高，并且在熟化期間乳酪中苦味 的生成降低。
[0155] 在本文中的工作實(shí)施例4中描述了一種確定凝固比活(C)的合適方法，并且在本文 中的工作實(shí)施例5中描述了一種確定蛋白水解活性(P)的合適方法。
[0156] 優(yōu)選地，本文中所述的分離的凝乳酶多膚變體是運(yùn)樣的變體，其中所述變體具有 與包含本文中SEQ ID NO: 1之成熟多膚的牛凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/巧k的凝乳酶活 性。
[0157] 優(yōu)選地，本文中所述的分離的凝乳酶多膚變體是運(yùn)樣的變體，其中所述變體具有 與包含本文中SEQ ID NO:2之成熟多膚的駱駝凝乳酶的C作比相比提供更高C/巧k的凝乳酶 活性。
[0158] 更優(yōu)選地，本文中所述的分離的凝乳酶多膚變體是運(yùn)樣的變體，其中所述變體具 有：
[0159] -與包含本文中SEQ ID NO: 1之成熟多膚的牛凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/巧k 的凝乳酶活性；W及
[0160] -與包含本文中SEQ ID NO: 2之成熟多膚的駱駝凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/P 比的凝乳酶活性。
[0161] 如本文所討論的-作為用于確定本文中相關(guān)的目的凝乳酶多膚(例如駱駝、綿羊、 牛等)的氨基酸位置的參照序列，本文中使用在本文中公開為SEQ ID NO: 1的公知牛凝乳酶 序列。
[0162] 如上文所討論的一基于例如本文中所討論的計(jì)算機(jī)序列比對(duì)程序一對(duì)于技術(shù)人 員而言，確定本文中相關(guān)的目的凝乳酶多膚(例如，駱駝、綿羊、牛等）的本文中相關(guān)氨基酸 位置是常規(guī)工作。
[0163] 例如本文中第一方面的方法中的術(shù)語"所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶） 的成熟多膚具有至少65%序列同一性"可視為與用于制備其本文中相關(guān)變體的親本凝乳酶 多膚的基于序列的限制相關(guān)。
[0164] 換言之一認(rèn)為與成熟牛凝乳酶具有至少65%序列同一性的成熟親本凝乳酶多膚 (例如，綿羊或豬）與例如牛或駱駝凝乳酶具有足夠的結(jié)構(gòu)同一性W是本文中相關(guān)的一即， 在本發(fā)明上下文中，認(rèn)為與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少65%序列同一性 的成熟親本凝乳酶多膚(例如，來自例如綿羊或大鼠）在本文中可視為與例如?；蝰橊勀?酶具有足夠的結(jié)構(gòu)相關(guān)性W通過制備如本文中所述的任意氨基酸位置的變體來進(jìn)行改進(jìn)。
[0165] SEQ ID N0:2的駱駝凝乳酶多膚與SEQ ID N0:1的牛多膚（即，從第1位到第381位 的完整SEQ ID NO: 1，其包含前序列和原序列）具有84%序列同一性。
[0166] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一具有凝乳酶活性的本文中相關(guān)親本多 膚可W已經(jīng)是例如諸如對(duì)應(yīng)野生型凝乳酶的變體。
[0167] 例如，與SEQ ID N0:2之野生型駱駝凝乳酶多膚相比具有例如5至10個(gè)改變(例如， 替換）的駱駝凝乳酶變體仍會(huì)是如在例如本文中第一方面中所要求的與SEQ ID NO: 1(牛） 之成熟多膚具有至少65%序列同一性的親本多膚。
[0168] 換言之，本文中相關(guān)的分離的凝乳酶多膚變體可包含除例如本文中第一方面的位 置之外的其他位置中的改變(例如，替換）。
[0169] 關(guān)于本文圖1中所述的凝乳酶序列一綿羊與牛SEQ ID NO: 1具有94.5%序列同一 性;雙峰駝與牛SEQ ID NO: 1具有83.2%序列同一性;豬與牛SEQ ID NO: 1具有80.3%序列 同一性，并且大鼠與牛沈Q ID NO: 1具有71.9%序列同一性。
[0170] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一例如成熟綿羊、雙峰駝、駱駝、豬或大鼠 凝乳酶與SEQ ID NO: 1之成熟多膚(牛凝乳酶一即SEQ ID NO: 1的第59至381位氨基酸）的本 文中相關(guān)序列同一性百分比相對(duì)地類似于與上文提及的序列同一性百分比。
[0171] 優(yōu)選變體
[0172] 如上文所討論的一例如第一方面設(shè)及一種分離的凝乳酶多膚變體，其中改變包含 對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；223；224；238；246；256；261；K279V； L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、 ?、八、￥、1、1^、]?、尸、￥、胖；320;324;03259;326;331;336;346;361;367和379。
[0173] -個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案設(shè)及一種分離的凝乳酶多膚變體，其中改變包含對(duì)應(yīng)于例如本 文中第一方面的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入。
[0174] 可優(yōu)選地，至少一個(gè)改變是替換一即，本文中相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施方案設(shè)及運(yùn)樣的分 離的凝乳酶多膚變體，其中改變包含對(duì)應(yīng)于例如本文中第一方面的任意位置的至少一個(gè)氨 基酸位置中的替換。
[0175] 優(yōu)選地，一種分離的凝乳酶多膚變體，其中改變包含對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少 一個(gè)氨基酸位置中的替換：L70M;F75Y;K77T;Y79S;V90LD102N;I103V;K120Q;F124Y; H134Q；I154L；D156V；L163E；S212A；S222G；M223E；L224V；L238I；Q246E；V256I；V261A； K279V;L280I;F281A;R300D、E、S、T、N、Q;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;D325Q;Y326F; K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361レV367I;或K379P。
[0176] 優(yōu)選地，所述替換為其中該替換是92466;1(279￥;1?3009;1?125;￥326。或者1(3360、 E、S、T、N、Q，其中優(yōu)選的K336替換是K336Q。
[0177] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一如果親本凝乳酶多膚已在第156位具有 例如"r，則討論對(duì)該特定親本凝乳酶多膚進(jìn)行156V替換沒有意義。如本文的圖1中可見一 大鼠野生型凝乳酶在第156位具有"V"-156V替換可視為與圖1的特定大鼠凝乳酶多膚序列 在本文中不相關(guān)。
[0178] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一如果親本凝乳酶多膚在第156位不具有 例如"護(hù)，則討論對(duì)該特定親本凝乳酶多膚進(jìn)行D156V替換沒有意義。如本文的圖1中可見一 大鼠野生型凝乳酶在第156位具有"V"-因此D156V替換可視為與圖1的特定大鼠凝乳酶多 膚序列在本文中不相關(guān)。
[0179] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述替換為其中該替換是：
[0180] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0181] D117化L280I+G309D;
[0182] H1：MQ+D156V+G309D;
[0183] D156V+Q246化L280I;
[0184] D117 化 H1：MQ+L280I;
[0185] D156V+G309D巧326F;
[0186] D117化D156V+D325M;
[0187] L280I+D325M+Y326F；
[0188] D117化Q246化Y326F;
[0189] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0190] N310Q+N349Q+K279V；
[0191] R300Q+N307D；
[0192] N307D+G309D；
[0193] N307D+R312S；
[0194] R300Q+K336Q；
[01 巧]N307D+K336Q;
[0196] G309D+R312S；
[0197] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[019 引 N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0199] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0200] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S；
[0201] L280I+G309W+K77T+R324I；
[0202] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0203] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0204] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0205] L280I+G309W+L238I+T342S;
[0206] L280I+G309W+F75Y+Y79S ；
[0207] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0208] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
[0209] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0210] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0211] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0212] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0213] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0214] L280I+G309D 巧 79S+T342S+115化；
[0215] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0216] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0217] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[021 引 L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0219] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0220] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0221] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0222] L280I+G309W+S212A+V261A；
[0223] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0224] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[02巧]L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[02%] L280I+G309W+L238I+T342S;
[0227] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0228] L280I+G309D+L70M+T342S；
[02 巧]L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;
[0230] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0231 ] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0232] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0233] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0234] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[0235] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0236] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述替換為其中該替換是：
[0237] D117化L280I+G309D;
[0238] L280I+D325M+Y326F；
[0239] D117 化 Q246化 Y326F;
[0240] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0241] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0242] 具有凝乳酶活性的優(yōu)選親本多膚:
[0243] 優(yōu)選地，親本多膚具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少70%序列 同一性，更優(yōu)選地親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少75%序列同一 性。
[0244] 僅作為一個(gè)實(shí)例一本文中合適的相關(guān)親本多膚可W是例如牛凝乳酶A-如在本領(lǐng) 域中已知的，牛凝乳酶B與本文中SEQ ID N0:1的牛凝乳酶B相比可能只具有一個(gè)氨基酸差 異。
[0245] 如上文所討論的一在本文中的工作實(shí)施例中，使用SEQ ID NO: 1(牛）的多膚作為 親本多膚來制備變體一運(yùn)樣的變體本文中可稱為牛凝乳酶變體。
[0246] 因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中一親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚 至少90%序列同一性，更優(yōu)選地，親本多膚與SEQ ID N0:1(牛凝乳酶)的成熟多膚具有至少 95%序列同一性，并且甚至更優(yōu)選地親本多膚具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚 至少97%序列同一性?？蓛?yōu)選地，親本多膚是SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多膚。
[0247] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一具有凝乳酶活性的本文中相關(guān)親本多 膚可W已經(jīng)是例如諸如對(duì)應(yīng)野生型凝乳酶的變體。
[024引例如，與SEQ ID NO: 1之成熟野生型駱駝凝乳酶多膚相比具有例如5至10個(gè)改變 (例如，替換）的牛凝乳酶變體仍會(huì)是與SEQ ID NO: 1 (牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少95% 序列同一性的親本多膚。
[0249] SEQ ID NO: 1(牛）的成熟多膚的長(zhǎng)度為323個(gè)氨基酸一因此，與SEQ ID NO: 1的成 熟野生型牛凝乳酶多膚相比具有例如25個(gè)氨基酸替換的牛凝乳酶變體將不會(huì)是與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多膚具有至少95%序列同一性的親本多膚。
[0250] 換言之并且一般來說一本文中相關(guān)的分離的凝乳酶多膚變體可包含除例如本文 中第一方面的位置之外的其他位置的改變(例如，置換）。
[0251] 如上文所討論的一在本文中的工作實(shí)施例中，使用SEQ ID N0:2(駱駝）的多膚用 作親本多膚來制備變體一一運(yùn)樣的變體在本文中可稱為駱駝凝乳酶變體。
[0252] 因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中一親本多膚具有與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成 熟多膚具有至少90%序列同一性，更優(yōu)選地親本多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟 多膚具有至少95%序列同一性，并且甚至更優(yōu)選地親本多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶） 的成熟多膚具有至少97%序列同一性?？蓛?yōu)選地，親本多膚是SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶)的 成熟多膚。
[0253] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一與SEQ ID N0:2(駱駝）的成熟多膚具有 至少90%序列同一性的親本多膚仍在本文中第一方面的點(diǎn)（ii)中基于SEQ ID NO: 1(牛）的 序列同一性要求之內(nèi)一即，其將是與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少65%序 列同一性的親本多膚。
[0254] 分離的牛凝乳酶變體
[02W]如上文所討論的一在本文中的工作實(shí)施例中，使用SEQ ID NO: 1(牛）的多膚作為 親本多膚來制備變體一運(yùn)樣的變體在本文中可稱為牛凝乳酶變體。
[0256] 如上文所討論的一因此，第S方面設(shè)及一種分離的凝乳酶多膚變體：
[0257] (a):其在具有凝乳酶活性的親本多膚中的一個(gè)或更多個(gè)位置處包含改變，其中所 述改變包含對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246； 256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0258] (b):其中所述變體具有凝乳酶活性；
[0巧9] 并且其中：
[0260] (i):通過將所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多膚進(jìn)行比對(duì)來確定所述 親本多膚的氨基酸位置-即，使用SEQ ID NO: 1的多膚來確定所述親本多膚的對(duì)應(yīng)氨基酸序 列;且
[0%1] (ii):所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少90%的序列 同一性，所述成熟多膚為SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0262] (iii):所述分離的變體多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有小于 100%的序列同一性；
[0263] 并且前提是所述分離的凝乳酶多膚變體不是選自W下的特定變體：
[0264] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[02 化]R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0266] Y185F+R213Q+Q246E；
[0%7] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0268] G128D+L188I+Y326F；
[0269] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0270] G128化R312S+S313Y+Y326F;和
[0271] D117化V261A+R312S;
[0272] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D
[0273] Y79S+L224V+L311I和
[0274] R119S+L224V+T297S〇
[0275] 上述定義和優(yōu)選實(shí)施方案也適用于該方面。
[0276] 優(yōu)選地，本文中所述的分離的牛凝乳酶多膚變體是運(yùn)樣的變體，其中所述變體具 有與包含SEQ ID NO: 1之成熟多膚的牛凝乳酶的C作比相比提供更高C作比的凝乳酶活性。
[0277] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中一親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多膚具有至 少92%序列同一性，更優(yōu)選地親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少 95%序列同一性，并且甚至更優(yōu)選地親本多膚具有與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚 至少97%序列同一性?？蓛?yōu)選地，親本多膚是SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多膚。
[0278] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一分離的凝乳酶變體可包含除上文給出 氨基酸位置之外的氨基酸位置中的改變(例如替換）。
[0279] 例如，與SEQ ID NO: 1之野生型牛凝乳酶多膚相比具有例如5至10個(gè)改變(例如替 換）的牛凝乳酶變體仍會(huì)是與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少95%序列同一 性的親本多膚。
[0280] 可優(yōu)選地，分離的牛凝乳酶變體與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚相比包含 少于30個(gè)氨基酸改變(例如替換），或者可優(yōu)選地分離的牛凝乳酶變體與SEQ ID NO: 1(牛凝 乳酶）的成熟多膚相比包含少于20個(gè)氨基酸改變(例如替換），或者可優(yōu)選地分離的牛凝乳 酶變體與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多膚相比包含少于10個(gè)氨基酸改變(例如替換）， 或者可優(yōu)選地分離的牛凝乳酶變體與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚相比包含少于5 個(gè)氨基酸改變(例如替換）。
[0281] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一上述點(diǎn)（iii)中的術(shù)語"所述分離的變 體多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多膚具有小于100%序列同一性"設(shè)及本文中所述 的分離牛凝乳酶變體理所當(dāng)然不應(yīng)具有與SEQ ID NO: 1的公知野生型牛凝乳酶序列100% 相同的多膚序列。
[0282] -個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案設(shè)及運(yùn)樣的分離的牛凝乳酶多膚變體，其中改變包含對(duì)應(yīng)于第 =方面的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入。
[0283] 可優(yōu)選地，至少一個(gè)改變是替換一即，本文中相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施方案設(shè)及運(yùn)樣的分 離的凝乳酶多膚變體，其中改變包含對(duì)應(yīng)于第=方面的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中 的替換。
[0284] 優(yōu)選地，所述替換是 L70M;F75Y;K77T;Y79S;V90UD102N;I103V;N108D;D117N; F114Y;K120Q;F124Y;H134Q;I15A;D156V;L163E;S212A;M223E;L224V;L238I;Q246E; V256I;V261A;K279V;L280I;F281A;R300D、E、S、T、N、Q;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V; D325Q;Y326F;K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I36a;V367I; 或K379P。
[02 化]優(yōu)選地，所述替換是 Q246E;K279V;R300Q;R312S;Y326F或者K336D、E、S、T、N、Q，其 中一個(gè)優(yōu)選的K336替換是K336Q。
[0286] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述替換是：
[0287] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0288] D117 化 L280I+G309D;
[0289] H1：MQ+D156V+G309D;
[0290] D156V+Q246化L280I;
[0291] D117 化 H1：MQ+L280I;
[0292] D156V+G309D巧326F;
[0 巧 3] D117化D156V+D325M;
[0294] L280I+D325M+Y326F；
[0 巧 5] D117 化 Q246化 Y326F;
[0 巧 6] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0297] N310Q+N349Q+K279V；
[0298] R300Q+N307D；
[0299] N307D+G309D；
[0300] N307D+R312S；
[0301] R300Q+K336Q；
[0302] N307D+K336Q；
[0303] G309D+R312S；
[0304] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0305] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;
[0306] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0307] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S ；
[0308] L280I+G309W+K77T+R324I；
[0309] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0310] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0311] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0312] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0313] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0314] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0315] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
[0316] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0317] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0318] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0319] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0320] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0321] L280I+G309D 巧 79S+T342S+I15 化；
[0322] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0323] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0324] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[03 巧]L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[03%] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;
[0327] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0328] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0329] L280I+G309W+S212A+V261A；
[0330] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0331] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[0332] L280I+G309D+H239化R324I+D325Q;
[0333] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0334] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0335] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0336] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0337] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0338] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0339] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0340] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0：341] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[0342] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0343] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述替換為其中該替換是：
[0344] D117化L280I+G309D;
[0345] L280I+D325M+Y326F；
[0346] D117化Q246化Y326F;
[0347] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0348] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0349] 分離的駱駝凝乳酶變體:
[0350] 如上文所討論的一在本文中的工作實(shí)施例中，使用SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的 多膚作為親本多膚來制備變體一運(yùn)樣的變體在本文中可稱為駱駝凝乳酶變體。
[0351] 如上文所討論的一因此，第四方面設(shè)及運(yùn)樣的分離的凝乳酶多膚變體：
[0352] (a):其在具有凝乳酶活性的親本多膚中的一個(gè)或更多個(gè)位置處包含改變，其中所 述改變包含對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；223；224；238；246；256； 261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、 N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0353] (b):其中所述變體具有凝乳酶活性；
[0巧4] 并且其中：
[0355] (i):通過將所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多膚進(jìn)行比對(duì)來確定所述 親本多膚的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的多膚來確定所述親本多膚的對(duì)應(yīng)氨基酸 序列;且
[0356] (ii):所述親本多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚具有至少90%的序 列同一性，所述成熟多膚為SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0357] (iii):所述分離的變體多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚具有小于 100%的序列同一性；
[0358] 并且前提是所述分離的凝乳酶多膚變體不是選自W下的特定變體：
[0359] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0360] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0361] Y185F+R213Q+Q246E；
[0362] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0363] G128D+L188I+Y326F；
[0364] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[03 化]G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0366] D117化V261A+R312S;
[0367] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[0368] Y79S+L224V+L311I;和
[0369] R119S+L224V+T297S〇
[0370] 上述定義和優(yōu)選實(shí)施方案也適用于該方面。
[0371] 優(yōu)選地，本文中所述的分離的牛凝乳酶多膚變體是運(yùn)樣的變體，其中所述變體具 有與包含SEQ ID NO: 2之成熟多膚的駱駝凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活 性。
[0372] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中一親本多膚與SEQ ID NO: 2(駱駝凝乳酶)的成熟多膚具有 至少92%序列同一性，更優(yōu)選地親本多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚具有至 少95%序列同一性，并且甚至更優(yōu)選地親本多膚具有與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟 多膚至少97%序列同一性?？蓛?yōu)選地，親本多膚是SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶)的成熟多膚。
[0373] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一分離的凝乳酶變體可包含除上文給出 氨基酸位置之外的氨基酸位置中的改變(例如替換）。
[0374] 例如，與SEQ ID N0:2之野生型駱駝凝乳酶多膚相比具有例如5至10個(gè)改變(例如 替換）的駱駝凝乳酶變體仍會(huì)是與SEQ ID NO: 2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚具有至少95%序 列同一性的親本多膚。
[0375] 可優(yōu)選地，分離的駱駝凝乳酶變體與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚相比 包含少于30個(gè)氨基酸改變(例如替換），或者可優(yōu)選地分離的駱駝凝乳酶變體與SEQ ID NO: 2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚相比包含少于20個(gè)氨基酸改變(例如替換），或者可優(yōu)選地分離 的駱駝凝乳酶變體與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶)的成熟多膚相比包含少于10個(gè)氨基酸改變 (例如替換），或者可優(yōu)選地分離的駱駝凝乳酶變體與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多 膚相比包含少于5個(gè)氨基酸改變(例如替換）。
[0376] 如技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的一上述點(diǎn)（iii)中的術(shù)語"所述分離的變 體多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶)的成熟多膚具有小于100%序列同一性"設(shè)及本文中所 述的分離駱駝凝乳酶變體理所當(dāng)然不應(yīng)具有與SEQ ID N0:2的公知野生型駱駝凝乳酶序列 100%相同的多膚序列。
[0377] -個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案設(shè)及運(yùn)樣的分離的駱駝凝乳酶多膚變體，其中改變包含對(duì)應(yīng)于 第四方面的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入。
[0378] 可優(yōu)選地，至少一個(gè)改變是替換一即，本文中相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施方案設(shè)及運(yùn)樣的分 離的凝乳酶多膚變體，其中改變包含對(duì)應(yīng)于第四方面的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中 的替換。
[03 巧]優(yōu)選地，所述替換是 L70M;F75Y;K77T;Y79S;V90UD102N;I103V;K120Q;F124Y; 115化；L163E;S212A;M223E;L224V;L238I;Q24犯；V256I;V261A;K279V;R300D、E、S、T、N、Q; R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;Y326F;K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W; S331Y;Q346E; I36a; V367I;或K379P。
[0380]優(yōu)選地，所述替換是 Q246E;K279V;R300Q;R312S;Y326F或者K336D、E、S、T、N、Q，其 中一個(gè)優(yōu)選的K336替換是K336Q。
[0381 ]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述替換是：
[0382] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0383] D117 化 L280I+G309D;
[0384] H1：MQ+D156V+G309D;
[0385] D156V+Q246化 L280I;
[0386] D117 化 H1：MQ+L280I;
[0387] D156V+G309D巧326F;
[0388] D117化D156V+D325M;
[0389] L280I+D325M+Y326F；
[0390] D117 化 Q246化 Y326F;
[0391] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0392] N310Q+N349Q+K279V；
[0393] R300Q+N307D；
[0394] N307D+G309D；
[0395] N307D+R312S；
[0396] R300Q+K336Q；
[0397] N307D+K336Q；
[0398] G309D+R312S；
[0399] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0400] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0401 ] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0402] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S；
[0403] L280I+G309W+K77T+R324I；
[0404] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0405] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0406] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0407] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0408] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0409] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0410] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I ；
[0411] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0412] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0413] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0414] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0415] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0416] L280I+G309D 巧 79S+T342S+115化；
[0417] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0418] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0419] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[0420] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0421] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0422] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0423] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0424] L280I+G309W+S212A+V261A；
[04 巧]L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F;
[04%] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N;
[0427] L280I+G309D+H239化R324I+D325Q;
[0428] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0429] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0430] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0431] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0432] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0433] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0434] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0435] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0436] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[0437] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0438] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述替換為其中該替換是：
[0439] D117化L280I+G309D;
[0440] L280I+D325M+Y326F；
[0441 ] D117化Q246化Y326F;
[0442] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0443] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0444] 用于制備乳基產(chǎn)品的方法
[0445] 如上文所討論的-本文中所述的分離的凝乳酶多膚變體可根據(jù)領(lǐng)域而用于一例如 制備目的乳基產(chǎn)品（例如，如乳酪產(chǎn)品）。
[0446] 如上文所討論的一本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及一種用于制備食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品的 方法，其包括向食品或飼料成分添加有效量的如本文中所述的分離凝乳酶多膚變體并進(jìn)行 進(jìn)一步的制備步驟W獲得食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品。
[0447] 優(yōu)選地，所述食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品是一種乳基產(chǎn)品并且其中所述方法包括向乳添 加有效量的如本文中所述的分離凝乳酶多膚變體并進(jìn)行進(jìn)一步的制備步驟制W獲得乳基 產(chǎn)品。
[0448] 所述乳可W是例如大豆乳、綿羊乳、山羊乳、水牛乳、巧牛乳、美洲駝乳、駱駝乳或 牛乳。
[0449] 所述乳基產(chǎn)品可W是例如發(fā)酵乳產(chǎn)品、夸克或乳酪。
[04加]本文中的各個(gè)方面/實(shí)施方案一W權(quán)利要求的形式示出
[0451] 本文中所述的本發(fā)明的各個(gè)方面和優(yōu)選實(shí)施方案可所謂的權(quán)利要求的形式 示出/描述一如下進(jìn)行。
[0452] 1.-種用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其包括W下步驟：
[0453] (a):在具有凝乳酶活性的親本多膚中的一個(gè)或更多個(gè)位置處產(chǎn)生改變，其中所述 改變包含對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246； 256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;? 及
[0454] (b):產(chǎn)生并分離步驟(a)的經(jīng)改變多膚，從而獲得所述分離的凝乳酶多膚變體，其 中所述變體具有凝乳酶活性；
[0455] 并且其中：
[0456] (i):通過將所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多膚進(jìn)行比對(duì)來確定所述 親本多膚的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的所述多膚來確定所述親本多膚的對(duì)應(yīng)氨 基酸序列;且
[0457] (ii):所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少65%序列同 一性，所述成熟多膚為SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸；
[0458] 并且前提是所述分離的凝乳酶多膚變體不是選自W下的特定變體：
[0459] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0460] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0461] Y185F+R213Q+Q246E；
[0462] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0463] G128D+L188I+Y326F；
[0464] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[04 化]G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0466] D117化V261A+R312S;
[0467] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[0468] Y79S+L224V+L311I;和
[0469] R119S+L224V+T297S〇
[0470] 2.如權(quán)利要求1所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中所述分離的 凝乳酶多膚變體具有：
[0471] -與包含SEQ ID N0:1之成熟多膚的牛凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/P比的凝乳 酶活性;和
[0472] -與包含SEQ ID NO: 2之成熟多膚的駱駝凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/P比的凝 乳酶活性。
[0473] 3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中 所述改變包含對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求1所述的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或 插入。
[0474] 4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中 所述改變包含對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求1所述的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換。
[0475] 5.如權(quán)利要求4所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中所述替換是 L70M；F75Y；K77T；Y79S；V90L；D102N；I103V；N108D；D117N；F114Y；K120Q；F124Y；H134Q； I15A;D156V;L163E;S212A;S222G;M223E;L224V;L238I;Q246E;V256I;V261A;K279V; L280I;F281A;R300D、E、S、T、N、Q;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;D325Q;Y326F;K336D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361レV367I;或K379P。
[0476] 6.如權(quán)利要求5所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中所述替換是 Q24 犯；K279V; R300Q; R312S; Y326F 或者 K336D、E、S、T、N、Q。
[0477] 7.如權(quán)利要求6所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中所述替換是 K336Q。
[0478] 8.如權(quán)利要求4所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中所述替換是： [04 巧]H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0480] D117化L280I+G309D;
[0481 ] H1：MQ+D156V+G309D;
[0482] D156V+Q246化L280I;
[0483] D117 化 H1：MQ+L280I;
[0484] D156V+G309D巧326F;
[0485] D117化D156V+D325M;
[04化]L280I+D325M+Y326F;
[0487] D117化Q246化Y326F;
[0488] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0489] N310Q+N349Q+K279V；
[0490] R300Q+N307D；
[0491 ] N307D+G309D；
[0492] N307D+R312S；
[0493] R300Q+K336Q；
[0494] N307D+K336Q；
[04巧]G309D+R312S;
[0496] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0497] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0498] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0499] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S；
[0如0] L280I+G309W+K77T+R324I ；
[0如 1 ] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0502] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0503] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0504] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0 如 5] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0 如 6] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0 如 7] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
[0 如引 L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0509] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0510] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0511] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0512] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0513] L280I+G309D 巧 79S+T342S+I15 化；
[0514] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0515] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0516] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[0517] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[051 引 L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0519] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0520] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0521] L280I+G309W+S212A+V261A；
[0522] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0523] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[0524] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[05 巧]L280I+G309W+L238I+T342S;
[05%] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0527] L280I+G309D+L70M+T342S；
[052引 L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0529] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0530] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0531] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0532] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0533] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[0534] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0535] 9.如權(quán)利要求4所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中所述替換是：
[0536] D117 化 L280I+G309D;
[0537] L280I+D325M+Y326F；
[053引 D117 化 Q246化 Y326F;
[0539] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0540] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0541] 10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其 中所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多膚具有至少75%序列同一性。
[0542] 11.如權(quán)利要求10所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其中所述親本 多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多膚具有至少95%序列同一性。
[0543] 12.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的用于制備分離的凝乳酶多膚變體的方法，其 中所述親本多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚具有至少95%序列同一性，所述 成熟多膚為SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸。
[0544] 13.-種分離的凝乳酶多膚變體，其是通過權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法獲 得的。
[0545] 14.-種分離的凝乳酶多膚變體：
[0546] (a):其在具有凝乳酶活性的親本多膚中的一個(gè)或更多個(gè)位置處包含改變，其中所 述改變包含對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246； 256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0547] (b):其中所述變體具有凝乳酶活性；
[054引并且其中
[0549] (i):通過將所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多膚進(jìn)行比對(duì)來確定所述 親本多膚的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的所述多膚來確定所述親本多膚的對(duì)應(yīng)氨 基酸序列;且
[0550] (ii):所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有至少90%的序列 同一性，所述成熟多膚為SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0551] (iii):所述分離的變體多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多膚具有小于 100 %序列同一性；
[0552]并且前提是所述分離的凝乳酶多膚變體不是選自W下的特定變體：
[0 巧 3] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0 巧 4] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0 巧 5] Y185F+R213Q+Q246E；
[0 巧 6] V261A+V263I+G309W+L3111+Y326F；
[0巧7] G128D+L188I+Y326F；
[0 巧引 G128 化 R312S+S313Y+Y326F;
[0 巧 9] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0560] D117化V261A+R312S;
[0561 ] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D
[0562] Y79S+L224V+L311I和
[0563] R119S+L224V+T297S〇
[0564] 15.如權(quán)利要求14所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述分離的變體具有與包 含SEQ ID NO: 1之成熟多膚的牛凝乳酶的C作比相比提供更高C作比的凝乳酶活性。
[0565] 16.如權(quán)利要求14至15中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述親本多 膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的所述成熟多膚具有至少97%序列同一性。
[0566] 17.如權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述分離的 牛凝乳酶變體與SEQ ID N0:1(牛凝乳酶）的所述成熟多膚相比包含少于10個(gè)氨基酸改變 (例如替換）。
[0567] 18.如權(quán)利要求14至17中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述改變包 含對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求14所述的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入。
[0568] 19.如權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述改變包 含對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求14所述的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換。
[0569] 20.如權(quán)利要求19所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是L70M;F75Y; K77T；Y79S；V90L；D102N；I103V；N108D；D117N；F114Y；K120Q；F124Y；H134Q；I154L； D156VL163E;S212A;S222G;M223E;L224V;L238I;Q24 犯；V256I;V261A;K279V;L280I;F281A; R300D、E、S、T、N、Q;G309D、W;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;D325Q;Y326F;K336D、E、S、T、 N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361レV367I;或K379P。
[0570] 21.如權(quán)利要求20所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是Q246E;K279V; R300Q;R312S;Y326F 或者 K336D、E、S、T、N、Q。
[0571] 22.如權(quán)利要求21所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是K336Q。
[0572] 23.如權(quán)利要求19所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是
[0573] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0574] D117化L280I+G309D;
[化巧]H1：MQ+D156V+G309D;
[0576] D156V+Q246化L280I;
[0577] D117 化 H1：MQ+L280I;
[057引 D156V+G309D巧326F;
[0579] D117化D156V+D325M;
[0580] L280I+D325M+Y326F；
[0581] D117化Q246化Y326F;
[0582] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0583] N310Q+N349Q+K279V；
[化 84] R300Q+N307D；
[0585] N307D+G309D；
[05 化]N307D+R312S;
[化 87] R300Q+K336Q；
[058引 N307D+K336Q；
[0589] G309D+R312S；
[0590] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0591 ] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0592] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0593] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S ；
[0594] L280I+G309W+K77T+R324I；
[05M ] L2801+G309D+H134Q+V213F+F281A;
[0596] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0597] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[059引 L280I+G309W+L238I+T342S；
[0599] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0600] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0601 ] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I ；
[0602] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0603] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0604] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0605] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0606] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0607] L280I+G309D 巧 79S+T342S+115化；
[060引 L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0609] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0610] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[0611] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0612] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0613] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0614] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0615] L280I+G309W+S212A+V261A；
[0616] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0617] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[0618] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0619] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0620] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0621] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0622] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0623] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0624] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[06 巧]L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[06%] L280I+G309W+L238I+T342S;
[0627] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[062引 L280I+G309W+S212A+V261A0
[0629] 24.如權(quán)利要求19所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是：
[0630] D117化L280I+G309D;
[0631] L280I+D325M+Y326F；
[0632] D117化Q246化Y326F;
[0633] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0634] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0635] 25. -種分離的凝乳酶多膚變體：
[0636] (a):其在具有凝乳酶活性的親本多膚中一個(gè)或多個(gè)位置處包含改變，其中所述改 變包含對(duì)應(yīng)于W下任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置的替換、缺失或插入:70;75;77;79;90; 102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246；256；261； K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、 0、1]、6、口、4、￥、1、1^、]\1、尸、￥、胖；320;324;03259;326;331;336;346;361;367和379;且
[0637] (b):其中所述變體具有凝乳酶活性；
[063引并且其中：
[0639] (i):通過將所述親本多膚與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多膚進(jìn)行比對(duì)來確定所述 親本多膚的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的所述多膚來確定所述親本多膚的對(duì)應(yīng)氨 基酸序列;且
[0640] (ii):所述親本多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多膚具有至少90%序列 同一性，所述成熟多膚為SEQ ID N0:2的第59位氨基酸至到第381位氨基酸;且
[0641] (iii):所述分離的變體多膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶)的所述成熟多膚具有小 于100 %序列同一性；
[0642] 并且前提是所述分離的凝乳酶多膚變體不是選自W下的特定變體：
[0643] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0644] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0645] Y185F+R213Q+Q246E；
[0646] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0647] G128D+L188I+Y326F；
[0648] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0649] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0化0] D117 化 V261A+R312S;
[0化 1 ] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[0 化 2] Y79S+L224V+L311I;和 [0化3] R119S+L224V+T297S〇
[0654] 26.如權(quán)利要求25所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述分離的變體具有與包 含SEQ ID N0:2之成熟多膚的駱駝凝乳酶的C作比相比提供更高C作比的凝乳酶活性。
[0655] 27.如權(quán)利要求25至26中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述親本多 膚與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶)的所述成熟多膚具有至少97%序列同一性。
[0656] 28.如權(quán)利要求25至26中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述分離的 駱駝凝乳酶變體與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶)的所述成熟多膚相比包含少于10個(gè)氨基酸改 變(例如替換）。
[0657] 29.如權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述改變包 含對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求23所述的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換、缺失或插入。
[0658] 30.如權(quán)利要求25至29中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述改變包 含對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求23所述的任意位置的至少一個(gè)氨基酸位置中的替換。
[0659] 31.如權(quán)利要求30所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是L70M;F75Y; K77T;Y79S;V901^;D102N;I103V;N108D;D117N;F114Y;K120Q;F124Y;H134Q;I15A;D156V; L163E;S212A;S222G;M223E;L224V;D325Q;L238I;Q2^E;V256I;V261A;K279V;L280I; F281A;R300D、E、S、T、N、Q;G309D、W;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;Y326F;K336D、E、S、T、 N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361レV367I;或K379P。
[0660] 32.如權(quán)利要求31所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是Q246E;K279V; R300Q;R312S;Y326F 或者 K336D、E、S、T、N、Q。
[0661] 33.如權(quán)利要求32所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是K336Q。
[0662] 34.如權(quán)利要求30所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是：
[0663] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0664] D117化L280I+G309D;
[0665] H1：MQ+D156V+G309D;
[0666] D156V+Q246化 L280I;
[0667] D117 化 H1：MQ+L280I;
[066引 D156V+G309D巧326F;
[0669] D117化D156V+D325M;
[0670] L280I+D325M+Y326F；
[0671] D117化Q246化Y326F;
[0672] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0673] N310Q+N349Q+K279V；
[0674] R300Q+N307D；
[0675] N307D+G309D；
[0676] N307D+R312S；
[0677] R300Q+K336Q；
[067引 N307D+K336Q；
[0679] G309D+R312S；
[0680] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0681 ] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0682] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0683] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S ；
[0684] L280I+G309W+K77T+R324I；
[0685] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0686] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0687] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0688] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0689] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0690] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0691] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
[0692] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0693] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0694] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0695] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0696] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0697] L280I+G309D 巧 79S+T342S+115化；
[0698] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0699] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0700] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[0701] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0702] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0703] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0704] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0705] L280I+G309W+S212A+V261A;
[0706] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0707] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[0708] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0709] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0710] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0711] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0712] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0713] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0714] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0715] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0716] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0717] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;或
[0718] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0719] 35.如權(quán)利要求30所述的分離的凝乳酶多膚變體，其中所述替換是：
[0720] D117化L280I+G309D;
[0721] L280I+D325M+Y326F；
[0722] D117化Q246化Y326F;
[0723] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0724] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0725] 36.-種用于制備食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品的方法，其包括向食品或飼料成分添加有 效量的根據(jù)權(quán)利要求14至35中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多膚變體，W及進(jìn)行進(jìn)一步的制 備步驟W獲得所述食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品。
[0726] 37.如權(quán)利要求35所述的用于制備食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品的方法，其中所述產(chǎn)品是 乳基產(chǎn)品，并且其中所述方法包括向乳添加有效量的根據(jù)權(quán)利要求14至36中任一項(xiàng)所述的 分離的凝乳酶多膚變體W及進(jìn)行進(jìn)一步的制備步驟W獲得所述乳基產(chǎn)品。
[0727] 38.如權(quán)利要求37所述的用于制備乳基產(chǎn)品的方法，其中所述乳是大豆乳、綿羊 乳、山羊乳、水牛乳、巧牛乳、美洲駝乳、駱駝乳或牛乳。
[0728] 39.如權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)所述的用于制備乳基產(chǎn)品的方法，其中所述乳基 產(chǎn)品是發(fā)酵乳產(chǎn)品、夸克或乳酪。 實(shí)施例：
[0729] 實(shí)施例1:凝乳酶蛋白序列及變體序列的比對(duì)和編號(hào)
[0730] 使用如邸1(邸I，工具，多重序列比對(duì)，化USTALr，ht化：//www.ebi .ac.址/Tools/ msa/clustalw2/)所提供的并如Larkin MA,Blackshields G,B;rown NP,化enna R, McGettigan PA,McWilliam H,Valentin F,Wallace IM,film A,Lopez R,Thompson JD, G化son TJ,Higgins DG(2007).Bioinformatics 23(21) ,2947-2948中所述的Clus化IW算 法來比對(duì)凝乳酶蛋白序列。
[0731] 用于多重序列比對(duì)的ClustalW2設(shè)置為蛋白質(zhì)加權(quán)矩陣二化0SUM、空位開放= 10、 空位延伸=〇,〇5、空位間距=8、無末端空位、ITERATI0N=none、NUMIT邸=1、化USTERING = NJ。
[0732] 作為參照序列，使用牛凝乳酶B前凝乳酶原(Genbank登錄號(hào)P00794-在本文中公 開為SEQ ID N0:1)，其中N端甲硫氨酸的編號(hào)為UMRCL……）并且C端異亮氨酸(在蛋白質(zhì)序 列…LAKAI中）的編號(hào)為381。將變體針對(duì)牛B前凝乳酶原進(jìn)行比對(duì)并根據(jù)對(duì)應(yīng)的牛凝乳酶殘 基對(duì)殘基編號(hào)。
[07削實(shí)施例2:凝乳酶變體的設(shè)計(jì)
[0734] 使用不同的策略來設(shè)計(jì)凝乳酶變體。
[0735] 當(dāng)提及駱駝凝乳酶時(shí)，提及包含本文中SEQ ID N0:2的多膚的駱駝凝乳酶。
[0736] SEQ ID NO: 2的駱駝凝乳酶可視為用于制備其駱駝凝乳酶變體的具有凝乳酶活性 的本文中相關(guān)的親本多膚。
[0737] 當(dāng)提及牛凝乳酶時(shí)，提及包含本文中SEQ ID N0:1的多膚的牛凝乳酶。
[0738] SEQ ID NO: 1的牛凝乳酶可視為用于制備其牛凝乳酶變體的具有凝乳酶活性的本 文中相關(guān)的親本多膚。
[0739] 駱駝凝乳酶的變體基于比對(duì)一大組與牛凝乳酶B相比具有25%或更大同一性的公 知天冬氨酸蛋白酶序列來設(shè)計(jì)。
[0740] -般將變化引入在高變區(qū)中，而不改變保守區(qū)。在每個(gè)變體構(gòu)建體中引入多個(gè)改 變，確保每個(gè)單一突變均存在于多個(gè)變體構(gòu)建體中（對(duì)于結(jié)果討論一參見下文的實(shí)施例6)。
[0741] 牛凝乳酶的變體基于將牛和駱駝凝乳酶進(jìn)行比較來設(shè)計(jì)。將牛殘基例如改變?yōu)轳?駝的對(duì)應(yīng)殘基(對(duì)于結(jié)果討論一參見下文的實(shí)施例7)。
[07創(chuàng)實(shí)施例3:凝乳酶變體酶材料的制備
[0743] 所有的凝乳酶變體均作為合成基因合成并克隆到基本上對(duì)應(yīng)于pGAMpR-C(描述于 W002/36752A2中）的真菌表達(dá)載體中。
[0744] 將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方案來 純化質(zhì)粒DNA。
[0745] 將變體質(zhì)粒單獨(dú)地轉(zhuǎn)化到黑曲霉(Aspergi 1 lus niger)或構(gòu)巢曲霉(Aspergi 1 lus nidulans)菌株中，基本上如W002/36752A2中所述制備蛋白質(zhì)并使用標(biāo)準(zhǔn)的色譜技術(shù)進(jìn)行 純化。
[0746] 如本領(lǐng)域中已知的一技術(shù)人員可根據(jù)其公知常識(shí)來制備并純化凝乳酶及凝乳酶 變體一例如本文中所述的牛和駱駝凝乳酶變體。
[0747] 實(shí)施例4:凝乳酶比活的確定 [074引4.1凝固活性的確定
[0749] 使用REMCAT方法來確定凝乳活性，所述REMCAT方法是由International Daiir F'ederation開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)方法（IDF方法）。
[0750] 凝乳活性由標(biāo)準(zhǔn)乳底物發(fā)生可見絮凝所需的時(shí)間來確定，所述標(biāo)準(zhǔn)乳底物由低 熱、低脂的乳粉末與〇.5g/升的氯化巧溶液(抑>6.5)制備而成。將凝乳(rennet)樣品的凝 固時(shí)間與參照標(biāo)準(zhǔn)物的凝固時(shí)間進(jìn)行比較，所述參照標(biāo)準(zhǔn)物具有已知的凝乳活性并且根據(jù) IDF標(biāo)準(zhǔn)110B與該樣品具有相同的酶組成。在相同的化學(xué)和物理?xiàng)l件下測(cè)量樣品和參照標(biāo) 準(zhǔn)物。使用84mM乙酸pH 5.5緩沖液將變體樣品調(diào)節(jié)至約3這〇]/1111。在此之后，將20化1酶添 加至放置于水浴中的玻璃試管中的10ml經(jīng)預(yù)加熱乳，所述水浴能夠在恒定攬拌下維持32°C ±rc的恒溫。
[0751] 根據(jù)下式來計(jì)算相對(duì)于與樣品具有相同酶組成的標(biāo)準(zhǔn)物的凝乳總凝乳活性（強(qiáng) 度），單位為國(guó)際凝乳單位(IMCUVml:
[0巧 2]
[0753] S標(biāo)準(zhǔn)物:針對(duì)凝乳的國(guó)際參照標(biāo)準(zhǔn)物的凝乳活性。
[0754] T標(biāo)準(zhǔn)物:對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物稀釋物獲得的W秒計(jì)的凝固時(shí)間。
[0755] D樣品:樣品的稀釋因子
[0756] D標(biāo)準(zhǔn)物:標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋因子
[0757] T樣品:從添加酶到絮凝時(shí)間的對(duì)經(jīng)稀釋凝乳樣品獲得的W秒計(jì)的凝固時(shí)間
[075引對(duì)于實(shí)施例9中駱駝變體評(píng)價(jià)中的凝固活性確定，使用iilMCU方法來代替REMCAT方 法。與REMCAT相比，凝乳酶變體在iilMCU測(cè)定中的絮凝時(shí)間通過在96孔微量滴定板中在UV/ VIS讀板器中在800nm下的0D測(cè)量結(jié)果來確定。記錄每個(gè)板上的凝固強(qiáng)度已知的參照標(biāo)準(zhǔn)物 的不同稀釋物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品通過將酶在84mM乙酸、0.1%t;ritonX-100,pH5.5中稀釋 來制備。在32°C下的反應(yīng)通過向25uL酶樣品添加250UL標(biāo)準(zhǔn)乳底物來起始，所述標(biāo)準(zhǔn)乳底物 包含4%(w/w)低熱、低脂的乳粉末和7.5%(w/w)氯化巧(pH>6.5)。凝乳酶變體W國(guó)際凝乳 單位(IMCUVml計(jì)的凝乳活性基于相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品絮凝時(shí)間來確定。
[0759] 4.2總蛋白質(zhì)含量的確定
[0760] 總蛋白質(zhì)含量使用來自化ermo Scientific的Pierce BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒遵循 提供商的說明來確定。
[0761] 4.3凝固比活的計(jì)算
[0762] 凝固比活（IMCU/mg總蛋白質(zhì))通過將凝固活性（IMCU/ml)除W總蛋白質(zhì)含量(mg總 蛋白質(zhì)/ml)來確定。
[076引實(shí)施例5:蛋白水解活性的確定
[0764] 總蛋白水解活性使用巧光標(biāo)記的Bodipy-FL酪蛋白作為底物化nz化ek;Molecular Bioprobes，E6638)來測(cè)量。經(jīng)pH不靈敏性綠色巧光Bodipy-化重度標(biāo)記的酪蛋白衍生物導(dǎo) 致綴合物的巧光幾乎完全巧滅。蛋白酶催化的水解釋放巧光Bodipy-FL。該方法非常靈敏， 運(yùn)對(duì)本實(shí)驗(yàn)而言必不可少，因?yàn)镃HYMAX M在迄今已知的所有促凝劑中具有最低的總蛋白水 解活性。
[0765] 該測(cè)定在底物終濃度為0.04mg/ml的調(diào)節(jié)至期望抑的0.2M憐酸鹽緩沖液中進(jìn)行。 在將1份底物與1份酶(二者均在憐酸鹽緩沖液中制備）混合之前，將所有的酶變體相對(duì)于 50IMCU/ml歸一化(根據(jù)實(shí)施例4)。將底物和酶在96孔Nunc Fluoro微量滴定板中混合，密封 并在32°C下溫育60分鐘。在溫育之后，解除密封并在巧光計(jì)中記錄巧光。對(duì)于實(shí)施例9和10 中評(píng)價(jià)的變體，將1份底物與1份未經(jīng)歸一化的酶樣品在386孔Nunc Fluoro微量滴定板中混 合并在巧光計(jì)中于32°C下連續(xù)記錄巧光10小時(shí)。使用巧光增加的線性部分的斜率來確定總 蛋白水解活性。
[07W 實(shí)施例6:駱駝凝乳酶變體的評(píng)價(jià)
[0767] 對(duì)于所有的變體，根據(jù)實(shí)施例4在PH6.5下確定凝固比活（（IMCU/mg總蛋白質(zhì)），并 根據(jù)實(shí)施例5在抑6.5下確定蛋白水解活性。通過將凝固比活（IMCU/mg)除W蛋白水解活性 來確定所有變體在pH 6.5下的C作比。
[0768] 包括駱駝野生型基因作為參照。
[0769] 具有多個(gè)替換的變體
[0770] 可W推斷出，存在明顯的組合效應(yīng)，其中不同的替換對(duì)相應(yīng)的效應(yīng)具有影響。
[0771]
[0772] 可W得出結(jié)論，變體1、2、3、4、8、9、10和11具有較高的凝乳比活，其中變體2、8、10 和11具有最強(qiáng)的提高。
[0773] 可W得出結(jié)論，變體2和9具有降低的蛋白水解活性。
[0774] 可W得出結(jié)論，變體2、9和10具有增加的C作比。
[0775] 基于此，變體2是最優(yōu)選的變體，而變體9和10也顯示出優(yōu)選特征。
[077引單獨(dú)突變
[0777] 由于所有的變體都包含多個(gè)突變，因此使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和3D結(jié)構(gòu)分析來對(duì)經(jīng)分級(jí) 變體的數(shù)據(jù)進(jìn)行更詳細(xì)研究W確定具有正或負(fù)效應(yīng)的單獨(dú)氨基酸改變。
[0778] 單獨(dú)氨基酸改變的效應(yīng)可總結(jié)如下，但是在很大程度上取決于不同變體中的其他 氨基酸改變。基于運(yùn)些，優(yōu)選的突變是D117N、Q246E、G 309D、Y326F和L280I。
[0779]
[0780] 術(shù)語'V'指正氨基酸交換一即，"++"比'V'更正。
[0781 ]術(shù)語指負(fù)氨基酸交換一即，比更負(fù)。
[0782] 術(shù)語"正"指對(duì)變體的乳酪制備特性具有正效應(yīng)，即認(rèn)為提高的凝固活性（"C")和 增加的C/P比是正的（V'或"++")，而認(rèn)為增加的總蛋白水解活性（"P")是負(fù)特性或 。評(píng)定指示相對(duì)中和的效應(yīng)。
[0783] 表格右列的說明設(shè)及單獨(dú)突變位于駱駝凝乳酶的3D結(jié)構(gòu)中的位置。駱駝凝乳酶的 3D結(jié)構(gòu)是公眾可獲得的。
[0784] 結(jié)論;
[0785] 上述結(jié)果證明，駱駝凝乳酶中的W下單獨(dú)突變是優(yōu)選的（即，與駱駝野生型凝乳酶 相比C作比提高）：D117N、Q246E、G 309D、Y326F、L280I。
[0786] 上述結(jié)果證明，駱駝凝乳酶中的W下多個(gè)替換/突變是優(yōu)選的（即，與駱駝野生型 凝乳酶相比C作比提高）：
[0787] D117化L280I+G309D;
[0788] L280I+D325M+Y326F；
[0789] D117 化 Q246化 Y326F。
[0790] 實(shí)施例7:駱駝和牛凝乳酶變體的評(píng)價(jià)
[0791] 對(duì)于所有的變體，根據(jù)實(shí)施例4在抑6.5下確定凝固比活（IMCU/mg總蛋白質(zhì)），而如 實(shí)施例5中所述確定總體或非特異性蛋白水解活性。通過將凝固比活(IMCU/mg)除W蛋白水 解活性來確定所有變體在pH 6.5下的C作比。
[0792] 包括駱駝野生型基因作為參照。
[0793] 為了更好地比較，在不具有活性N-糖基化位點(diǎn)的背景下制備所有的變體，所謂的 化ly變體。運(yùn)些變體通過將兩個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)中的N改變成Q來制備。
[0794] 對(duì)于進(jìn)一步的結(jié)果，參見圖3。
[0巧引變體說明
[0796] 在變體J2中，牛非糖基化凝乳酶中的K279被V替代。
[0797] 在變體J32中，來自牛非糖基化凝乳酶的flap區(qū)被來自胃蛋白酶的flap區(qū)替代。
[0798] 在變體J72中，使用來自牛凝乳酶的負(fù)補(bǔ)下(negative patch)來替代駱駝凝乳酶 中的對(duì)應(yīng)區(qū)域。在變體J44中，駱駝凝乳酶中的R300被牛凝乳酶中的對(duì)應(yīng)氨基酸殘基Q替代。 該突變還見于變體J72中。
[0799]
[0800] 結(jié)論;
[0801] 牛凝乳酶第279位的賴氨酸的突變產(chǎn)生與牛凝乳酶相比顯示出相當(dāng)?shù)鞍姿饣钚?和增加的凝固比活的變體(變體J2)。因此，可推斷出第279位的鄉(xiāng)氨酸是優(yōu)選的氨基酸。
[0802] 駱駝凝乳酶的糖基化對(duì)乳酪制備特性的影響是可忽略的。將非糖基化駱駝變體與 野生型駱駝凝乳酶進(jìn)行比較指示無顯著變化。然而，在駱駝凝乳酶中引入來自牛凝乳酶的 負(fù)補(bǔ)下因素(變體J72)顯示出對(duì)凝固比活的正效應(yīng)，而總蛋白水解活性降低至約1/2,導(dǎo)致 C/P比加倍。引入來自該補(bǔ)下的單一突變R300Q(變體J44)顯示出對(duì)凝固活性類似的正效應(yīng)， 如對(duì)變體J72所見。推斷出，Q是第300位中的優(yōu)選氨基酸。
[0803] 預(yù)期，牛凝乳酶中的負(fù)補(bǔ)下區(qū)域?qū)⒚付ㄎ挥谡_切割位點(diǎn)之外具有重要作用， 由此提高酶特異性。預(yù)期，該作用是電荷最相關(guān)的，即為此增加負(fù)電荷的任何改變均將產(chǎn)生 增加的特異性。
[0804] 下文示出了牛和駱駝凝乳酶的帶負(fù)電區(qū)域的比對(duì)。僅標(biāo)示出帶電殘基。
[0805] RxxxxxxNxGxxRxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxK 駱駝
[0806] QxxxxxxDxDxxSxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxQ牛
[0807] 關(guān)于位置編號(hào)并且使用駱駝作為參照，編號(hào)從右開始：
[080引 R300
[0809] N307
[0810] G309
[0811] R312
[0812] K336
[081引實(shí)施例8:駱駝變體的評(píng)價(jià)
[0814]對(duì)多種不同的變體進(jìn)行分析，每種變體與野生型駱駝凝乳酶相比均具有多個(gè)替 換。
[081引對(duì)于所有的變體，根據(jù)實(shí)施例4在抑6.5下確定凝固比活（IMCU/mg總蛋白質(zhì)），而如 實(shí)施例5中所述通過測(cè)量每lOOIMCU的蛋白水解活性來確定非特異性蛋白水解活性。
[0816] 包括駱駝野生型基因作為參照。
[0817] 變體分析
[0818] 除對(duì)每種變體提及的變化之外，表格中所示的變體均具有與駱駝凝乳酶基因（由 駱駝wt表示)相同的氨基酸序列。
[0819]凝固活性從這〇]/111肖總蛋白質(zhì)提及。提高的凝固活性用一個(gè)或更多個(gè)V'符號(hào)來表 示。蛋白水解活性W每100IMCU的人造單位來表示。經(jīng)改進(jìn)的變體（即，蛋白水解活性降低的 變體)用一個(gè)或更多個(gè)V'符號(hào)來表示。V'符號(hào)越多表示改進(jìn)越強(qiáng)。在"總體"列中，V'符號(hào) 表示具有總體上得W改善的特性（即，低蛋白水解活性，高凝固活性)的變體。表1:駱駝凝乳 酶變體的分析
[0820]
[0821] 高凝固比活性對(duì)優(yōu)良的凝乳酶而言必不可少。鑒定到總共21種相對(duì)于駱駝凝乳酶 而言凝固比活提高的變體，并且包括在下表2中。
[0822] 表2:凝固活性增加的駱駝凝乳酶變體
[0823]
[0824] 降低的蛋白水解活性對(duì)優(yōu)良的凝乳酶而言是一種額外益處。鑒定到總共10種相對(duì) 于駱駝凝乳酶而言蛋白水解活性降低的變體(參見下表3)。
[0825] 表3:蛋白水解活性降低的駱駝凝乳酶變體
[08261
[0827] 基于總體分析，鑒定到5種在凝乳和蛋白水解活性兩方面的特性均得W改善的變 體。運(yùn)5種變體示于下表4中。
[0828] 表4:凝固活性增加且蛋白水解活性降低的駱駝凝乳酶變體
[0829]
[0830] 單獨(dú)突變的效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0831] 使用基于PCA的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來鑒定對(duì)蛋白水解活性、凝乳活性或二者具有正效應(yīng) 的單一突變。在下表中，總結(jié)了導(dǎo)致凝固活性增加、蛋白水解活性降低或者同時(shí)導(dǎo)致凝固活 性降低和蛋白水解活性降低的突變。PCA圖示于圖4中。
[0832] 表5:對(duì)凝固活性、蛋白水解活性或二者具有正效應(yīng)的單一突變
[0833]
[0834] 位置效應(yīng)
[0835] 預(yù)期，對(duì)凝固活性或總蛋白水解活性（即，特異性)具有作用的大多數(shù)突變位于催 化裂隙中或接近催化裂隙。底物進(jìn)入催化裂隙，并且在此還發(fā)生切割。
[0836] 令人吃驚的是，僅少數(shù)顯示對(duì)凝固活性和/特異性具有正效應(yīng)的替換位于該區(qū)域 中（例如L280I、L70M和巧5Y)。具有正效應(yīng)的很多突變見于該分子的其他部分上。
[0837] 導(dǎo)致凝固活性提高的替換
[0838] 導(dǎo)致凝固活性提高的大部分突變位于酶本體中并且可能已引起該分子中發(fā)生構(gòu) 象變化。F75Y替換位于裂隙的進(jìn)口處并且相當(dāng)細(xì)微，導(dǎo)致極性增加。
[0839] 表6:提供提高的凝固的替換
[0840]
[084。導(dǎo)致蛋白水解活性降低的替換
[0842]大部分突變位于分子的本體中。產(chǎn)生的構(gòu)象變化可能導(dǎo)致對(duì)底物的可及性增加。 兩個(gè)突變見于標(biāo)志催化裂隙的進(jìn)口的葉處。L163E替換增加負(fù)電荷。運(yùn)強(qiáng)化了來自實(shí)施例7 的結(jié)果，表明電荷在運(yùn)些位置中的重要性。
[0843]表6導(dǎo)致蛋白水解活性降低的突變
'[0845] 導(dǎo)致凝固提高且蛋白水解活性降低自哀 '
[0846] 導(dǎo)致凝乳能力總體提高的一些替換導(dǎo)致可能與底物識(shí)別相關(guān)的電荷變化。運(yùn)些包 括導(dǎo)致較高正電荷的H134Q，W及導(dǎo)致更負(fù)電荷的Q34犯替換。對(duì)凝固和特異性二者均具有 正效應(yīng)的其他替換最可能導(dǎo)致凝乳酶分子發(fā)生更具一般性的構(gòu)象變化。
[0847] 表7提供提高的凝固和降低的蛋白水解活性的突變 [084引 L畫」 買砸例9蹤駝雙體的巧價(jià)
[0化0] 變體表征
[0851] 再次產(chǎn)生在實(shí)施例7中針對(duì)其凝乳活性(C)和總蛋白水解活性(P)評(píng)價(jià)的駱駝凝乳 酶變體并針對(duì)其酪蛋白切割特異性C/P進(jìn)行評(píng)價(jià)(下表1)dC/P比是促凝劑在乳酪制備中的 效力的量度，即由一定體積的乳獲得的乳酪凝乳的產(chǎn)量。凝乳活性和總蛋白水解活性分別 如實(shí)施例4和5中所述來確定。然而，在該實(shí)施例中，不經(jīng)針對(duì)凝固活性歸一化來測(cè)量蛋白水 解活性。
[0852] 將駱駝凝乳酶作為參照進(jìn)行分析。將所有變體的C/P值表示為與野生型駱駝凝乳 酶的相對(duì)值。檢測(cè)酶樣品中的總蛋白質(zhì)濃度對(duì)C/P的影響，并相應(yīng)地根據(jù)運(yùn)一相關(guān)性校正c/ P值。
[0853]表1駱駝凝乳酶變體的分析
[0854]
[0化5] 在46種經(jīng)表征的變體中總共有30種顯示出相比較于野生型駱駝凝乳酶而言提高 的C/P(下表2)。對(duì)前S名變體33、6和20觀察到3倍W上的提高。
[0856] 表2C/P提高的駱駝凝乳酶變體
[0857]
[0咖]對(duì)C/P的位置和突變效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0859] 使用基于PCA的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來鑒定對(duì)駱駝凝乳酶的凝乳相對(duì)于總酪蛋白蛋白水解 (C/P)的特異性具有正效應(yīng)的單一突變。發(fā)現(xiàn)W下突變有益于高C作比：
[0860] H134Q、F281A、I103V、V256I、I154L、S222G、L224V、Q346E、S331Y、K77T、V367I、 G309D、V261A、D325Q、L280I、D117N、L163E、S212A。
[0化1 ] 實(shí)施例10:駱駝變體的評(píng)價(jià) [0化。變體表征
[0863]基于實(shí)施例7中確定的位置和突變效應(yīng)，產(chǎn)生另一組與野生型駱駝凝乳酶相比具 有多個(gè)替換的駱駝凝乳酶變體并如實(shí)施例9中所述針對(duì)其酪蛋白底物特異性(C/P)進(jìn)行評(píng) 價(jià)(下表1)。
[0864]表1駱駝凝乳酶變體的分析
[08 化]
[0866] 在29種變體中總共有26種顯示出與野生型駱駝凝乳酶相比提高的C/巧k。對(duì)最佳 變體觀察到2倍的提高(下表2)。
[0867] 表2C/P提高的駱駝凝乳酶變體
[086引
[0869] 對(duì)C/P的位置和突變效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0870] 使用基于PCA的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來鑒定對(duì)駱駝凝乳酶的凝乳相對(duì)于總酪蛋白蛋白水解 (C/P)的特異性具有正效應(yīng)的單一突變。發(fā)現(xiàn)W下突變有益于高C作比：
[0871] S331Y、Y79S、K77T、D117N、H134Q、N108D、G309W、L224V、D156V、L280I、M223E、 V367I、F114Y。
[087。實(shí)施例11:駱駝變體的評(píng)價(jià)
[0873] 對(duì)來自實(shí)施例9和10之變體的組合組進(jìn)行基于PCA的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并鑒定對(duì)駱駝凝 乳酶的凝乳相對(duì)于總酪蛋白蛋白水解(C/P)的特異性具有正效應(yīng)的單一突變。發(fā)現(xiàn)W下突 變有益于高C作比：
[0874] F281A、H134Q、I103V、S331Y、S222G、I154L、L280I、G309D、D117N、L224V、N108D、 L163E、G309W、K77T、Y79S。
[08巧]運(yùn)些突變與實(shí)施例9和10中確定的有益突變充分一致。
[087引對(duì)C/P的位置和突變效應(yīng)的結(jié)構(gòu)分析
[0877]如實(shí)施例8中可見，大部分的有益突變?nèi)赃h(yuǎn)離底物結(jié)合裂隙。僅L280I和F281A直接 位于裂隙中(Gilliland等1990)。1280指入C端葉的疏水核內(nèi)。因此，該突變可能導(dǎo)致結(jié)合裂 隙發(fā)生微細(xì)構(gòu)象改變，并且由此影響底物特異性。第281位是S2結(jié)合位點(diǎn)的一部分并且與酪 蛋白底物中的P2位置相互作用。該位置的突變非常可能影響酪蛋白結(jié)合，并且由此影響蛋 白水解dG309W和S33^突變位于已描述與K-酷蛋白相互作用^幫助底物結(jié)合在催化裂隙中 的區(qū)域中的C端葉的表面上(Gilliland等1990)。因此，這些突變可能對(duì)底物結(jié)合具有積極 影響。115化和0156￥^及1163目表示對(duì)N端葉的核的改變，可能導(dǎo)致酶發(fā)生微細(xì)的結(jié)構(gòu)重排 并影響催化活性dS222G和L224V突變將改變引入可能W其活化形式與蛋白質(zhì)N端相互作用 的目折疊中（Lan組olm Jensen等）。對(duì)酶活化狀態(tài)的潛在影響可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的酷蛋白底物特異 性。剩余的命中突變K77T、Y79S、I103V、N108D、D117N和H134Q位于N端葉的表面上，并且除 I103V之外均表示極性氨基酸的交換。酶表面上的這些改變最有可能影響與酷蛋白分子的 相互作用，導(dǎo)致有利于K-酷蛋白的特異性提高。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于制備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其包括以下步驟： (a) :在具有凝乳酶活性的親本多肽中的一個(gè)或更多個(gè)位置處產(chǎn)生改變，其中所述改變 包含在至少一個(gè)氨基酸位置的替換、缺失或插入，所述至少一個(gè)氨基酸位置對(duì)應(yīng)于以下任 意位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223;224;238;246;256 ;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、 Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W ;320;324;D325Q;326;331 ;336; 346; 361; 367和379;以及 (b) :生產(chǎn)并分離步驟(a)的經(jīng)改變多肽，從而獲得所述分離的凝乳酶多肽變體，其中所 述變體具有凝乳酶活性； 并且其中： (i) :所述親本多肽的氨基酸位置是通過所述親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的多 肽的比對(duì)來確定的一即SEQ ID NO: 1的多肽被用來確定所述親本多肽的對(duì)應(yīng)氨基酸序列； 且 (ii) :所述親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽具有至少65%序列同一性， 所述成熟多肽為SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸； 并且前提是所述分離的凝乳酶多肽變體不是選自由以下組成的組的特定變體： Q246E+G309D+S329P+D337E； R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T； Y185F+R213Q+Q246E； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F； G128D+L188I+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； D117N+V261A+R312S； D216S+L224V+V263I+F281V+G309D； Y79S+L224V+L311I;和 R119S+L224V+T297S。2. 如權(quán)利要求1所述的用于制備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述分離的凝乳 酶多肽變體具有： -與包含SEQ ID NO: 1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活 性;和 -與包含SEQ ID NO: 2的成熟多肽的駱駝凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶 活性。3. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于制備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述 改變包含在至少一個(gè)氨基酸位置的替換，并且其中所述替換是L70M;F75Y;K77T;Y79S; V90L；D102N；I103V；K120Q；F124Y；H134Q；I154L；L163E；S212A；M223E；L224V；L238I；Q246E； V256I;V261A;K279V;F281A;R300D、E、S、T、N、Q ;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;Y326F; K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361L ;V367I;SK379P。4. 如權(quán)利要求3所述的用于制備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述替換是 Q246E;K279V;R300Q;R312S;Y326F;K336D、E、S、T、N、QSK336Q。5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于制備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述 改變包含在至少一個(gè)氨基酸位置的替換，并且其中所述替換是： H134Q+Q246E+Y326F； D117N+L280I+G309D； H134Q+D156V+G309D； D156V+Q246E+L280I； D117N+H134Q+L280I； D156V+G309D+Y326F； D117N+D156V+D325M； L280I+D325M+Y326F； D117N+Q246E+Y326F； D117N+H134Q+D325M； N310Q+N349Q+K279V； R300Q+N307D； N307D+G309D； N307D+R312S； R300Q+K336Q； N307D+K336Q； G309D+R312S； R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q； L280I+G309D+L224V+E320T+T235S； L280I+G309W+K77T+R324I； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309W+F75Y+Y79S； L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E； L280I+G309D+L224V+I103V+L238I； L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L； L280I+G309D+I154L+V261A+V367I； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L； L280I+G309D+Y79S+I103V+F281A； L280I+G309D+V256I+V261A+K379P； L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+S212A+V26ΙΑ； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L;或 L2801+G309W+S212A+V261Α。6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用于制備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述 親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽具有至少95%序列同一性。7. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的用于制備分離的凝乳酶多肽變體的方法，其中所述 親本多肽與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多肽具有至少95%序列同一性，所述成熟多 肽是SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸。8. -種分離的凝乳酶多肽變體，其是通過權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法獲得的。9. 一種分離的凝乳酶多肽變體： (a) :其在具有凝乳酶活性的親本多肽中的一個(gè)或多個(gè)位置處包含改變，其中所述改變 包含在至少一個(gè)氨基酸位置的替換、缺失或插入，所述至少一個(gè)氨基酸位置對(duì)應(yīng)于以下任 意位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224;238;246;256;261 ;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W; G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320 ;324;D325Q;326;331;336 ;346; 361;367和379;且 (b) :其中所述變體具有凝乳酶活性； 并且其中： (i) :所述親本多肽的氨基酸位置是通過所述親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的多 肽的比對(duì)來確定的一即，SEQ ID NO: 1的多肽被用來確定所述親本多肽的對(duì)應(yīng)氨基酸序列； 且 (ii) :所述親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽具有至少90%序列同一性， 所述成熟多肽為SEQ ID NO :1的第59位氨基酸至到第381位氨基酸;且 (iii):所述分離的變體多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽具有小于100%序 列同一"性； 并且前提是所述分離的凝乳酶多肽變體不是選自由以下組成的組的特定變體： Q246E+G309D+S329P+D337E； R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T； Y185F+R213Q+Q246E； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F； G128D+L188I+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F;和 D117N+V261A+R312S； D216S+L224V+V263I+F281V+G309D Y79S+L224V+L311I 以及 R119S+L224V+T297S;并且 其中所述分離的變體具有與包含SEQ ID NO: 1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比相比提 供更高C/P比的凝乳酶活性。10. 如權(quán)利要求9所述的分離的凝乳酶多肽變體，其中所述親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛 凝乳酶)的成熟多肽具有至少97%序列同一性;并且 其中所述分離的牛凝乳酶變體與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽相比包含少于10 個(gè)氨基酸改變(例如替換）。11. 如權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多肽變體，其中所述改變包含在至 少一個(gè)氨基酸位置的替換并且其中所述替換是L70M ;F75Y;K77T;Y79S;V90L;D102N ;I103V; N108D；D117N；F114Y；K120Q；F124Y；H134Q；I154L；D156V；L163E；S212A；S222G；M223E； L224V;D325Q;L238I;Q246E;V256I ;V261A;K279V;L280I;F281A ;R300D、E、S、T、N、Q;G309D、 W;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;Y326F ;K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W; S331Y;Q346E;I361L;V367I;或K379P。12. 如權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多肽變體，其中所述改變包含在至 少一個(gè)氨基酸位置的替換并且其中所述替換是 H134Q+Q246E+Y326F； D117N+L280I+G309D； H134Q+D156V+G309D； D156V+Q246E+L280I； D117N+H134Q+L280I； D156V+G309D+Y326F； D117N+D156V+D325M； L280I+D325M+Y326F； D117N+Q246E+Y326F； D117N+H134Q+D325M； N310Q+N349Q+K279V； R300Q+N307D； N307D+G309D； N307D+R312S； R300Q+K336Q； N307D+K336Q； G309D+R312S； R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q； L280I+G309D+L224V+E320T+T235S； L280I+G309W+K77T+R324I； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309W+F75Y+Y79S； L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E； L280I+G309D+L224V+I103V+L238I； L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L； L280I+G309D+I154L+V261A+V367I； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L； L280I+G309D+Y79S+I103V+F281A； L280I+G309D+V256I+V261A+K379P； L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+S212A+V26ΙΑ； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L;或 L2801+G309W+S212A+V261A。13. -種分離的凝乳酶多肽變體： (a) :其在具有凝乳酶活性的親本多肽中的一個(gè)或多個(gè)位置處包含改變，其中所述改變 包含在至少一個(gè)氨基酸位置的替換、缺失或插入，所述至少一個(gè)氨基酸位置對(duì)應(yīng)于以下任 意位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223;224;238;246;256 ;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、 Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W ;320;324;D325Q;326;331 ;336; 346;361;367和379;且 (b) :其中所述變體具有凝乳酶活性； 并且其中： (i) :所述親本多肽的氨基酸位置是通過所述親本多肽與SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的多 肽的比對(duì)來確定的一即，SEQ ID NO: 1的多肽被用來確定所述親本多肽的對(duì)應(yīng)氨基酸序列； 且 (ii) :所述親本多肽與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的成熟多肽具有至少90%序列同一 性，所述成熟多肽為SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至到第381位氨基酸;且 (iii) :所述分離的變體多肽與SEQ ID N0:2(駱駝凝乳酶）的所述成熟多肽具有小于 100 %序列同一性； 并且前提是所述分離的凝乳酶多肽變體不是選自由以下組成的組的特定變體： Q246E+G309D+S329P+D337E； R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T； Y185F+R213Q+Q246E； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F； G128D+L188I+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； D117N+V261A+R312S； D216S+L224V+V263I+F281V+G309D； Y79S+L224V+L311I;和 R119S+L224V+T297S;并且 其中所述分離的變體具有與包含SEQ ID NO: 2的成熟多肽的駱駝凝乳酶的C/P比相比 提供更高C/P比的凝乳酶活性。14. 如權(quán)利要求13所述的分離的凝乳酶多肽變體，其中所述改變包含在至少一個(gè)氨基 酸位置的替換并且所述替換是： H134Q+Q246E+Y326F； D117N+L280I+G309D； H134Q+D156V+G309D； D156V+Q246E+L280I； D117N+H134Q+L280I； D156V+G309D+Y326F； D117N+D156V+D325M； L280I+D325M+Y326F； D117N+Q246E+Y326F； D117N+H134Q+D325M； N310Q+N349Q+K279V； R300Q+N307D； N307D+G309D； N307D+R312S； R300Q+K336Q； N307D+K336Q； G309D+R312S； R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或 N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q； L280I+G309D+L224V+E320T+T235S； L280I+G309W+K77T+R324I； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309W+F75Y+Y79S； L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E； L280I+G309D+L224V+I103V+L238I； L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L； L280I+G309D+I154L+V261A+V367I； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L； L280I+G309D+Y79S+I103V+F281A； L280I+G309D+V256I+V261A+K379P； L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+S212A+V26Ι?。? L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L;或 L2801+G309W+S212A+V261Α。15.-種用于制備食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品的方法，其包括向食品或飼料成分添加有效量 的根據(jù)權(quán)利要求8至14中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多肽變體，以及進(jìn)行進(jìn)一步的制備步 驟以獲得所述食品產(chǎn)品或飼料產(chǎn)品;并且 其中所述產(chǎn)品是乳基產(chǎn)品，且其中所述方法包括向乳添加有效量的根據(jù)權(quán)利要求8至 14中任一項(xiàng)所述的分離的凝乳酶多肽變體以及進(jìn)行進(jìn)一步的制備步驟以獲得所述乳基產(chǎn) 品；并且 其中所述乳是大豆乳、綿羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、美洲駝乳、駱駝乳或牛乳;并且 其中所述乳基產(chǎn)品是發(fā)酵乳產(chǎn)品、夸克或乳酪。
【文檔編號(hào)】A23L29/00GK106062187SQ201580009539
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年2月26日
【發(fā)明人】約翰尼斯·馬騰·范丹尼布林克, J·L·詹森, J·雅各布森, 馬丁·倫德, 伊本·杰普森, C·杰克爾
【申請(qǐng)人】科.漢森有限公司