一種二氟尼柳的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二氟尼柳的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的二氟尼柳的藥物組合物中含有二氟尼柳和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，二氟尼柳、化合物(Ⅰ)單獨作用時，可以提高CD4+細胞數(shù)及改善免疫功能調(diào)整免疫平衡，對艾滋病具有治療作用；二氟尼柳和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療艾滋病的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。
【專利說明】
一種二氟尼柳的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及二氟尼柳的新用途，具體涉及二氟尼柳的藥物組 合物及其在艾滋病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 二氟尼柳為水楊酸衍生物，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用，比阿司匹林鎮(zhèn)痛消炎作用 強且維持時間長，胃腸道刺激小。
[0003] 迄今為止，尚未見二氟尼柳及其藥物組合物與艾滋病的相關(guān)性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種二氟尼柳的藥物組合物，該藥物組合物中含有二氟尼 柳和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，二氟尼柳和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療艾滋病。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0008] -種二氟尼柳的藥物組合物，包括二氟尼柳、如權(quán)利要求1所述的化合物（I)和藥 學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0010] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將紅參粉碎，用75~85%乙醇 熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取， 分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用大 孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70 %乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫 液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離， 依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟 (c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到 化合物(I)。
[0012] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0013] 上述化合物(I)在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 上述二氟尼柳的藥物組合物在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0016] 本發(fā)明提供的二氟尼柳的藥物組合物中含有二氟尼柳和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn) 物，二氟尼柳、化合物（I)單獨作用時，可以提高CD4+細胞數(shù)及改善免疫功能調(diào)整免疫平衡， 對艾滋病具有治療作用；二氟尼柳和化合物（I)聯(lián)合作用時，治療效果進一步提高，可以開 發(fā)成治療艾滋病的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0018] 實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0019] 分離方法：（a)將紅參（2kg)粉碎，用80 %乙醇熱回流提?。?5L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (10個柱體積）、45:1 (8個柱體積）、25:1 (10 個柱體積)和15:1 (8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」4個組分；（d)步驟(c)中組分 4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1 (10個柱體積）、15:1 (8個柱體積)和1:1 (6個 柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0020] 結(jié)構(gòu)確證:冊431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 507.3062，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C32H44〇5，不飽和度為 12。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ppm，DMS〇-d6，600MHz): H-1 (6 · 06，d，J = 12.9Hz)，H-2(5.88，d，J=12.9Hz)，H-4(4.48，qd，J = 6.7,4.5Hz)，H-5(2.35，dd，J = 4.5， 3.3Hz)，H-6(6.52，dd，J=12.2,3.3Hz)，H-7(6.21，dd，J=12.2,3.7Hz)，H-8(2.03，d，J = 3.7Hz)，H-ll(1.50，m)，H-ll(2.10，m)，H-12(1.63，m)，H-12(1.71，m)，H-15(1.28，m)，H-15 (2.34，dd，J=14.9,7.3Hz)，H-16(5.32，m)，H-16b(2.05，s)，H-17(2.51，m)，H-18(1.08，s)， H-19(0.89，d，J = 4.3Hz)，H-19(0.98，d，J = 4.3Hz)，H-21(1.81，s)，H-22(6.61，s)，H-24a (5.85，s)，H-24a(6.04，s)，H-25(2.88，m)，H-26(1.03，d，J = 6.6Hz)，Η-27(1· ll，d，J = 6 · 6Hz)，H-28 (1 · 27，d，J = 6 · 7Hz)，H-30 (0 · 99，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)心（卯m，DMS〇-d6， 150MHz):153.3(CH，l-C)，121.2(CH，2-C)，168.5(C，3-C)，79.5(CH，4-C)，44.6(CH，5-C)， 133.7(CH，6-C)，129.5(CH，7-C)，54.6(CH，8-C)，30.2(C，9-C)，37.0(C，10-C)，28.5(CH2， 11-C)，32.6(CH2，12-C)，45.2(C，13-C)，47.3(C，14-C)，46.9(CH2，15-C)，77.1(CH，16-C)， 170.2(C，16a-C)，22.3(CH 3，16b-C)，59.5(CH，17-C)，18.5(CH3，18-C)，32.5(CH2，19-C)， 162.4(C，20-C)，16.8(CH 3,21-C)，126.6(CH，22-C)，194.8(C，23-C)，154.3(C，24-C)，119.8 (CH2,24a-C)，29.5(CH，25-C)，22.1(CH 3,26-C)，21.8(CH3,27-C)，18.8(CH3,28-C)，20.1 (CH 3，30-C)。IR譜圖中的1715cnf1與1694cnf1吸收帶表明該化合物結(jié)構(gòu)中存在羰基與共輒羰 基;UV譜圖中的最大吸收207nm與245nm說明結(jié)構(gòu)中存在共輒雙鍵。氫譜核磁數(shù)據(jù)表明該結(jié) 構(gòu)中不飽和度是由四個C-C雙鍵結(jié)構(gòu)，三個羰基結(jié)構(gòu)以及五個環(huán)狀骨架組成。碳譜核磁數(shù)據(jù) 與DEPT譜數(shù)據(jù)表明該化合物結(jié)構(gòu)中含有32個碳，其中有七個甲基，五個亞甲基(一個烯屬亞 甲基δ〇119.8)，^^一個次甲基(五個烯屬碳δ〇153.3、121.2、133.7、129.5、126.6,兩個連氧碳 δ〇79.5與77.1)，九個季碳(一個酮基δ。194.8,兩個酯羰基δ。168.5與170.2,兩個烯屬季碳 162.4與154.3)。核磁數(shù)據(jù)表明該化合物含有一個具有甲基側(cè)鏈的α，β-不飽和七元內(nèi)酯 環(huán)結(jié)構(gòu)[3 116.06((1，了=12.9!^，!1-1)，5.88((1，了=12.9抱，!1-2)，4.48(9(1，了 = 6.7,4.5!^，!1-4)，2.35(dd，J = 4.5,3.3Hz，H-5)，1.27(3H，d，J = 6.7Hz，H-28);Sc153.3(C-l)，121.2(C- 2)，168.5(C-3)，79.5(C-4)，44.6(C-5)，37.0(C-10)，18.8(C-28)]，一個環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)[δ η0.89(d，J = 4.3Ηζ，Η-19)，0· 98(d，J = 4.3Hz，H-19);SC30.2(C-9)，37.0(010)，32.5(C-19)]，一個乙酰氧基[5 112.05(8，!1-1613,3!04。170.2((：-163)，22.3((：-1613)]，一個末端雙鍵 [3 115.85(8，!1-24&)，6.04(8，!1-24&);3。154.3((：-24)，119.8((：-24&)]，一個順式雙鍵[3[ 16.52 (dd，J=12.2,3.3Hz，H-6)，6.21(dd，J=12.2,3.7Hz，H-7);S c133.7(C-6)，129.5(C-7)]，一 個三取代雙鍵[3116.61(8，!1-22) ;3。162.4((：-20)，126.6((：-22)]。腿8(：譜中，!1-160[15.32)與 016 &說170.2)的相關(guān)性表明(：-16說77.1)位連有一個乙酰氧基。通過1^3￥譜數(shù)據(jù)解析!1-4(δΗ 4.48)、Me-28(δΗ 1.27)與H-5 (δΗ2.35)的關(guān)系可以說明28-甲基相對立體構(gòu)型。綜合氫 譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所 示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原 子編號如下：
p
[0022] 實施例2:藥理作用
[0023] 本實施例使用SIVmac病毒液靜脈接種恒河猴制備艾滋病模型猴模型，觀察藥物提 高CD4+細胞百分?jǐn)?shù)及CD 4+/CD8+比值，并促進T、B淋巴細胞增殖等方面的抗艾滋病作用。
[0024] 1、材料與方法
[0025] 1.1動物
[0026] 恒河猴5~7kg，雄性健康，感染前經(jīng)PCR檢測無 SIV陽性，血常規(guī)正常，由中國醫(yī)學(xué) 科學(xué)院實驗動物研究所提供。
[0027] 1.2試劑與樣品
[0028] 二氟尼柳購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實施例1。單 克隆抗體，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物制劑發(fā)展中心。AZT (疊氮胸苷)購自Burroughs。
[0029] 1.3儀器
[0030] FACS420型流式細胞儀測定(美國B.D公司KTMRMC型酶標(biāo)儀。
[0031] 1.4猴分組及模型制備
[0032] SIVmac感染成功動物隨機分組，分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組(AZT 組50mg · kg-"、二氟尼柳組（80mg · kg-1化合物（I)組（80mg · kg-1二氟尼柳與化合物 (I)組合物組【40mg · kg"1二氟尼柳+40mg · kg^1化合物（I)】。感染后2周給藥，藥物組每日按 照上述劑量給藥;正常對照組，每日給生理鹽水等量。每組每日給藥一次，插胃管灌入。給藥 時間為兩個月一個療程，共觀察18周，然后解剖進行病理觀察。
[0033] 1.5T淋巴細胞亞群測定實驗
[0034]以單克隆抗體直接標(biāo)記動物外周血CD4+，CD8 +細胞，按產(chǎn)品說明書操作，采用 FACS420型流式細胞儀測定。微機處理分析陽性率，并計算⑶4+/⑶8細胞比值。
[0035] 1 · 6MTT法觀察T、B淋巴細胞增殖實驗
[0036]①無菌取猴靜脈血2ml，肝素抗凝，分離單個核細胞，調(diào)整細胞數(shù)IX 105/ml。②將 調(diào)整細胞懸液種植在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，200μ1/孔，并分別加入不同有絲分裂原誘導(dǎo)淋巴細胞 分化，ConA5μg/ml，LPS30μg/ml濃度，培養(yǎng)48h后加入MTT(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入酸化異 丙醇(0.04mol/L)，利用TMRMC型酶標(biāo)儀檢測，波長570~630nm。
[0037] 1.7統(tǒng)計學(xué)方法
[0038]實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差 分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0039] 2、實驗結(jié)果
[0040] 2 · 1對SIV感染動物⑶4+細胞的影響
[0041 ]應(yīng)用單克隆抗體直接熒光標(biāo)記⑶4+，CD8+細胞，流式細胞儀檢測，結(jié)果表明SIVmac 感染4周時模型對照組⑶4+及⑶4+/CD8+比值下降(P<0.01);與模型對照組比較，二氟尼柳與 化合物（I)組合物組和陽性對照組⑶ 4+及⑶4+/⑶8+比值顯著上升(P<〇.01);與模型對照組 比較，二氟尼柳組、化合物（I)組⑶ 4+及⑶4+/CD8+比值上升(P<0.05)。見下表。
[0042] 2.2對SIV模型動物T淋巴細胞分化增殖的影響
[0043]與正常對照組比，模型對照組在感染4周時，T細胞對ConA誘導(dǎo)分化增殖反應(yīng)明顯 下降，與感染前相比有明顯差異(p〈0.01)。與模型對照組比較，二氟尼柳與化合物（I)組合 物組和陽性對照組T細胞對有絲分裂原刺激的反應(yīng)能力顯著提高，T細胞明顯回升（P< 〇.〇1);與模型對照組比較，二氟尼柳組、化合物（I)組T細胞回升(P<0.05)。
[0044] 結(jié)果見下表。
[0045] 2.3對SIV模型動物B淋巴細胞分化增殖的影響
[0046] 與正常對照組比較，模型對照組在感染4周時，與感染前相比B細胞功能受損，增殖 反應(yīng)低于感染前(P〈〇.01)。與模型對照組比較，二氟尼柳與化合物（I)組合物組和陽性對照 組B細胞增殖顯著上升(P<0.01);與模型對照組比較，二氟尼柳組、化合物（I)組B細胞增殖 上升(P<0.05)。結(jié)果見下表。
[0048]艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥，由艾滋病毒感染所致，目前國際上采用哈特 療法(HAART)，即幾種優(yōu)勢互補西藥聯(lián)合應(yīng)用，是公認(rèn)的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療藥物，但還 是不能使病毒徹底殺滅，而且副作用多，使患者生活質(zhì)量下降。猴免疫缺陷病毒(SIV)誘發(fā) 猴艾滋?。⊿AIDS)感染實驗動物模型，是1989年經(jīng)WHO專家推薦抗艾滋病藥物治療動物模 型，它在病原學(xué)，臨床、病理、免疫學(xué)及發(fā)病機理等方面與人感染艾滋病極為相似，國外已較 多用于評價抗艾滋病藥物的效果。
[0049] ⑶4+細胞是維護機體免疫功能的重要細胞，也是SIV破壞的主要細胞，因此⑶4+陽 性細胞數(shù)降低對免疫缺陷進展有直接關(guān)系。它的數(shù)量及功能變化是評價疾病發(fā)展和藥物療 效的重要指標(biāo)。正常人體CD4+細胞與CD8+細胞相對制約維持機體的免疫平衡，由于HIVAIDS 患者⑶4+細胞數(shù)量不斷減少及功能受損至使⑶4+⑶8+細胞比例倒置，CD8+細胞較⑶4+細胞相 對占優(yōu)勢，增強免疫抑制作用，造成免疫功能失調(diào)，如HIV進一步侵犯機體其它免疫細胞，即 會導(dǎo)致機體免疫功能缺陷。由于病毒在體內(nèi)持續(xù)不斷的復(fù)制，破壞機體免疫細胞，致使SIV 模型動物外周血CD4+細胞數(shù)量明顯降低。CD4+細胞被破壞，數(shù)量減少，淋巴細胞正常功能受 到抑制，致使T淋細胞對有絲分裂原誘導(dǎo)反應(yīng)能力降低，感染SIV動物B細胞對細菌脂多糖 LPS反應(yīng)能力也下降，但不及T細胞明顯，呈遲緩下降趨勢。
[0050] 上述結(jié)果表明，二氟尼柳、化合物（I)單獨作用時，可以提高CD4+細胞數(shù)及改善免 疫功能調(diào)整免疫平衡，對艾滋病具有治療作用；二氟尼柳和化合物（I)聯(lián)合作用時，治療效 果進一步提高，可以開發(fā)成治療艾滋病的藥物。
[0051] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種二氟尼柳的藥物組合物，其特征在于:包括二氟尼柳、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的二氟尼柳的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的二氟尼柳的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將紅 參粉碎，用75~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯 和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫12 個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。7. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2~4任一所述的二氟尼柳的藥物組合物在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號】A61P31/18GK106046112SQ201610493013
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】胡逸穹
【申請人】胡逸穹