糖基化黃胭脂酮酸和/或胭脂酮酸的糖基轉移酶的制作方法
【專利摘要】一種分離的糖基轉移酶(GT)多肽，其能夠：(Ⅰ)綴合葡萄糖到黃胭脂酮酸(FK)；和/或(II)綴合葡萄糖到胭脂酮酸(KA)以及使用該GT來例如制備胭脂紅酸。
【專利說明】
糖基化黃朋脂酬酸和/或朋脂酬酸的糖基轉移酶
技術領域
[0001 ]本發(fā)明設及一種分離的糖基轉移酶(GT)多膚，其能夠：（I):綴合葡萄糖到黃姻脂 酬酸（f lavokermesic acid) (FK);和/或（II):綴合葡萄糖到姻脂酬酸化ermesic acid) 化A)和使用該GT來制備例如姻脂紅酸。
【背景技術】
[0002] 天然色素姻脂紅酸是食品、藥品、化妝品和紡織品的最常用的著色劑之一。
[0003] 姻脂紅酸是一種著色劑，其可W從姻脂蟲（Dactylopius coccus costa)(別名 Coccus cacti L.)的雌性昆蟲體提取。運些昆蟲生活在例如墨西哥，中美洲和南美洲及加 那利群島的沙漠地區(qū)種植的Nopalea coccinellifera，0puntia fidus indica和仙人掌科 的其他植物上。根據(jù)抑，該著色劑可W是從澄色跨越紅色到紫色的范圍中的顏色，且通常被 稱為姻脂蟲紅或姻脂色。姻脂紅著色劑廣泛用于食品和飲料。
[0004] 如本領域公知的，Por地yrophora polonica也產生姻脂紅酸并且在例如波蘭用于 生產姻脂紅酸。
[0005] 關于目前的工業(yè)相關生產，通過用水或醇從昆蟲的干體萃取來收獲姻脂紅酸。
[0006] 所述昆蟲（姻脂蟲）在仙人掌上培養(yǎng)，因此，供應可能相對昂貴且受到不期望的變 化和價格波動。
[0007] 為了嘗試解決不期望的變化和價格波動的問題-US542442UEuropean Colour, 1995年出版)描述了通過設及不同的中間體的合成路線化學合成姻脂紅酸。
[000引如例如W02006/056585A1 (化r.化nsen A/S)所討論的-在從昆蟲水基提取姻脂紅 酸期間，一些的昆蟲蛋白也從昆蟲釋放且將包含在有色提取物中，而且已經(jīng)報道了姻脂蟲 蛋白質可能產生一些過敏相關的問題。在W02006/056585A1中，描述了一種從昆蟲提取液減 少昆蟲蛋白的量的特殊工藝-然而，W02006/056585A1的最終產生的有色組合物/產物仍然 包括一定量的姻脂蟲昆蟲蛋白質。
[0009] 姻脂紅酸的結構示于圖1-可W看出運是一個所謂的C-葡萄糖巧（即，其中葡萄糖 通過碳-碳鍵被接合/綴合到配基(aglucon)。
[0010] 根據(jù)本領域-術語"糖巧配基(aglycon)"表示糖巧配基的相應糖基化形式的非碳 水化合物部分。當糖是葡萄糖時，糖巧配基可被稱為配基。
[0011] 根據(jù)本領域-術語"糖巧(glycoside)"是指運樣的化合物，其通過水解產生糖和非 糖(糖巧配基)殘基，例如葡萄糖巧可產生葡萄糖，半乳糖巧可產生半乳糖。如圖1所示-C-葡 萄糖巧姻脂紅酸的水解產生葡萄糖和配基姻脂酬酸化A)。
[0012] 目前尚未詳細描述參與姻脂紅產生的體內昆蟲（姻脂蟲）生物合成途徑-因此，根 據(jù)現(xiàn)有技術，本領域技術人員不知道在姻脂紅酸的體內姻脂蟲生物合成生產過程中何種化 合物是配基。
[0013] 姻脂蟲的分析表明，與姻脂紅酸有關的廣泛化合物存在于姻脂蟲提取物中并且許 多運些化合物原則上均可W在姻脂紅酸的體內姻脂蟲生物合成生產過程中葡糖化 (glucosylate)。
[0014] 例如，Sl:athopoulou等的文章（Analytics Qiimica Acta 804(2013)264-272)描 述了在姻脂蟲的提取物中存在的六種新的蔥釀并且運六種新的蔥釀中的任一種(參見例如 本文的圖1)原則上均可W是在姻脂紅酸的體內姻脂蟲生物合成生產過程中葡糖化的分子。
[0015] 此外，如本領域所公知的，在葡萄糖巧最終產品的體內生物合成生產過程中形成 的主要葡糖化化合物可W是不穩(wěn)定的中間體化合物，其將不能從姻脂蟲分離的提取物中鑒 定，如例如Stathopou 1OU等人的上述討論的文章所分析的。
[0016] 根據(jù)現(xiàn)有技術，可W推測，姻脂紅酸的體內姻脂蟲生物合成生產過程中的相關主 要葡糖化化合物可W是例如具有與例如黃姻脂酬酸大約相同的碳原子數(shù)的不穩(wěn)定中間體 聚酬化合物。
[0017] 根據(jù)本領域-術語"糖基轉移酶"（GT)表示能夠從活化的核巧酸糖轉移糖到糖巧配 基W形成糖巧的糖基轉移酶酶。
[0018] 現(xiàn)有技術未明確地描述本文相關的參與姻脂紅酸的體內昆蟲（姻脂蟲)生物合成 途徑的糖基轉移酶的DNA或氨基酸序列。
[0019] 如本領域中已知的，對于累積低分子量化學物質的昆蟲，相關生物合成途徑基因 有時不存在于昆蟲基因組中。
[0020] 例如，一些昆蟲從它們食用的植物攝取糖巧-參見例如Zagrobelny等人的文章 (Cyanogenic glucosides and plant-insect interactions；Phytochemistry.2004Feb； 65(3) :293-306)或者Geuder等人的文章（Journal of 化emical Ecology，Vol.23,No.5， 1997)。此外，有時也在昆蟲的微生物活體中發(fā)現(xiàn)相關生物合成途徑基因，參見例如Genta等 人白勺文章（Potential role for gut microbiota in cell wall digestion and glucoside detoxification in Tenebrio molitor larvae, Journal of Insect Physiolog巧2(2006)593-601)。
[0021] 姻脂蟲昆蟲食用仙人掌類植物，可能是姻脂蟲昆蟲(類似其他昆蟲)從它們食用的 仙人掌攝取相關糖巧。
[0022] 因此，基于現(xiàn)有技術，本領域技術人員可能不知道姻脂蟲的基因組實際上是否包 括運樣的基因，所述基因編碼參與產生姻脂紅酸的體內生物合成途徑的糖基轉移酶。
[0023] W02004/111254Al^oalis A/S)描述了通過在微生物細胞內使用葡糖基轉移酶體 內綴合葡萄糖到香蘭素配基而在例如真核細胞酵母細胞和/或原核大腸桿菌細胞中體內產 生香蘭素的葡糖化形式。從植物香草豆芙獲得天然香蘭素。因此，在現(xiàn)有技術中，成功的體 內生產已在具有植物糖巧化合物(諸如例如香蘭素葡萄糖巧)的微生物細胞中被描述。

【發(fā)明內容】

[0024] 本發(fā)明所要解決的問題設及提供可能導致姻脂紅酸的生物合成途徑中參與的糖 基轉移酶(GT)和使用運種糖基轉移酶制備例如姻脂紅酸。
[0025] 正如本文的工作實施例所討論的-本發(fā)明測序姻脂蟲和微生物共生體的整個基因 組和轉錄組（即包括mRNA的RNA分子組）。
[0026] 分析從基因組和轉錄組得到的經(jīng)鑒定的寡核巧酸序列與公知的C-糖基轉移酶序 列的相似度，結果為陰性?；蚪M/轉錄組的經(jīng)鑒定的基因序列都未顯示與公知的C-糖基轉 移酶序列的顯著的相似度。
[0027] 如W上所討論的-基于現(xiàn)有技術，本領域技術人員可能不知道姻脂蟲的基因組實 際上是否包括運樣的基因，所述基因編碼參與產生姻脂紅酸的體內生物合成途徑的糖基轉 移酶。然而，本發(fā)明人繼續(xù)對此進行研究。
[0028] 如本文的工作實施例所討論的-本發(fā)明人鑒定具有相關的GT活性的姻脂蟲提取物 (包括存在于姻脂蟲中的內共生體的提取物)并且通過相關純化和檢測步驟的組合，本發(fā)明 人終于能獲得較純的部分/組分，由此可能獲得推定的GT酶候選物的幾個部分氨基酸序列。
[0029] 比較運些酶候選物的部分氨基酸序列與轉錄組的確定的基因序列，并且在進一步 詳細的工作之后，確定了編碼糖基轉移酶酶序列的序列-編碼運種分離/克隆的新穎糖基轉 移酶的多核巧酸序列WSEQ ID N0:1示出且多膚氨基酸序列WSEQ ID N0:2示出。
[0030] 可W將沈Q ID ^:2的糖基轉移酶酶稱為''0加612"。
[0031] 我們相信，所描述的分離/克隆的糖基轉移酶是第一個描述的昆蟲來源的糖基轉 移酶。如上所述，分析了姻脂蟲轉錄組的確定的基因序列與相關公眾已知的糖基轉移酶序 列的相似度，結果為陰性。
[0032] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該公知的現(xiàn)有技術糖基轉移酶序列與顯示為SEQ ID N0:2的新穎 糖基轉移酶多膚序列具有低于45%的同一性。
[0033] 如在本文的工作實施例所討論的-本發(fā)明人測試了分離/克隆的新穎糖基轉移酶 的活性，并發(fā)現(xiàn)它能夠綴合葡萄糖到糖巧配基黃姻脂酬酸(FK)和姻脂酬酸化A)-見圖1。
[0034] 葡糖化產物的分析表明，在可能形成的許多潛在的0-和C-葡萄糖巧產物當中，兩 種底物的每一種均僅形成單種糖巧產物。分析結果表明，當使用UDP-葡萄糖作為糖供體底 物時，每一種產物都是通過GT在蔥釀結構的7位上GTC-葡糖化，更精確地是7-a-D-化喃葡糖 基-9，10-二氨-3，6，8-S徑基-1-甲基-9，10-二氧雜蔥甲酸(Dell-見圖1)和7-a-D-化喃葡 糖基-9,10-二氨-3,5,6,8四徑基-1-甲基-9,10-二氧雜蔥甲酸(姻脂紅酸-見圖1)。
[0035] Gutmann等人的文章（Pure A卵1.化em，2013-07-09)描述了，即使一些C-糖巧已經(jīng) 從天然來源分離，然而僅在極少數(shù)情況下已知負責它們的生物合成的酶，并且用于C-糖巧 生產的生物催化方法尚未建立。
[0036] Baig等人的文章（Angew Chem Int Ed Engl.2006NOV 27;45(46) :7842-6)描述了 一種稱為化dGT2的糖基轉移酶(GT)并解釋說它能夠綴合糖到本文可W認為較類似黃姻脂 酬酸(FK)和姻脂酬酸化A)的一些糖巧配基。
[0037] 因此，可W說，初步認為化dGT2可能是能夠綴合糖到黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬 酸化A)的GT的合格猜測。
[0038] 如本文的工作實施例所討論的-本發(fā)明人克隆了化dGT2并測試其對黃姻脂酬酸 (FK)和/或姻脂酬酸化A)的GT活性并發(fā)現(xiàn)化dGT2能夠使用UDP-葡萄糖作為糖供體但化dGT2 沒有葡糖化任何所測試的假定的糖巧配基-即，關于運些糖巧配基，未識別到GT活性。
[0039] 該化dGT2具有與本文公開的沈Q ID N0:2的15-20%的氨基酸同一性。
[0040] 基于公知的GT序列和未公知的GT序列兩者-本發(fā)明人進行了不同的詳細序列比對 研究。
[0041 ] 基于運些序列比對研究-我們認為SEQ ID NO:2的氨基酸20至約468包含催化結構 域的主要部分。
[0042] 基于運些序列比對研究-我們認為從SEQ ID NO: 2的大約291至約383的氨基酸包 括所謂的活化的核巧酸糖結合位點。
[0043] 基于運些序列比對研究-我們認為從SEQ ID N0:2的約1至約20的氨基酸包括所謂 的信號膚，并且我們認為該信號膚可W在不顯著影響本文的酶的相關GT活性的情況下去 除。
[0044] 此外，我們認為，所述活化的核巧酸糖結合位點可W由類似的（例如現(xiàn)有技術已知 的）GT活化的核巧酸糖結合位點序列替代-諸如例如，由Radominska-Pandya A,Bratton SM'Redinbo MR'Miley MJ.Drug Metab Rev.2010Feb;42(l):133-44)和Plant Physiology，November 2008，Vol. 148，pp. 1295-1308描述的活化的核巧酸糖結合位點。
[0045] 因此，本發(fā)明的第一個方面設及分離的糖基轉移酶多膚，其能夠：
[0046] (I)綴合葡萄糖到黃姻脂酬酸(FK);和/或
[0047] (II)綴合葡萄糖到姻脂酬酸化A);
[004引且其中所述糖基轉移酶多膚是選自由W下組成的組中的至少一種多膚：
[0049] (a)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少70%同一性的氨基酸序列的多 膚；
[0化0] (b)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少70%同一性的氨基酸序列的多 膚；
[0化1] (C)由在至少中等嚴格條件下與（i)SEQ ID N0:1的核巧酸1至1548或的互 補鏈雜交的多核巧酸編碼的多膚;和
[0052] (d)為SEQ ID N0:2的氨基酸1至515的片段，其具有在（I)和/或（II)中指定的糖基 轉移酶活性。
[0053] 如本領域技術人員在本發(fā)明上下文中理解的-第一方面的術語"糖基轉移酶多膚， 其能夠"設及的是所述糖基轉移酶應該能夠實現(xiàn)糖基轉移酶（I)和/或（II)活性-但它也可 能或不能實現(xiàn)其它糖基轉移酶活性。
[0054] 如本領域技術人員在本發(fā)明上下文中理解的-本文的公開內容所描述的新穎糖基 轉移酶序列是識別除了姻脂蟲之外的例如其他昆蟲中的類似糖基轉移酶的一種重要工具 并且不限于理論-我們認為，與SEQ ID N0:2具有至少70%同一性的序列將是本文另一相關 糖基轉移酶的合理的良好侯選物。
[0055] 本發(fā)明的第二方面設及一種分離的多核巧酸，其包含編碼第一方面和/或其本文 相關的實施方案的多膚的核巧酸序列。
[0056] 本發(fā)明的第=方面設及包含第二方面和/或其本文相關的實施方案的分離的多核 巧酸的核酸構建體，其可操作地連接到引導多膚在表達宿主中產生的一種或多種控制序 列。
[0057] 本發(fā)明的第四方面設及一種重組表達載體，其包括第=方面和/或其本文相關的 實施方案的核酸構建體。
[005引本發(fā)明的第五個方面設及一種重組宿主細胞，其包含第=方面和/或其本文相關 的實施方案的核酸構建體。
[0059]如W上所討論的-根據(jù)現(xiàn)有技術，本領域技術人員不知道何種化合物是姻脂蟲體 內生物合成生產姻脂紅酸過程中的主要糖基化化合物。
[0060] 已經(jīng)顯示，姻脂蟲包含能夠c-糖基化黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)的GT。
[0061] 顯而易見的是，運個重要的知識足W實現(xiàn)例如生產姻脂紅酸的目的而不需要從昆 蟲提取，從而能夠制備基本上不含有例如不需要的姻脂蟲昆蟲蛋白質的姻脂紅酸有色組合 物/產品。
[0062] 因為本領域技術人員不知道何種化合物在體內姻脂蟲生物合成生產姻脂紅酸的 過程中被糖基化，實際上本領域技術人員不知道在自然界中是否實際存在能夠C-糖基化黃 姻脂酬酸糖巧配基和/或姻脂酬酸糖巧配基的糖基轉移酶。
[0063] 我們認為，本文公開的新的糖基轉移酶代表首次分離的能夠糖基化黃姻脂酬酸糖 巧配基和/或姻脂酬酸的糖基轉移酶。
[0064] 因此，基于本文的技術公開內容-我們認為本領域技術人員將能夠識別能夠糖基 化黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)的其他合適的糖基轉移酶。
[0065] 本領域技術人員應當理解，試圖確定有機體/植物是否包括相關的糖基轉移酶的 一種方法可W是使相關的糖巧配基（即FK和/或KA)與有機體/植物(體內和/或體外)接觸并 測定所述有機體/植物是否產生相關的FK和/或KA糖巧。
[0066] 如本文所理解的，如果所述有機體/植物產生相關的FK和/或KA糖巧，則所述有機 體/植物將包括相關的糖基轉移酶-即能夠使黃姻脂酬酸糖基化W產生黃姻脂酬酸糖巧； 和/或能夠使姻脂酬酸糖基化W產生姻脂酬酸糖巧的糖基轉移酶。
[0067] 如下面所討論的-根據(jù)上面的策略，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可W在蘆苔(Aloe)植物，十二卷 化awodhia)植物，高梁或稻植物中識別相關糖基轉移酶。
[0068] 因此，本發(fā)明的第六個方面設及一種用于產生黃姻脂酬酸(FK)糖巧和/或姻脂酬 酸化A)糖巧的方法，其中所述方法包括W下步驟：
[0069] (A):在體外或體內在包含編碼糖基轉移酶的糖基轉移酶基因的重組宿主細胞中 使：
[0070] (al):黃姻脂酬酸(FK)與能夠糖基化黃姻脂酬酸的糖基轉移酶在產生黃姻脂酬酸 糖巧的合適條件下接觸;和/或
[0071] (a2):姻脂酬酸化A)與能夠糖基化姻脂酬酸的糖基轉移酶在產生姻脂酬酸糖巧的 合適條件下接觸。
[0072] 術語"重組宿主細胞"在本文中應根據(jù)本領域來理解。如本領域中公知的，重組多 核巧酸(例如DNA)分子是通過基因重組的實驗室方法(例如分子克隆)將來自多個源的遺傳 物質匯集在一起，創(chuàng)建不能W其他方式在生物有機體中發(fā)現(xiàn)的序列而形成的多核巧酸(例 如DNA)分子。如本領域技術人員可W理解的-重組宿主細胞包含重組多核巧酸(例如DNA)分 子，因此，就運一點而論，重組宿主細胞將不會被理解為包括天然野生型細胞-諸如例如天 然野生型姻脂蟲細胞。
[0073] 換句話說并如本領域技術人員可W理解的-例如天然野生型姻脂蟲細胞同樣地不 包含編碼糖基轉移酶的重組糖基轉移酶基因。
[0074] 可優(yōu)選的是，步驟(A)中的重組宿主細胞是包含編碼糖基轉移酶的重組糖基轉移 酶基因的重組宿主細胞。
[0075] 如本文所討論的-在工作實施例使黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)與SEQ ID N0:2的糖基轉移酶在體外接觸。運可W看作是本領域技術人員執(zhí)行運樣的體外接觸步驟的 常規(guī)工作。
[0076] SEQ ID N0:2的糖基轉移酶在酵母細胞中重組表達(參見工作實施例)-因此，制成 了包含編碼SEQ ID NO:2的糖基轉移酶的重組糖基轉移酶基因的重組酵母宿主細胞。
[0077] 我們認為，如果黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)可W在適當?shù)臈l件下加入到 發(fā)酵培養(yǎng)基中，F(xiàn)K和/或KA化合物可W進入例如培養(yǎng)基中發(fā)酵的酵母細胞中-因此，如果例 如酵母細胞是包含編碼糖基轉移酶的重組糖基轉移酶基因的重組酵母宿主細胞，則可W在 FK和/或KA的重組宿主細胞中進行與糖基轉移酶的體內接觸。
[007引在例如W上所討論的W02004/111254Al(Poalis A/S)中，在不同的重組宿主細胞 中進行不同的糖巧配基化合物的運種體內接觸，而且本領域技術人員將知道如何在相關糖 巧配基(運里是黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A))的重組宿主細胞中進行和重組表達的 糖基轉移酶的體內接觸。
[0079] 如上所討論的-我們認為本文公開的新的糖基轉移酶代表首次公開了分離的能糖 基化黃姻脂酬酸糖巧配基和/或姻脂酬酸糖巧配基的糖基轉移酶。
[0080] 據(jù)認為，本文所公開的SEQ ID N0:2的新穎糖基轉移酶的有關部分序列可W重組 引入到另一個糖基轉移酶序列中W便構建能夠葡糖化黃姻脂酬酸和/或姻脂酬酸的新的混 合糖基轉移酶序列。具有減少的Km或增加的Vmax的運種GT可W證明確保底物的快速葡糖化 的重要性，所述底物當高水平累積時可能顯示抑制酵母生長的毒性作用化sben化化jaer 化nsen et 31.陸八〇油6111131:巧70(4):473-482)。同樣地，如果需要的話，可^設想可特異 地對前期路徑中間體的葡糖化來修飾底物。
[0081] 因此，本發(fā)明的另一個方面設及用于構建新穎的分離的混合糖基轉移酶多膚的方 法，所述新穎的分離的混合糖基轉移酶多膚能夠：
[0082] (I):綴合葡萄糖到黃姻脂酬酸(FK);和/或
[0083] (II)綴合葡萄糖到姻脂酬酸化A)，
[0084] 其中所述方法包括W下步驟：
[00化](i):將編碼具有與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515至少70%同一性的氨基酸序列片 段(優(yōu)選具有與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515至少90%同一性的氨基酸序列片段，更優(yōu)選具 有與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515至少99%同一性的氨基酸序列片段）的多核巧酸序列插 入來自糖基轉移酶的另一多核巧酸序列W便由此構建新的重組混合多核巧酸序列，其中所 述片段包含至少75個氨基酸(優(yōu)選至少100個氨基酸，更優(yōu)選至少150個氨基酸和甚至更優(yōu) 選至少468個氨基酸）；
[0086] (ii):表達由步驟(i)的新的重組混合多核巧酸序列編碼的新的混合多膚；
[0087] (iii):分離步驟(ii)的表達的新的混合多膚；
[0088] (iv):測試步驟(iii)的分離的新的混合多膚是否能夠：
[0089] (I):綴合葡萄糖到黃姻脂酬酸(FK);和/或
[0090] (II)綴合葡萄糖到姻脂酬酸化A);和
[0091] ( V )如果步驟(iv)的測試陽性，則已經(jīng)構建了運樣一種新的分離的混合糖基轉移 酶多膚，其能夠：
[0092] (I):綴合葡萄糖到黃姻脂酬酸(FK);和/或
[0093] (II)綴合葡萄糖到姻脂酬酸化A)。
[0094] 定義
[00%]相關術語的所有定義按照能由技術人員關于相關的技術背景所能理解的。
[0096] 術語"糖巧配基"表示糖巧配基的相應糖基化形式的非碳水化合物部分。當糖是葡 萄糖時，可W將糖巧配基稱為配基。此外，當糖是葡萄糖時，術語葡糖化可W代替糖基化使 用。
[0097] 當糖巧配基在徑基處糖基化時，通常產生所謂的0-糖巧鍵-即所謂的0-糖巧(或者 如果糖是葡萄糖，則為0-葡萄糖巧）。
[0098] 當糖巧配基通過碳-碳鍵糖基化時，其也可W被稱為C-糖巧鍵-即所謂的C-糖巧 (或如果糖是葡萄糖時，則為C-糖巧）。
[0099] 術語"糖巧"是指水解時可W得到糖和非糖(糖巧配基)殘基的化合物，例如，葡萄 糖巧可產生葡萄糖，半乳糖巧可產生半乳糖
[0100] 術語"糖基轉移酶"是指能夠綴合核巧酸激活的糖到化合物(例如，糖巧配基化合 物）的酶。糖可W例如是半乳糖，葡糖胺，N-乙酷氨基葡萄糖(N-acetylglusamine)，木糖，葡 萄糖醒酸，鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖或葡萄糖的D和L異構體?；蛘撸鎏强蒞是可用作核 巧酸二憐酸醋的碳水化合物衍生物，諸如，例如肌醇，橄攬?zhí)牵╫livose)，夾竹桃糖 (rhodinose)等。此外，所述糖可W例如是單糖，二糖或S糖。在低聚和多糖的情況下，糖被 逐一鏈接，通過例如設及使用一個或多個糖基轉移酶。如果糖是葡萄糖，可W將糖基轉移酶 稱為葡糖轉移酶。
[0101] 當糖基轉移酶通過C-糖巧鍵綴合核巧酸激活糖到化合物，可W將其稱為C-糖基轉 移酶。
[0102] 當糖基轉移酶通過0-糖巧鍵綴合糖到糖巧配基，可W將其稱為0-糖基轉移酶。
[0103] 術語"雜交"設及多核巧酸在至少中等嚴格條件與（i)SEQ ID NO: 1的核巧酸1至 1548或的互補鏈雜交，設及核巧酸序列在中等至非常嚴格的條件下與對應于SEQ ID NO: 1所示的的核巧酸序列或其互補鏈的標記核酸探針雜交。使用例如X射線膠片可W檢 測在運些條件下與核酸探針雜交的分子。
[0104] 本文有關雜交嚴格條件是本領域技術人員通常會理解有關的嚴格條件-即，對于 中等嚴格條件，技術人員會理解的條件是中等嚴格條件。技術人員知道有關的雜交嚴格條 件-見例如（J. Sambrook ,E .F. FYitsch ,and T .Maniatus , 1989 'Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。
[0105] 根據(jù)本領域-對于長度為至少100個核巧酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條 件定義為在42°C下在5X SS陽，0.3 % SDS，20化g/ml剪切和變性的娃精DNA中預雜交和雜交， W及25%甲酯胺對應非常低和低嚴格性，35%甲酯胺對應中和中-高嚴格性或50%甲酯胺 對應高和非常高嚴格性，之后進行標準南部(Southern)印跡程序12至24小時最佳。
[0106] 對于長度為至少100個核巧酸的長探針，所述載體材料最終洗涂=次，每次用2X SSC 0.2% SDS洗涂15分鐘，優(yōu)選至少在45°C (非常低嚴格性），更優(yōu)選至少在50°C (低嚴格 性），更優(yōu)選至少在55°C (中等嚴格性），更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴格性），甚至更優(yōu)選至少 在65°C (高嚴格性），并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴格性）。
[0107] 術語"體外"（拉下語:在玻璃中）設及一種使用有機體成分進行的研究，該有機體 成分已經(jīng)從其通常的生物環(huán)境分離W便允許進行比使用整個有機體時更詳細或更方便的 分析。通常將運些實驗稱為"試管實驗"。與此相反，體內研究是用處于正常完整狀態(tài)的活的 有機體進行的研究。
[0108] 術語"體內在活體內"的拉下語)設及一種使用整體，活的有機體的實驗，其與 部分或死的有機體，或體外（"在玻璃內"，例如，在試管或培養(yǎng)皿中）受控環(huán)境截然相反。
[0109] 術語"分離的多核巧酸"在本文中本質上設及的是多核巧酸從其天然環(huán)境分離-換 言之，該多核巧酸制備物基本上不含與其天然相關的其它多核巧酸物質。編碼本文描述的 分離/克隆的新糖基轉移酶的多核巧酸序列示于SEQ ID NO: 1并且它從昆蟲姻脂蟲分離。因 此，如技術人員所理解的-術語分離的多核巧酸當在姻脂蟲的基因組中天然存在時不包括 SEQ ID NO: 1的多核巧酸。術語"分離的多核巧酸"本質上設及的是該分離的多核巧酸是適 合于在遺傳工程蛋白質生產體系中使用的形式。因此，分離的多核巧酸，W重量計，含有至 多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚 至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然相關的其它多核 巧酸物質。術語"分離的多核巧酸"在本文中可W替代地被稱為"克隆的多核巧酸"。
[0110] 術語"分離的多膚"在本文中本質上設及的是一種多膚從其天然環(huán)境中分離。如 SEQ ID N0:2所示的新的糖基轉移酶多膚從昆蟲姻脂蟲分離。因此，如技術人員所理解的- 術語"分離的多膚"當其在姻脂蟲的基因組中天然存在時不包括SEQ ID N0:2的糖基轉移酶 多膚。術語"分離的多膚"是指運樣的多膚制備物，所述多膚制備物W重量計，含有至多 10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，至多3%，甚至更優(yōu)選 至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然相關的其它多膚物質。術 語"與其天然相關的其它多膚物質"可W設及如SEQ ID N0:2所示的新的糖基轉移酶多膚可 W看成與姻脂蟲中與其天然相關的其它多膚物質有關。在某些情況下-可W優(yōu)選的是，"分 離的多膚"指的是至少20%純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80% 純，最優(yōu)選至少90 %純，并且甚至最優(yōu)選至少95 %純的多膚，如通過SDS-PAGE測定的。
[0111] 本文所用的術語"核酸構建體"是指一種核酸分子，無論是單鏈或雙鏈，其從天然 存在的基因分離或者被修飾W含有在某種程度上不會W其他方式存在于自然界中的核酸 片段。當核酸構建體包含本發(fā)明的編碼序列表達所需的控制序列時，術語核酸構建體與術 語"表達盒"同義。如本領域所公知的，控制序列包括對于編碼本發(fā)明的多膚的多核巧酸的 表達必要或有利的所有組分。每個控制序列可W是天然的或對于編碼多膚的核巧酸序列是 不相關的。運種控制序列包括但不限于，前導序列，聚腺巧酸化序列，前膚序列，啟動子，信 號膚序列和轉錄終止子。最低限度，所述控制序列包括啟動子，W及轉錄和翻譯終止信號。 所述控制序列可提供有接頭W便引入特異性限制位點從而促進控制序列與編碼多膚的核 巧酸序列的編碼區(qū)的連接。
[0112] 術語"重組表達載體"設及包含本發(fā)明的多核巧酸，啟動子，及轉錄和翻譯終止信 號的重組表達載體。上述的各種核酸和控制序列可W結合在一起W產生重組表達載體，其 可包括一個或多個方便的限制性位點W允許在運些位點插入或替代編碼多膚的核巧酸序 列。
[0113] 術語"重組宿主細胞"在本文中應根據(jù)本領域來理解。如本領域中公知的，重組多 核巧酸(例如DNA)分子是通過基因重組的實驗室方法(例如分子克隆)將來自多個源的遺傳 物質匯集在一起，創(chuàng)建不能W其他方式在生物有機體中發(fā)現(xiàn)的序列而形成的多核巧酸(例 如DNA)分子。如本領域技術人員可W理解的-重組宿主細胞包含重組多核巧酸(例如DM)分 子，因此，重組宿主細胞將不會被理解為包括天然野生型細胞-諸如例如天然野生型姻脂蟲 細胞。
[0114] 術語"序列同一性"設及兩個氨基酸序列之間或兩個核巧酸序列之間的相關性。
[0115] 對于本發(fā)明而言，使用如EMBOSS程序包化MBOSSi^e European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,lYends Genet.16:276-277)(優(yōu)選版 本3.0.0或更高版本）的Needle程序所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法（Needlemanand Wunsch，1970, J.Mol.Biol. 48:443-453)確定兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度。使用 的可選參數(shù)是:缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5，W及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)替 代矩陣。標記為"最長同一性"（使用-nobrief選項獲得)的針(Needle)的輸出用作百分比同 一性，并計算如下：
[0116] (相同的殘基X 100)/(比對的長度-比對中缺口的總數(shù)）。
[0117] 對于本發(fā)明而言，使用如EMBOSS程序包化MBOSSi^e European Molecular Biology Open Software Suite,I?ice et al.,2000,見上文）（優(yōu)選版本3.0.0或更高版本） 的化edle程序所執(zhí)行的化edleman-Wunsch算法（Needleman and Wunsch, 1970,見上文）確 定兩個核巧酸序列之間的序列同一性程度。使用的可選參數(shù)是:缺口罰分10,缺口延伸罰分 0.5，W及抓NAFU化(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本）替代矩陣。標記為"最長同一性"（使用- nobr i ef選項獲得)的針(Needl e)的輸出用作百分比同一'性，并計算如下：
[0118] (相同的脫氧核糖核巧酸X 100)/(比對的長度-比對中缺口的總數(shù)）。
[0119] 本發(fā)明的實施方案描述如下，僅通過實施例的方式。
【附圖說明】
[0120] 圖1:本文描述的為SEQ ID N0:2的分離/克隆的新的糖基轉移酶的相關糖基轉移 酶活性的示意圖表示-如圖中所示，發(fā)現(xiàn)能夠綴合葡萄糖到糖巧配基黃姻脂酬酸(FK)和姻 脂酬酸化A)。
[0121] 圖2:采用OsCGT和訊UGT85B1產生黃姻脂酬酸和姻脂酬酸的葡萄糖巧。在包含UDP- 葡萄糖和黃姻脂酬酸(FK)或姻脂酬酸化A)的試驗中形成的葡糖化產物的LC-MS分析。來自 由FK (A)或KA (C)培養(yǎng)的大腸桿菌菌株X j b (陰性對照）的粗裂解物。來自由FK (B)或KA (D)培 養(yǎng)的表達OsCGT的X化細胞的粗裂解物。來自由FK化)或KA(F)培養(yǎng)的表達SbUGT85Bl的X化細 胞的粗裂解物。單獨的FK(G)和KA化)底物。表示了總離子色譜圖（TIC)和對于111八313^- H]-，m/z 329[M-H]-，m/z 475[M-H]-，m/z 491[M-H]-的提取離子色譜，對應于FK，KA，F(xiàn)K-單 葡萄糖巧，W及KA-單葡萄糖巧。峰保留時間W分鐘表示。
【具體實施方式】
[01。]如本文所述的新的分離的糖基轉移酶多膚
[0123] 當本文提及本文所述的分離的糖基轉移酶多膚時，是指本發(fā)明和/或其本文相關 的實施方案的第一方面的分離的糖基轉移酶多膚。
[0124] 術語"分離的多膚"在本文中本質上設及的是所述多膚從其天然環(huán)境中分離。如 SEQ ID N0:2所示的新的糖基轉移酶多膚從昆蟲姻脂蟲分離。因此，如技術人員所理解的- 術語"分離的多膚"當其在姻脂蟲的基因組中天然存在時不包括SEQ ID N0:2的糖基轉移酶 多膚。
[0125] 優(yōu)選地，本文描述的分離的糖基轉移酶多膚是指運樣的多膚制備物，所述多膚制 備物W重量計，含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多 4%，至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然 相關的其它多膚物質。
[0126] 如本領域技術人員所理解的，術語"與其天然相關的其它多膚物質"可W設及如 SEQ ID NO:2所示的新的糖基轉移酶多膚可W看成與姻脂蟲中與其天然相關的其它多膚物 質有關。
[0127] 在某些情況下-可W優(yōu)選的是，本文描述的分離的糖基轉移酶多膚指的是至少 20 %純，優(yōu)選至少40 %純，更優(yōu)選至少60 %純，甚至更優(yōu)選至少80 %純，最優(yōu)選至少90 %純， 并且甚至最優(yōu)選至少95 %純的多膚，如通過SDS-PAGE測定的。
[0128] 基于例如本文所公開的序列信息-運是本領域技術人員獲得如本文所述的分離的 糖基轉移酶多膚的常規(guī)工作。
[0129] 運可W例如根據(jù)本領域已知的程序在合適的重組宿主細胞中通過重組表達來完 成。
[0130] 因此，并不認為有必要在本文中詳細地描述運種標準的已知的重組表達程序。
[0131] 優(yōu)選地，如本文所描述的分離的糖基轉移酶多膚能夠：
[0132] (I):綴合葡萄糖到黃姻脂酬酸師）；和
[0133] (II):綴合葡萄糖到姻脂酬酸化A)。
[0134] 優(yōu)選的實施方案設及的是其中第一方面的糖基轉移酶多膚是：
[01巧](a)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少80%同一性的氨基酸序列的多 膚;更優(yōu)選
[0136] (a)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少90%同一性的氨基酸序列的多 膚;甚至更優(yōu)選
[0137] (a)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少95%同一性的氨基酸序列的多 膚;并且最優(yōu)選
[0138] (a)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少98%同一性的氨基酸序列的多 膚。
[0139] 可W優(yōu)選的是，第一方面的糖基轉移酶多膚是包含具有SEQ ID N0:2的氨基酸1至 515的氨基酸序列的多膚。
[0140] 優(yōu)選的實施方案設及的是其中第一方面的糖基轉移酶多膚是：
[0141] (b)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少80%同一性的氨基酸序列的多 膚;更優(yōu)選
[0142] (b)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少90%同一性的氨基酸序列的多 膚;甚至更優(yōu)選
[0143] (b)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少95%同一性的氨基酸序列的多 膚;和最優(yōu)選
[0144] (b)包含與SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少98%同一性的氨基酸序列的多 膚。
[0145] 可W優(yōu)選的是，第一方面的糖基轉移酶多膚是包含具有SEQ ID N0:2的氨基酸20 至468的氨基酸序列的多膚。
[0146] 優(yōu)選的實施方案設及的是其中第一方面的糖基轉移酶多膚是：
[0147] (C)由在至少中等嚴格條件下與（i)SEQ ID N0:1的核巧酸1至1548或的互 補鏈雜交的多核巧酸編碼的多膚;更優(yōu)選
[014引（C)由在至少高嚴格條件下與（i)SEQ ID N0:1的核巧酸1至1548或的互補 鏈雜交的多核巧酸編碼的多膚;甚至更優(yōu)選
[0149] (C)由在至少非常嚴格條件下與（i)SEQ ID N0:1的核巧酸1至1548或的互 補鏈雜交的多核巧酸編碼的多膚。
[0150] 本領域技術人員制備本文所述的分離的糖基轉移酶多膚的變體是常規(guī)工作-即例 如SEQ ID NO:2的例如一個或多個氨基酸已被修飾/改變的變體。
[0151] 進一步地-如本領域技術人員所公知的，如果運種變體變化并不過于激烈，運種酶 保持其相關的GT活性將是可行的。
[0152] 優(yōu)選的實施方案設及的是其中第一方面的糖基轉移酶多膚是：
[0153] (a)包含SEQ ID N0:2的氨基酸1至515的氨基酸序列的多膚或其變體，其中所述變 體包含在SEQ ID N0:2的一個或多個(幾個)位置的改變，并且其中所述變體包含小于50個 的改變，更優(yōu)選小于40個的改變，甚至更優(yōu)選小于20個的改變和最優(yōu)選小于10個的改變。
[0154] 在一個優(yōu)選的實施方案中，術語"在SEQ ID N0:2的一個或多個(幾個)位置的改 變"指的是在SEQ ID NO:2中的1至10個改變。
[0155] 根據(jù)現(xiàn)有技術-術語"變體"在本文是指具有相關的GT活性且包括在一個或多個 (幾個)位置的改變，即，替代、插入和/或缺失的膚。替代是指用不同的氨基酸替換占據(jù)位置 的氨基酸;缺失是指除去占據(jù)位置的氨基酸；W及插入是指鄰近占據(jù)位置的氨基酸添加1-3 個氨基酸。
[0156] 所述氨基酸可W是天然或非天然氨基酸-例如，用例如D-丙氨酸的例如特別的D- 異構體(或D-型）替代理論上是可能的。
[0157] 在一個優(yōu)選的實施方案中，第一方面的糖基轉移酶多膚是膜結合或不溶于水的 GT。
[0側]包括編碼如本文所述的糖基轉移酶多膚的核巧酸序列的分離的多核巧酸
[0159] 如上所討論的-本發(fā)明的第二個方面設及包含編碼第一方面和/或其本文相關的 實施方案的多膚的核巧酸序列的分離的多核巧酸。
[0160] 術語"分離的多核巧酸"在本文中可W替代地稱為"克隆的多核巧酸"。
[0161] 如上所討論的-術語"分離的多核巧酸"本質上設及的是多核巧酸從其天然環(huán)境分 離-換言之，該多核巧酸制備物基本上不含與其天然相關的其它多核巧酸物質。編碼本文描 述的分離/克隆的新的糖基轉移酶的多核巧酸序列示于SEQ ID NO: 1并且它從昆蟲姻脂蟲 分離。因此，如技術人員所理解的-術語分離的多核巧酸當在姻脂蟲的基因組中天然存在時 不包括SEQ ID NO: 1的多核巧酸。
[0162] 術語"分離的多核巧酸"本質上設及的是該分離的多核巧酸是適合于在遺傳工程 蛋白質生產體系中使用的形式。
[0163] 因此，分離的多核巧酸，W重量計，含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6 %， 更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1 %，并 且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然相關的其它多核巧酸物質。
[0164] 基于例如本文所公開的序列信息-運是本領域技術人員獲得如本文所述的分離的 多核巧酸的常規(guī)工作。
[0165] 運可W例如根據(jù)本領域已知的程序在合適的重組宿主細胞中通過重組表達來完 成。
[0166] 因此，并不認為有必要在本文中詳細地描述運種標準的已知的重組表達程序。
[0167] 包含如本文所述的分離的多核巧酸的核酸構建體
[0168] 如上所討論的-本發(fā)明的第=方面設及包含第二方面和/或其本文相關的實施方 案的分離的多核巧酸的核酸構建體，其可操作地連接到引導多膚在表達宿主中產生的一種 或多種控制序列。
[0169] 根據(jù)現(xiàn)有技術-本文所用的術語"核酸構建體"是指一種核酸分子，無論是單鏈或 雙鏈，其從天然存在的基因分離或者被修飾W含有在某種程度上不會W其他方式存在于自 然界中的核酸片段。
[0170] 當核酸構建體包含本發(fā)明的編碼序列表達所需的控制序列時，術語核酸構建體與 術語"表達盒"同義。如本領域所公知的，控制序列包括對于編碼本發(fā)明的多膚的多核巧酸 的表達必要或有利的所有組分。
[0171] 基于例如本文所公開的序列信息-運是本領域技術人員制備相關的核酸構建體的 常規(guī)工作-例如，基于現(xiàn)有技術，本領域技術人員知道用于編碼本發(fā)明的多膚的多核巧酸的 表達的各種不同的合適的控制序列。
[0172] 因此，并不認為有必要在本文中詳細地描述運種標準的已知的技術原理。 陶]包含如本文所述的核酸構建體的重組表達載體
[0174] 如上所討論的-本發(fā)明的第四方面設及一種重組表達載體，其包括第=方面和/或 其本文相關的實施方案的核酸構建體。
[0175] 根據(jù)現(xiàn)有技術-術語"重組表達載體"設及包含本發(fā)明的多核巧酸，啟動子，及轉錄 和翻譯終止信號的重組表達載體。上述的各種核酸和控制序列可W結合在一起W產生重組 表達載體，其可包括一個或多個方便的限制性位點W允許在運些位點插入或替代編碼多膚 的核巧酸序列。
[0176] 基于例如本文所公開的序列信息-運是本領域技術人員制備相關的重組表達載體 的常規(guī)工作-例如，基于現(xiàn)有技術，本領域技術人員知道各種不同的啟動子，及轉錄和翻譯 終止信號。
[0177] 因此，并不認為有必要在本文中詳細地描述運種標準的已知的技術原理。
[017引包含如本文所述的核酸構建體的重組宿主細胞
[0179] 如上所討論的-本發(fā)明的第五個方面設及一種重組宿主細胞，其包含第=方面和/ 或其本文相關的實施方案的核酸構建體。
[0180] 術語"重組宿主細胞"在本文中應根據(jù)現(xiàn)有技術來理解。如本領域中公知的，重組 多核巧酸(例如DNA)分子是通過基因重組的實驗室方法(例如分子克隆)將來自多個源的遺 傳物質匯集在一起，創(chuàng)建不能W其他方式在生物有機體中發(fā)現(xiàn)的序列而形成的多核巧酸 (例如DNA)分子。如本領域技術人員可W理解的-重組宿主細胞包含重組多核巧酸（例如 DNA)分子，因此，就運一點而論，重組宿主細胞將不會被理解為包括天然野生型細胞-諸如 例如天然野生型姻脂蟲細胞。
[0181] 基于例如本文所公開的序列信息-運是本領域技術人員制備相關的重組宿主細胞 的常規(guī)工作-例如，基于現(xiàn)有技術，本領域技術人員知道許多不同的合適的重組宿主細胞， 其多年來已被用作例如用于不同的目的多膚的表達的重組宿主細胞。
[0182] 重組宿主細胞可W是任何合適的細胞，例如任何真核細胞[例如哺乳動物細胞(如 例如中國倉鼠卵巢(C冊)細胞)或植物細胞]或任何原核細胞。
[0183] 特別優(yōu)選的是，其中重組宿主細胞是產黃姻脂酬酸/姻脂酬酸或其他相關的化合 物的植物細胞，例如大黃類植物細胞。
[0184] 優(yōu)選地，重組宿主細胞是選自由絲狀真菌細胞和微生物細胞組成的組的細胞。
[0185] 絲狀真菌包括細分真菌口和卵菌口的所有絲狀形式（如化wksworth等人所定義 的，1995,見上文）。絲狀真菌W由幾下質，纖維素，葡聚糖，殼聚糖，甘露聚糖和其它復雜多 糖組成的營養(yǎng)菌絲體為特征。營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長而碳分解代謝是絕對需氧的。與此 相反，酵母例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的營養(yǎng)生長是通過單細胞菌體的出 芽而碳分解代謝可W是發(fā)酵性的。
[0186] 可W優(yōu)選地，絲狀真菌細胞是物種支頂抱屬，曲霉屬真菌，鑲抱屬，腐質霉屬，毛霉 屬，毀絲霉屬，脈抱屬，青霉屬，梭抱殼屬，彎頸霉屬和木霉屬或它們的有性型或異名的細 胞，但不限于運些。
[0187] 優(yōu)選的曲霉屬真菌細胞是黑曲霉或米曲霉。
[0188] 本文優(yōu)選的微生物細胞是選自酵母細胞和原核細胞組成的組的微生物細胞。
[0189] 優(yōu)選的酵母細胞是選自子囊菌綱，擔子菌綱和半知菌綱組成的組的酵母細胞。優(yōu) 選地，酵母細胞選自由子囊菌綱組成的組。
[0190] 優(yōu)選的子囊菌綱酵母菌細胞選自由阿舒囊霉屬(Ashbya)，Bo付yoascus，德己利氏 酵母屬，漢遜酵母屬（Hansenula)，克魯維酵母菌屬（Kluveromyces)，油脂酵母屬 (Xipomyces)，酵母屬（Saccharomyces spp)例如，釀酒酵母，畢赤酵母屬(Pichia spp.)，裂 殖酵母（Schizosaccha;romycesspp)組成的組。
[0191] 優(yōu)選的酵母細胞是選自由酵母屬（Saccharomyces spp)例如，釀酒酵母和畢赤酵 母屬(Pichia spp.)組成的組的酵母細胞。
[0192] 優(yōu)選的原核細胞選自由芽抱桿菌屬，鏈霉菌屬，棒狀桿菌屬，假單胞菌屬，乳酸菌 和大腸桿菌細胞組成的組。
[0193] 優(yōu)選的芽抱桿菌屬細胞是枯草芽抱桿菌（B. subtil is)，解淀粉芽抱桿菌 (B.amyloliquefaciens)或地衣芽抱桿菌(B. licheniformis)。
[0194] 優(yōu)選的鏈霉菌屬細胞是西唐氏鏈霉菌（S.setonii)或天藍色鏈霉菌 (S.coelicolor)。
[01M]優(yōu)選的棒狀桿菌細胞是谷氨酸棒桿菌(C.glutamic皿)。
[0196] 優(yōu)選的假單胞菌細胞是惡臭假單胞菌(P. putida)或巧光假單胞菌(P. putida)。
[0197] 一種生產黃姻脂酬酸(FK)糖巧和/或姻脂酬酸(KA)糖巧的方法
[0198] 如上所討論的-本發(fā)明的第六個方面設及一種用于產生黃姻脂酬酸(FK)糖巧和/ 或姻脂酬酸化A)糖巧的方法，其中所述方法包括W下步驟：
[0199] (A):在體外或體內在包含編碼糖基轉移酶的糖基轉移酶基因的重組宿主細胞中 使：
[0200] (al):黃姻脂酬酸(FK)與能夠糖基化黃姻脂酬酸的糖基轉移酶在產生黃姻脂酬酸 糖巧的合適條件下接觸;和/或
[0201] (a2):姻脂酬酸化A)與能夠糖基化姻脂酬酸的糖基轉移酶在產生姻脂酬酸糖巧的 合適條件下接觸。
[0202] 優(yōu)選地，步驟(A)中的重組宿主細胞是包含編碼糖基轉移酶的重組糖基轉移酶基 因的重組宿主細胞。
[0203] 優(yōu)選地，步驟(a2)中的糖基轉移酶是一種葡糖基轉移酶而且由此，在步驟(a2)中 產生姻脂酬酸葡萄糖巧，優(yōu)選其中產生的姻脂酬酸糖巧是姻脂紅酸(本文的圖1示出姻脂紅 酸的結構）。
[0204] 優(yōu)選地，步驟(al)中的糖基轉移酶是一種葡糖基轉移酶而且由此，在步驟(al)中 產生黃姻脂酬酸葡萄糖巧，優(yōu)選其中產生的黃姻脂酬酸糖巧是化合物化IK本文的圖1示出 化合物化II的結構）。
[0205] 當步驟(al)中所產生的化合物是化II時，可W優(yōu)選的是使用本Dell作為中間體來 制備姻脂紅酸。
[0206] 運可W通過化學合成進行并且本領域技術人員知道如何根據(jù)他的普通一般知識 做到運一點。
[0207] 另外，運也可W通過例如使用合適的加氧酶酶促地進行。合適的加氧酶的一個實 例是單加氧酶的細胞色素P450超家族(正式縮寫為CYP)酶。其它實例是黃素單加氧酶或不 同類型的雙加氧酶，然而該名單不應被認為是排除其它類的酶的參與。
[0208] 如本領域中已知的-由細胞色素 P450催化的最常見的反應是單加氧酶反應，例如， 插入一個氧原子到底物中。
[0209] 如本領域技術人員在本發(fā)明上下文中理解的-如本文所討論的第六方面的方法的 步驟(a)的術語黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)糖巧配基應被理解為如圖1所示的FK 和/或KA具體化合物W及運些具體的化合物的具有較小的取代基的等效類似物(例如FK甲 醋）。
[0210] 如由本領域技術人員所理解的-如果FK甲醋用作第六方面的方法的步驟(a)中的 糖巧配基，那么經(jīng)過糖基化步驟將生成FK甲醋糖巧，其通過常規(guī)除去甲基將產生化II-相應 地，關于本文中所討論的第六方面的方法，F(xiàn)K甲醋可被視為等同于FK糖巧配基。
[0211] 在第六方面的方法的步驟(a)中指定，使用了能夠糖基化FK和/或KA的糖基轉移 酶-因此可W理解，GT必須能夠運樣做。
[0212] 可W優(yōu)選地純化步驟(A)中產生的糖巧-即，在步驟(al)和/或在步驟(a2)中。
[0213] 因此，可W優(yōu)選的是，第六方面的方法包括具有下列步驟的進一步的步驟(B):
[0214] (B):純化步驟(al)和/或步驟(a2)中產生的糖巧，由此得到一種組合物，其中組合 物中至少5%w/w(優(yōu)選至少10%w/w，更優(yōu)選至少50%w/w和最優(yōu)選至少80%w/w)的化合物 是所產生的黃姻脂酬酸糖巧和/或姻脂酬酸糖巧。
[0215] 本領域技術人員知道如何純化運類糖巧化合物并且其可W根據(jù)本領域進行。
[0216]純化步驟(B)可W是特別優(yōu)選的，當：
[0217]-在步驟姐）中產生的糖巧是姻脂紅酸時；
[021引-在步驟(al)中產生的糖巧是化合物Dell時;和/或
[0219] -在步驟(al)中產生的糖巧是化合物化II并且它用作中間體W制備姻脂紅酸時。
[0220] 如本文所討論-在工作實施例中，使黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)與SEQ ID N0:2的糖基轉移酶體外接觸。運可W被看作是本領域技術人員執(zhí)行運樣的體外接觸步驟的 常規(guī)工作。
[0221] SEQ ID N0:2的糖基轉移酶在酵母細胞中重組表達(參見本文的工作實施例)-因 此，在本文的一個工作實施例中，制成了運樣的重組酵母宿主細胞，其包含編碼SEQ ID NO: 2的糖基轉移酶的重組糖基轉移酶基因。
[0222] 我們認為，如果黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)可W在適當?shù)臈l件下加入到 發(fā)酵培養(yǎng)基中，F(xiàn)K和/或KA化合物可W進入例如培養(yǎng)基中發(fā)酵的酵母細胞中-因此，如果例 如酵母細胞是包含編碼糖基轉移酶的重組糖基轉移酶基因的重組酵母宿主細胞，則可W在 FK和/或KA的重組宿主細胞中進行與糖基轉移酶的體內接觸。
[0223] 在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(A)中的接觸是在體內且重組宿主細胞是酵母細 胞，優(yōu)選其中所述酵母細胞選自由酵母屬(例如釀酒酵母)和畢赤酵母屬組成的組。
[0224] W上描述了優(yōu)選的重組宿主細胞-運些優(yōu)選的重組宿主細胞也可W是與本發(fā)明的 第六方面的方法相關的優(yōu)選的重組宿主細胞。
[0225] 在本文中-可W說，確定合適的重組宿主細胞W執(zhí)行第六方面的方法的體內接觸 步驟(A)在本領域技術人員的普通知識范圍內并且不認為有必要在此詳細地描述。
[02%]上面討論了優(yōu)選的重組宿主細胞可W例如是微生物細胞或絲狀真菌細胞-運些細 胞可W是與第六方面的方法相關的優(yōu)選的重組宿主細胞。
[0227] 可能能夠制備運樣的重組宿主細胞(例如重組宿主微生物細胞），其包含編碼參與 生物合成途徑導致黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)的產物的基因，并且運樣的重組宿 主細胞可在本文中優(yōu)選。
[0228] 因此，可W優(yōu)選的是步驟(A)中的接觸是在運樣的重組宿主細胞中的體內接觸，所 述重組宿主細胞包含編碼糖基轉移酶的重組糖基轉移酶基因和編碼參與生物合成途徑導 致黃姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)的產物的基因。
[0229] 如在本文的工作實施例中討論的-SEQ ID N0:2的GT在體內和在水中是膜結合的 或疏水/不溶。當生產細胞或包含膜結合GT的細胞部分從產品（例如，姻脂紅酸)分離時，GT 可W基本上不存在于更可溶產物/親水產物所存在的部分中。運對于獲得最終產物(例如姻 脂紅酸產物/組合物)是有利的，所述最終產物基本上完全不含有重組GT。
[0230] 因為通過GT糖基化的底物可W是疏水的糖巧配基，該糖巧配基將預期在膜中和生 產細胞的其它疏水部分部分地累積。通過使用膜結合GT，獲得在例如膜中存在的疏水化合 物的更有效的糖基化。
[0231] 因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，在第六方面的方法中使用的糖基轉移酶是膜結 合或不溶于水的GT。
[0232] 在一個優(yōu)選的實施方案中-第六方面的方法的步驟(A)中的糖基轉移酶是第一個 方面和/或其本文相關的實施方案的糖基轉移酶。
[0233] 如本文所討論的-工作實施例4的所確定的數(shù)據(jù)/結果顯示，本文有關的GT酶可W 在例如局梁和水稚中識別。
[0234] 在本文中，高梁多膚序列(Genba址登錄ID號:AAF17077.1)顯示為沈Q ID N0:4。
[0235] 在本文中，水稻多膚序列(Genba址登錄ID號:CAQ77160.1)顯示為沈Q ID N0:5。
[0236] 可能相關的是，第六方面的方法的步驟(A)中的糖基轉移酶是運樣的糖基轉移酶， 其包含具有與SEQ ID NO:4的氨基酸1至492至少70% (優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，甚 至更優(yōu)選至少98%)的同一性的氨基酸序列。
[0237] 可能相關的是，第六方面的方法的步驟(A)中的糖基轉移酶是運樣的糖基轉移酶， 其包含具有與SEQ ID NO: 5的氨基酸1至471至少70% (優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，甚 至更優(yōu)選至少98%)的同一性的氨基酸序列。
[023引實施例
[0239] 實施例1-姻脂蟲GT的克隆及其FK和KA活性的測試
[0240] 材料和方法
[0241] DNA 和 mRNA 的純化
[0242] 鮮凍姻脂蟲(從蘭薩羅特獲得）。鮮凍波斯姻珠階(Po巧hyrophora polonica)從波 蘭獲得。將冷凍昆蟲在液氮下磨成粉末并純化DNA/RNA:根據(jù)供應商的試驗方案，使用 歴easy Blood&Tissue試劑盒（Qiagen)純化DNA。根據(jù)供應商的試驗方案，使用RNeasy小型 試劑盒(Qiagen)純化RNA。
[0243] 使用逆轉錄酶反應的多-dT引發(fā)，根據(jù)供應商的試驗方案，使用RT2簡易第一鏈試 劑盒化asy First Strand Kit)(Qiagen)將真核生物mRNA制成cDNA。
[0244] DNA 和 RNA 的測序：
[0245] 使用10化p配對末端Illumina技術，根據(jù)Illumina的試驗方案，W約60-100X的覆 蓋范圍在測序的BGI (中國深圳)對DNA和cDNA進行了測序，輸出結果為化S化數(shù)據(jù)格式。
[0246] DNA和RNA/cDNA序列的分析：
[0247] 將所獲得的DM和RM/cDM的Fastq序列導入到基因組工作臺（Genomic Workbench)版本5.4(化C-bio,奧爾胡斯，丹麥)并使用從頭組裝算法組裝成重疊群。將輸出 文件導出為FASTA格式。
[024引然后將RNA/cDNA FASTA文件導入到I0GMA v.l0(Genostar，法國格勒諾布爾）并使 用"基于隱馬爾科夫矩陣的原核生物基因發(fā)現(xiàn)者（hidden Markov-Matrix-based prokaryote邑ene-finder)''鑒定推定的基因。
[0249] 相對于GenBank(NCBI)使用化AST(基礎局部比對序列工具）注釋推定的基因， GenBank(NCBI)也使用該核巧酸序列作為翻譯的蛋白質序列。也通過與蛋白質家族的PFAM 數(shù)據(jù)庫進行相似性比較來注釋該推定的基因。
[0250] 從姻脂蟲制備蛋白質組分
[0251] 在含有0.3g的聚乙締化咯燒酬的120mL隔離緩沖液[350mM薦糖，20mM Tricine(pH 7.9)，10mM NaCl，5mM DTT，lmM PMSF)中均化3克新鮮的姻脂蟲昆蟲。將勻漿通過尼龍布(22 皿篩目）過濾，并離屯、(4°C下10分鐘，10，OOOxg)。將上清液離屯、（1小時，105，OOOxg，4°C)，得 到可溶性和膜結合蛋白組分。將可溶性蛋白組分濃縮至ImL，并使用Ami con ul1:rafugation-3K設備(Millipore)用20mM T;ricine(pH 7.9)，5mM DTT緩沖液交換。通過 使用貂畫筆在60mL的20mM Tricine(pH 7.9)，5mM DTT中重懸浮來洗涂膜結合蛋白顆粒S 次，然后重新離屯、。膜結合蛋白沉淀最后再懸浮于1血的20mM Tricine(抑7.9)，5mM DTT中。 分析可溶性蛋白組分和膜結合蛋白組分的糖基化活性。
[0252] 從姻脂蟲膜蛋白純化黃姻脂酬酸/姻脂酬酸特異性GT活性
[0253] 通過加入1% (v/v)T;riton X-100(還原形式），并在冷浴中緩慢攬拌1.5小時來溶 解從3g鮮姻脂蟲昆蟲分離的膜結合蛋白組分。離屯、Triton X-100處理過的溶液（1小時， 105,000xg，4°C)，W及分離上清液并施加到用2mL Q-瓊脂糖hst flow(陸armacia)填充的 柱中。用4mL緩沖液A[20mM hicine(抑為7.9)，0. l%(v/v)T;riton X-100(還原形式），50mM 船(：1]洗涂該柱并使用從10〇1111-50〇1111，（^5〇1111增量）的不連續(xù)的船(：1梯度^2〇1111化^1116 (pH 7.9)，0.1% (v/v)T;riton X-100(還原形式））洗脫蛋白質。收集0.5mL級分，脫鹽，用 SDS-PAGE分析并使用所描述的放射性標記的葡糖化酶測定法監(jiān)測葡糖化活性。含有富集的 黃姻脂酬酸/姻脂酬酸特異性GT活性的級分進行膚質量指紋圖譜分析。
[0254] 酶測定和糖巧產品檢測
[02巧]在含有20mMTricine(pH7.9)，3.3皿UDP[14C]葡萄糖和20uL蛋白提取物(膜結 合的或可溶蛋白質）的60uL的測定混合物中進行黃姻脂酬酸和姻脂酬酸的葡糖化。反應在 30°C下溫育0.5小時，并通過添力日180化甲醇終止。樣品在4°C下Wl6,000xg離屯、5分鐘并將 上清液點在化C板(硅膠60F254板;Merck)上。測定產物在二氯甲燒：甲醇：甲酸(7:2:2，按體 積計）中溶解。使用ST0RM840化osphorImager可視化放射性標記的產物（Molecular Dynamics,http://www.moleculardynamics.com)。
[0巧6] 在釀酒酵母中表達密碼子優(yōu)化的化UGT2，DcUGT4和化UG巧
[0257] 用于酵母表達的DcUGT2和來自姻脂蟲轉錄組的被稱為化UGT4和DcUGT5的兩個其 他假定的GT序列的合成密碼子優(yōu)化的版本購自GenScript，具有側翼Gateway重組at1:L位 點。該合成的片段用作具有特異性的引物W產生相應的C-末端Str邱n標簽的版本的PCR模 板。使用LR clonasell酶混合物將六個基因構建體（標記的和未標記的片段）克隆到 Gateway目的質粒pYES2.Invitrogen)中。該六個pYES-DESl'SS質粒構建體單獨轉 化成Invscl酵母菌株（Invitrogen)并通過PCR驗證陽性轉化體。根據(jù)pYES-DEST52Gateway 載體(Invitrogen)的說明進行異源蛋白質生產。使用抗鏈球菌抗體由免疫印跡法驗證異源 StrepII標簽的蛋白的生產。如（D . Pompon ,B . Louerat, A . Bronine ,P . Urban , Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments.Methods Enzymol. 272( 1996)51-64)所描述的從經(jīng)驗證的酵母轉化體制備膜結合蛋白組分。272 (1996)51-64)并篩選對黃姻脂酬酸/姻脂酬酸的葡糖化活性。在本文中，酵母優(yōu)化的序列示 于沈Q ID NO:3。
[0 巧引 LC-MS-MS
[0259] 用下列HPLC系統(tǒng)在Agilent Q-T0F上進行LC/MS:
[0260] 柱Kinetix 2.6陽B-C18 100Aa00X4.60mm，Phenomenex)。溶劑A(900mL去離子 水，100ml甲醇和50ml甲酸）。溶劑B(700mL甲醇，300ml去離子水和50mL甲酸）。 惦61] 流速0.8ml/分鐘。35 °C。
[0%2] 梯度洗脫。0-1分鐘100%A。線性梯度至83 %A 3分鐘。線性梯度至63 %A6分鐘，線 性梯度至45%A 9分鐘，線性梯度至27%A 12分鐘，線性梯度至10%A 15分鐘，線性梯度至 3%A 17分鐘，線性梯度至2%A 19分鐘，線性梯度至0%A 20分鐘，0%A 22分鐘，線性梯度 至100 % A 25分鐘。
[0263] 保留時間分別為姻脂紅酸7.6分鐘，DC II 7.8分鐘，黃姻脂酬酸13.7分鐘和姻脂 酬酸13.9分鐘。
[0264] 結果：
[0265] 在均化的姻脂蟲昆蟲中，使用C14-UDP-葡萄糖作為底物，檢測糖基化黃姻脂酬酸/ 姻脂酬酸的能力?；钚员蛔C明是膜結合的并純化活性，W及將純化的蛋白質提交給蛋白質 組學分析。結果表明，酶的活性來自于具有對應于我們的候選基因化UGT2的序列的多膚。
[0266] 如W上所討論的-在本文中將為SEQ ID NO: 2的本文相關的糖基轉移酶酶稱為 "DcUGT2"。
[0267] 化UGT2的氨基酸序列顯示與任何已知的糖基轉移酶的少于45 %的同源性。
[026引認識到克隆野生型序列到酵母并未提供相關酶活性，我們將DCUGT2的核巧酸序列 重新設計成編碼相同的多核巧酸但使用為釀酒酵母優(yōu)化的核巧酸密碼子的序列，該過程稱 為密碼子優(yōu)化(在本文中，釀酒酵母優(yōu)化的序列如SEQ ID No.3所示）。接著克隆化UGT2的密 碼子優(yōu)化的序列并在酵母中表達。異源酵母菌株包含能夠葡糖化姻脂酬酸和黃姻脂酬酸的 膜結合酶活性。
[0269] 在從富集有針對黃姻脂酬酸/姻脂酬酸的GT活性的姻脂蟲蛋白組分獲得膚質量指 紋數(shù)據(jù)后，我們匹配膚質量到轉錄組數(shù)據(jù)集并確定了 S個假定的UGT(DcUGT2，DcUGT4和 DcUG^)。
[0270] S個候選物在酵母中的異源表達顯示，只有運些UGT之一，即DcUGT2負責姻脂蟲蛋 白組分中的所觀察到的針對黃姻脂酬酸/姻脂酬酸的葡糖化活性。
[0271] 生成的C-14放射性標記的葡萄糖巧的復合多糖酶(visco巧me)處理，表明其是耐 水解的，進一步暗示化UGT2是C-GT，負責產生DCII和姻脂紅酸。
[0272] LC-MS-MS顯示產物的信息，其具有與化II和姻脂紅酸分別相同的保留時間、頻譜、 分子量和分子降解模式。
[0273] ^
[0274] 實施例1的結果表明，分離/克隆為SEQ ID N0:2的可W在本文中稱為"DCUGT2"的 本文相關的糖基轉移酶酶不是一件容易的事。
[0275] 例如，分析了姻脂蟲昆蟲的基因組和轉錄組的經(jīng)鑒定的基因序列與本文相關公知 C-糖基轉移酶序列的相似度，在基因組/轉錄組的經(jīng)鑒定的基因序列在此都未表現(xiàn)出與公 知的本文相關C-糖基轉移酶序列的顯著相似度的意義上，結果是陰性的。
[0276] 然而，即使生物信息學的序列相似性分析，可W說指示了姻脂蟲的基因組不會包 含編碼本文相關糖基轉移酶的基因-然而本發(fā)明人繼續(xù)對此進行研究，并且本發(fā)明人鑒定 了具有本文相關的GT活性的姻脂蟲提取物(包括在姻脂蟲中存在的內共生體的提取物)并 且通過本文相關的純化和檢測步驟的組合，本發(fā)明人終于能夠得到較純的組分/組合物，由 此能夠獲得可能的GT酶候選物的若干部分氨基酸序列。
[0277] 本發(fā)明人測試了描述SEQ ID NO: 2的分離/克隆的新的糖基轉移酶的活性并且發(fā) 現(xiàn)其能夠綴合葡萄糖到糖巧配基黃姻脂酬酸(FK)和姻脂酬酸化A)-參見圖1。
[027引實施例2測試現(xiàn)有技術已知的化dGT2的KA GT活性
[0279] 如上所討論的-在Gaig等人的文章中描述了 UrdGT2(Angew Chem Int Ed Engl.200 6N0V 27;45(46):7842-6)。
[0280] 如上所討論的-本文描述了化dGT2能夠糖基化不同的糖巧配基分子，運些不同的 糖巧配基分子可W被認為結構上類似于本文相關的姻脂酬酸化A)和黃姻脂酬酸(FK)糖巧 配基。
[0281] 克隆用于大腸桿菌表達的化dGT2的密碼子優(yōu)化的合成版本并且在大腸桿菌中重 組表達。獲得了含有重組化dGT2的粗可溶性蛋白提取物-即包括化dGT2的提取物。
[0282] 使用UDP-葡萄糖或TDP-葡萄糖作為糖供體和FA/KA作為糖巧配基底物在體外分析 化dGT2GT活性。未檢測到對運些糖巧配基的活性-即，關于運些糖巧配基，未識別到本文相 關的GT活性。
[0283] 然而，可W確認的是，重組化dGT2是活躍的，如通過大腸桿菌粗提物中的不明化合 物的葡糖化衍生而來的C14-放射標記的葡萄糖巧的體外形成所證明的。
[0284] 實施例3蘆苔植物和十二卷屬植物中的GT活性
[0285] 從蘆苔分離和測試GT活性
[0286] 1)洗去植物的±壤顆粒并分離成:A)根，B)綠葉組織和C)來自葉的凝膠物質
[0287] 2)在液氮中立即冷凍5g組織并且在冷研鉢中用巧磨成細粉。
[02則 3)將含有無抓TA(Roche)的完全蛋白酶抑制劑，0.1%(w/v)硫酸魚精蛋白和0.5g PVPP的20mL的冷的提取緩沖液[20mM Tricine-HCiaOmM 化Cl，5mM DTT，lmM PMSF，pH 7.9]加入到粉末中并滿旋。
[0289] 4)將勻漿在4°C下緩慢攬拌10分鐘，然后Wl2,000xg在4°C下離屯、5分鐘。
[0290] 5)將上清液分離并在恒定攬拌下在4°(：下將1血的在2〇1111化^1116-肥1，抑7.9中 的2% (w/v)硫酸魚精蛋白滴加2分鐘。
[0291] 6)將上清液通過2片尼龍網(wǎng)過濾。然后將過濾的上清液Wl2,000xg在4°C下離屯、5 分鐘。
[0292] 7)將上清液分離并Wll0,000xg在4°C下超高速離屯、化。
[0293] 8)分離可溶性蛋白組分(上清液)并使用Amicon超離屯、過濾裝置-3K(Millipore) 用含有5mMDTT的20mMTricine-肥lpH7.9緩沖液交換5次
[0巧4] 9)在含UDP-葡萄糖（1.25mM終濃度）或FK(50咖終濃度），KA( 50礎終濃度）或MeO- FK/ET0-FK (50皿/50皿終濃度）的60化的總反應體積中在30°C下培養(yǎng)20化可溶性蛋白提取 物2小時，并在65化pm下振搖。
[02巧]10)用180uL冷的甲醇終止酶反應并通過0.45曲1過濾器過濾并進行HPLC-MS分析。 [0296]
[0297]
[0298] 表1.使用來自蘆苔的酶提取物在體外葡糖化試驗中形成的糖巧。
[0299] 測試來自=種蘆苔組織的粗可溶性酶提取物，綠葉物質（葉），來自葉的凝膠物質 (凝膠）和根對黃姻脂酬酸(FK)，姻脂酬酸化A)，黃姻脂酬酸的甲醋(MeOFK)和黃姻脂酬酸 化tOFK)的乙醋的葡糖化活性。數(shù)值對應于在體外形成的新的葡萄糖巧的HPLC-MS分離之后 的保留時間(分鐘）（表1)。
[0300] m/z值475和491為相同的m/z值，如分別從溶解在相似的溶液中的Dell和CA獲得 的。兩個m/z值均為162(葡萄糖巧中的葡萄糖的m/z值），高于FK和KA的m/z值，表明來自反應 緩沖液中的UDP-葡萄糖的葡萄糖部分已通過提取液中的GT轉移到糖巧配基。m/z[M-H]值 489和503也為162,高于分別用MeOFK和化0FK獲得的m/z值，表明葡萄糖單位已經(jīng)由存在于 提取物中的GT添加到MeOFK和EtOFK。
[0301 ] 來自琉璃殿化aworthia limifolia)的GT活性的分離和測試
[0302] 程序如同關于蘆苔所描述的，但是分析的植物組織如下:A)綠色葉片組織，B)來自 葉的凝膠物質，C)基部組織(根和莖之間的粉紅色部分)和D)根組織。
[0303] 測試來自四種琉璃殿組織的粗可溶性酶提取物，綠葉物質（葉），來自葉的凝膠物 質（凝膠及根和莖之間的粉紅色組織(基部)和根對黃姻脂酬酸(FK)，姻脂酬酸化A)，黃 姻脂酬酸的甲醋(MeOFK)和黃姻脂酬酸巧tOFK)的乙醋的葡糖化活性。數(shù)值對應于在體外形 成的新的葡萄糖巧的HPLC-MS分離之后的保留時間(分鐘）（表2)。
[0304]
[0305] 表2.使用來自琉璃殿的酶提取物在體外葡糖化試驗中形成的葡萄糖巧
[0306] m/z值475和491為相同的m/z值，如分別從溶解在相似的溶液中的Dell和CA獲得 的。兩個m/z值均為162(葡萄糖巧中的葡萄糖的m/z值），高于FK和KA的m/z值，表明來自反應 緩沖液中的UDP-葡萄糖的葡萄糖部分已通過提取液中的GT轉移到糖巧配基。m/z[M-H]值 489和503也為162,高于分別用MeOFK和化0FK獲得的m/z值，表明葡萄糖單位已經(jīng)由存在于 提取物中的GT添加到MeOFK和EtOFK。
[0307]
[0308] ^施例的結果表明，可W在蘆苔植物和十二卷植物中識別到本文相關的糖基轉 移酶(GT)酶。
[0309] 換言之，蘆苔植物和十二卷植物包含能夠糖基化黃姻脂酬酸W便產生黃姻脂酬酸 糖巧;和/或能夠糖基化姻脂酬酸W產生姻脂酬酸糖巧的糖基轉移酶。
[0310]實施例4高梁和水稻中的GT活性
[0311] 如本領域已知的-高梁和水稻包括糖基轉移酶。
[0312] 如本領域中已知的-一些高梁和水稻糖基轉移酶可W糖基化低分子量的糖巧配基 化合物。
[0313] 在現(xiàn)有技術中描述的來自高梁和水稻的糖基化轉移酶與本文所公開的SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有顯著小于70%的同一性。
[0314] 本領域不知道高梁和/或水稻的糖基轉移酶是否是本文相關的糖基轉移酶-即，能 夠糖基化黃姻脂酬酸W便產生黃姻脂酬酸糖巧和/或能夠糖基化姻脂酬酸W產生姻脂酬酸 糖巧的糖基轉移酶。
[0315] 來自高梁（Sor曲um bicolor)的具有Genbank ID號AF199453.U核巧酸序列）/ AAF17077.U多膚序列）的已知的糖基轉移酶SbUGT85Bl，和來自水稻(0巧za sativa)的具 有Genbank ID號FM179712.U核巧酸序列）/CAQ77160.1(多膚序列）的已知的糖基轉移酶 OsCGT，在大腸桿菌菌株Xjb中表達并如Kannangara et al. (2011)和Augustin et al. (2012)所描述地制備粗大腸桿菌蛋白提取物并測試其對底物姻脂酬酸和黃姻脂酬酸的葡 糖化活性。
[0316]圖2顯示在包含表達SbUGT85Bl或OsCGT的大腸桿菌菌株)(化的粗裂解物，UDP-葡萄 糖和黃姻脂酬酸(FK)或姻脂酬酸化A)的測定中形成的葡糖化產物的LC-MS分析。
[0317] 對于兩種糖基轉移酶識別到KA糖巧(491m/z[M-H]-CA的m/z[M-H]值），對于OsCGT 識別到FK糖巧（473m/z[M-扣，DcII的m/z[M-扣值）。
[0；31引緝逆
[0319] 本實施例的結果表明，可W在高梁和水稻中識別到本文相關的糖基轉移酶(GT) 酶。
[0320] 換言之，高梁和水稻包含能夠糖基化黃姻脂酬酸W產生黃姻脂酬酸糖巧;和/或能 夠糖基化姻脂酬酸W產生姻脂酬酸糖巧的糖基轉移酶。
[0321] 實施例5內源性GT基因或GT活性的應用
[0322] 如本領域所已知的，能夠糖基化低分子量的糖基轉移酶存在于許多不同的有機體 中。使有機體的細胞的糖基轉移酶接觸低分子量化合物的方法是將引導低分子量化合物的 生物合成的一種或多種基因引入，從而使細胞糖基化低分子量化合物。低分子量化合物可 W是例如黃姻脂酬酸或姻脂酬酸或運些分子的修飾版本。
[0323] 將引導黃姻脂酬酸或姻脂酬酸的生物合成的一種或多種基因或運些分子的修飾 版本引入包含糖基轉移酶的有機體例如煙草植物，本氏煙(Nicotiana benthamiana)中。
[0324] 當根據(jù)D'Aoust等人描述的方法在例如植物組織中瞬時表達所述（多種）基因時， 產生了（多種)低分子量化合物。根據(jù)Gelvin(2003)中描述的方法制備和選擇穩(wěn)定表達所述 (多種)基因的細胞。
[0325] 在包含穩(wěn)定表達和/或瞬時表達(多種)基因的細胞中，低分子量化合物與內源糖 基轉移酶接觸，產生黃姻脂酬酸，姻脂酬酸或運些分子的修飾版本的一種或多種糖巧的形 成。
[0326] 糖巧的存在由實施例3中描述的提取和分析方法證實。
[0327] 通過由Raima Id和Sigle;r(1994)描述的提取方法制備用于LC/MS的樣品。
[032引緝逆
[0329] ^施例的結果表明，當將引導糖巧配基的生物合成的（多種）基因引入有機體 時，存在于重組有機體的細胞中的內源糖基轉移酶可用于轉換黃姻脂酬酸，姻脂酬酸或運 些分子的修飾版本成糖巧。
[0330] 換句話說，將引導黃姻脂酬酸，姻脂酬酸，運些分子的修飾版本，或相關的低分子 量化合物的生物合成的一種或多種基因引入是使所述低分子量化合物與糖基轉移酶接觸 的方法，從而是產生黃姻脂酬酸，姻脂酬酸或運些化合物的修飾版本的糖巧的方法。
[0331] 參考文獻；
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【主權項】
1. 一種分離的糖基轉移酶多肽，其能夠： (I) 綴合核苷酸激活的葡萄糖到黃胭脂酮酸(FK);和/或 (II) 綴合核苷酸激活的葡萄糖到胭脂酮酸(KA); 且其中所述糖基轉移酶多肽是選自由以下組成的組中的至少一種多肽： (a) 包含與SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少70%同一性的氨基酸序列的多肽； (b) 包含與SEQ ID NO:2的氨基酸20至468具有至少70%同一性的氨基酸序列的多肽； (c) 由在至少中等嚴格條件下與（i)SEQ ID ΝΟ:1的核苷酸1至1548或的互補鏈 雜交的多核苷酸所編碼的多肽;和 (d) SEQ ID NO:2的氨基酸1至515的片段，其具有在（I)和/或（II)中指定的糖基轉移酶 活性。2. 根據(jù)權利要求1所述的分離的糖基轉移酶多肽，其中權利要求1所述的分離的糖基轉 移酶多肽能夠： (I) 綴合葡萄糖到黃胭脂酮酸(FK);和/或 (II) 綴合葡萄糖到胭脂酮酸(KA)。3. 根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的分離的糖基轉移酶多肽，其中權利要求1所述 的分離的糖基轉移酶多肽是： (a)包含與SEQ ID NO:2的氨基酸1至515具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽。4. 根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的分離的糖基轉移酶多肽，其中權利要求1所述 的分離的糖基轉移酶多肽是： (a)包含與SEQ ID NO:2的氨基酸1至515具有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽。5. -種分離的多核苷酸，其包含編碼前述權利要求中的任一項所述的多肽的核苷酸序 列。6. -種包含權利要求5所述的分離的多核苷酸的核酸構建體，其可操作地連接到引導 所述多肽在表達宿主中產生的一種或多種控制序列。7. -種重組表達載體，其包括權利要求6所述的核酸構建體。8. -種重組宿主細胞，其包含權利要求7所述的核酸構建體。9. 根據(jù)權利要求8所述的重組宿主細胞，其中，所述重組宿主細胞是選自由絲狀真菌細 胞和微生物細胞組成的組的細胞，優(yōu)選地其中所述微生物細胞是酵母細胞，優(yōu)選地，其中所 述酵母細胞選自由由酵母屬（Saccharomyces spp)(例如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))和畢赤酵母屬(Pichia spp)組成的組。10. -種用于產生黃胭脂酮酸(FK)糖苷和/或胭脂酮酸(KA)糖苷的方法，其中所述方法 包括以下步驟： (A):在體外或體內在包含編碼糖基轉移酶的糖基轉移酶基因的重組宿主細胞中使： (al):黃胭脂酮酸(FK)與能夠糖基化黃胭脂酮酸的糖基轉移酶在產生黃胭脂酮酸糖苷 的合適條件下接觸;和/或 (a2):胭脂酮酸(KA)與能夠糖基化胭脂酮酸的糖基轉移酶在產生胭脂酮酸糖苷的合適 條件下接觸。11. 根據(jù)權利要求10所述的方法，其中， -步驟(al)中的糖基轉移酶是一種葡糖基轉移酶而且由此，在步驟(al)中產生黃胭脂 酮酸葡萄糖苷，并且其中所產生的黃胭脂酮酸糖苷是化合物Dell;和/或 -步驟(a2)中的糖基轉移酶是一種葡糖基轉移酶而且由此，在步驟(a2)中產生胭脂酮 酸葡萄糖苷，并且所產生的胭脂酮酸糖苷是胭脂紅酸。12. 根據(jù)權利要求10至11中的任一項所述的方法，其中，步驟(A)中的重組宿主細胞是 包含編碼糖基轉移酶的重組糖基轉移酶基因的重組宿主細胞并且其中所述方法包括進一 步的步驟(B)，其具有以下步驟： (B):純化步驟(al)和/或步驟(a2)中產生的糖苷，由此得到一種組合物，其中所述組合 物中至少50%w/w的化合物是所產生的黃胭脂酮酸糖苷和/或胭脂酮酸糖苷。13. 根據(jù)權利要求10至12中的任一項所述的方法，其中，權利要求1的步驟(A)中的接觸 是體內的，并且所述重組宿主細胞是酵母細胞，優(yōu)選地，其中所述酵母細胞選自由由酵母屬 (例如釀酒酵母)和畢赤酵母屬組成的組。14. 根據(jù)權利要求10至13中的任一項所述的方法，其中，所述糖基化轉移酶是膜結合 的。15. 根據(jù)權利要求10至14中的任一項所述的方法，其中，權利要求10的方法的步驟(A) 中的糖基化轉移酶是權利要求1至4中的任一項所述的糖基化轉移酶。
【文檔編號】C12N9/10GK106062186SQ201480075893
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月18日
【發(fā)明人】魯比尼·馬亞·坎南加拉, 馬斯·本內森, 比約恩·馬德森, 金姆·賓德魯普, 烏爾夫·特拉內, 拉斯穆斯·約翰·諾曼德·弗蘭森, 烏費·哈斯布羅·莫滕森, 比厄·林貝爾·默勒, 芬恩·蒂格·奧凱爾斯
【申請人】哥本哈根大學, 丹麥技術大學