一種金銀花提取物中摻雜杜仲的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種杜仲分子身份證，所述分子身份證中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用本發(fā)明所提供的分子身份證和方法可以準(zhǔn)確的判定金銀花提取物以及以金銀花提取物入藥的中成藥中是否摻有杜仲提取物或杜仲葉，本發(fā)明所提供的方法適用性更廣，能檢測(cè)所有能提取出DNA的任何樣品。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)金銀花提取物的快速、準(zhǔn)確鑒定。
【專利說明】
-種金銀花提取物中慘雜杜仲的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于中藥材來源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種應(yīng)用分子身份證鑒定金 銀花提取物中滲雜杜仲的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金銀花Lonicera japonica，又稱忍冬花，為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開 的花。金銀花W花入藥，性寒，味甘，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱功效。臨床用于溫?zé)岢跗冢髦?外感風(fēng)熱，咽喉腫痛之癥。金銀花含有揮發(fā)油，黃酬，Ξ祗類和綠原酸等化學(xué)成分，其中綠原 酸具有抗菌、抗病毒、利膽、保肝、降壓、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用，能增加腸胃蠕動(dòng)能力，并 能促進(jìn)胃液分泌及膽汁分泌等，綠原酸的水解產(chǎn)物咖啡酸亦有增加白細(xì)胞和抗氧化作用， 在臨床上用于治療多種急性細(xì)菌性感染和放、化療所致的自細(xì)胞減少癥有顯著效果。由于 金銀花中綠原酸的特殊功效，市場(chǎng)上常將綠原酸含量多少作為評(píng)定金銀花質(zhì)量好壞的標(biāo) 準(zhǔn)。金銀花提取物的規(guī)格W綠原酸計(jì)，從5%-95%不等。含綠原酸的越高，則價(jià)格越高。杜仲 Eucommia ulmoides Oliver為杜仲屬唯 種植物，杜仲葉片中綠原酸含量較為豐富，達(dá) 1%-5.5%。更易提取，因此成本更低。為了增加金銀花提取物中綠原酸的含量，市場(chǎng)上經(jīng)常 出現(xiàn)將杜仲葉片或者杜仲葉片提取物加入金銀花提取物中提升綠原酸濃度的現(xiàn)象。金銀花 性寒，味甘，入肺、屯、、胃經(jīng)，而杜仲性溫，歸肝，腎經(jīng)。二者在功效上有很大區(qū)別。應(yīng)用顯微觀 察或者化學(xué)手段如薄層色譜，高效液相色譜等方法無法準(zhǔn)確鑒別金銀花提取物中是否滲有 杜仲提取物。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)管方法，市場(chǎng)上提取物造假越來越嚴(yán)重，約50 % -80 %提取 物產(chǎn)品存在造假現(xiàn)象。提取物市場(chǎng)被業(yè)內(nèi)人±稱為"邪惡市場(chǎng)"。因此，急需要建立一種新金 銀花提取物的鑒定方法。
[0003] 分子鑒定已廣泛應(yīng)用于中藥材鑒定，而針對(duì)提取物而言，DNA降解嚴(yán)重，擴(kuò)增長(zhǎng)序 列存在一定的困難。Shaw等的研究結(jié)果表明人參在煎煮兩小時(shí)后只能擴(kuò)增獲得短片段。本 發(fā)明開發(fā)了一段杜仲特異的分子身份證，片段長(zhǎng)度為34bp，用于鑒定金銀花提取物W及W 金銀花提取物入藥的中成藥中是否滲雜杜仲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)鑒別技術(shù)中存在的上述缺陷并提供一種結(jié)果準(zhǔn)確靈 敏，鑒定過程簡(jiǎn)便快速的杜仲鑒定方法。本發(fā)明所利用的分子身份證是根據(jù)杜仲單屬單種 的特性，在DNA序列中經(jīng)過篩選和與blastn比對(duì)后確定了一段34bp的杜仲分子身份證序列， 該分子身份證具有種內(nèi)保守、種間變異較大的特點(diǎn)。經(jīng)過BLAST分析，證明該分子身份證為 杜仲特有，序列相似度為IdentlOO% (見圖1)，與其它物種的序列相似度較低。若未知樣品 DNA擴(kuò)增獲得此段分子身份證，則可判定樣品中含有杜仲。
[0005] 本發(fā)明提供了一種從金銀花提取物中鑒定是否滲雜有杜仲的鑒定方法，其中，所 述方法包括檢測(cè)樣品基因組DNA中是否存在本發(fā)明所述的分子身份證。當(dāng)存在所述分子身 份證時(shí)，鑒定待測(cè)樣品中滲雜有杜仲提取物或杜仲葉。
[0006] 可選的，所述方法包括如下步驟：
[0007] 1) W待測(cè)樣品的基因組DNA為模板，對(duì)所述分子身份證進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn) 物；
[0008] 2)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，拼接后去除引物區(qū)獲得擴(kuò)增片段，檢測(cè)擴(kuò)增片段中是否 存在所述分子身份證，如果含有此分子身份證，則證明金銀花提取物中滲有杜仲。
[0009] 本發(fā)明對(duì)于PCR所使用的引物有特別的限制，因杜仲為單屬單種，特異性較高，因 此在PCR擴(kuò)增的過程中為了達(dá)到目的條帶的準(zhǔn)確性，采用?？谠O(shè)計(jì)的特異引物。所述PCR擴(kuò) 增使用的引物為：
[0010] DZF1 5'-GAGTCTTTGAACGCAAGTTG-3'
[0011] DZR1 5'-GACGGCACGGATGCTTAA-3 '
[0012] 上述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0013]
[0014] 可選的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：
[0015] PCR Buffer(10X)2.扣L，Mg 化化L(25mmol/L)，dNTPs 混合物化L(2.5mmol/L)，引 物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNAl化(-約30ng)，TaqDNA聚合酶1.0U，加滅菌雙蒸水至25μ L，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0016] 其中，所述待測(cè)樣品包括金銀花提取物W及主要成分為金銀花的中成藥品（膠囊， 顆粒)。
【附圖說明】
[0017] 圖 1 所示為杜仲 E. ulmoides 分子身份證 5 ' -CTAGCGGTGGTCGTACGATAGCCAATGCATGAG T-3'的比對(duì)結(jié)果。
[0018] 圖2所示為金銀花提取物的擴(kuò)增結(jié)果：利用特異性引物DZF1/R1在金銀花提取物 DNA中擴(kuò)增出含有杜仲分子身份證片段，樣品共12個(gè)。通道1-8為山東產(chǎn)的金銀花提取物樣 品（樣品編號(hào)JY服1-S8)，通道9，10是西安產(chǎn)的金銀花提取物樣品（樣品編號(hào)JY服9-S10)，通 道11，12是長(zhǎng)沙產(chǎn)的金銀花樣品（樣品編號(hào)1￥服10-511)。
[0019] 圖3所示為含金銀花的中成藥的擴(kuò)增結(jié)果:利用特異性引物DZF1/R1在含有金銀花 的中成藥的DNA中擴(kuò)增出含有杜仲分子身份證片段，樣品一共5個(gè)。通道1，2為小兒咽扁顆粒 (樣品編號(hào)XEYBP)，通道3,4為雙黃連顆粒(樣品編號(hào)甜LP)，通道5,6為鈴羊清肺顆粒(樣品 編號(hào)LYQFP)，通道7，8為銀黃顆粒（樣品編號(hào)YHP)，通道9,10為茵檐黃軟膠囊（樣品編號(hào) YZHSC) 〇
[0020] 杜仲序列表中列出的為杜仲化.ulmoides)的分子身份證。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 實(shí)施例1用于說明杜仲分子身份證鑒定的真實(shí)性
[0023] 1)DNA 的獲取
[0024] 從不同產(chǎn)地收集的金銀花樣品21份，杜仲樣品24份。分別取20mg藥材，在MM400球 磨儀(德國(guó)Retsch)上進(jìn)行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒 提取總DNA。
[00巧]2)PCR擴(kuò)增
[00%]正向引物DZF1 5'-GAGTCTTTGAACGCAAGTTG-3'
[0027]反向引物DZR1 5' -GACGGCACGGATGCTTAA-3 '
[002引由生工生物工程公司有限公司（北京)合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2.扣 mol/yL。
[0029] 25化反應(yīng)體系：PCR Bufferα0X)2.5化，Mg2+2化（25mmol/L)，dNTPs混合物化L (2.5mmo 1 /L)，引物各 1.0化（2.5皿01 /L)，模板DNA 1 化（-約 30ng)，Taq DNA聚合酶 1.0U，加 滅菌雙蒸水至25化，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0030] PCR反應(yīng)程序:在PCR儀上按照W下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：
[0031]
[0032] 3)測(cè)序
[0033] PCR產(chǎn)物直接送中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大工程實(shí)驗(yàn)室測(cè)序。測(cè)序引物為和。為確保DNA 條形碼序列的可靠性，需要進(jìn)行正反向測(cè)序或重復(fù)測(cè)序，然后將正反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接 獲得DNA條形碼序列。
[0034] 4)序列拼接
[00：3日]本實(shí)施例采用應(yīng)用軟件CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co.，Ge;rmany)進(jìn) 行序列拼接及校對(duì)。首先，進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理，即去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部 分，并對(duì)剩余部分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，如果滿足質(zhì)量要求，方可用于序列拼接，具體方法是 20bp的窗口分別從序列5'端和3'端進(jìn)行滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)有多于2個(gè)堿基的Q值小于20，貝。 刪除一個(gè)堿基，窗口繼續(xù)滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)堿基Q值小于20的數(shù)目小于或等于2個(gè)，窗口停止 滑動(dòng)。
[0036] 5)同屬近緣種序列比對(duì)
[0037] 用MEGA 5軟件對(duì)測(cè)序并拼接后的各個(gè)樣品W及GenBank中杜仲ITS2序列進(jìn)行比 對(duì)，杜仲樣品的ITS2序列包含CTAGCGGTGGTCGTACGATAGCCAATGCATGAGT，且杜仲為單屬單種， 特異性很高，而包括金銀花在內(nèi)的任何其它物種均不具有此分子身份證(圖1)。
[0038] 實(shí)施例2金銀花提取物中杜仲成分的鑒定
[0039] 采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行鑒定，所不同的是W金銀花提取物為樣品，本次所 選擇的樣品來自山東莊河、陜西西安、W及湖南長(zhǎng)沙。共計(jì)12批次，見表1。提取基因組DNA， 應(yīng)用杜仲特異引物DZF1/DZR1進(jìn)行擴(kuò)增（如圖2)并測(cè)序，在序列中查找杜仲分子身份證。研 究結(jié)果表明：10/12份金銀花提取物中均檢測(cè)到了杜仲分子身份證，山東莊河和長(zhǎng)沙產(chǎn)的金 銀花提取物均滲雜有杜仲;西安2個(gè)樣品沒有擴(kuò)增到目的片段。說明應(yīng)用此方法可W判斷金 銀花提取物中是否滲雜杜仲提取物或葉片。
[0040] 表1金銀花提取物采樣表
[0041]
[0042] 實(shí)施例3W金銀花為主要成分中成藥品的鑒定
[0043] 采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行鑒定，所不同的是W含金銀花的中成藥(膠囊，顆 粒)為樣品，見表2,運(yùn)些樣品在《中華人民共和國(guó)藥典》中的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)都是W綠原酸計(jì)。提取 中成藥基因組DNA，應(yīng)用杜仲特異引物DZF1/DZR1進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，在序列中查找杜仲分子 身份證，結(jié)果表明小兒咽扁顆粒、雙黃連顆粒、鈴羊清肺顆粒和銀黃顆粒擴(kuò)增出含有杜仲分 子身份證的片段，目的片段大約為20化p"V5中成藥能特異性地檢測(cè)到杜仲分子身份證，說 明在W綠原酸為金銀花含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的中成藥中滲假現(xiàn)象比較嚴(yán)重。
[0044] 表2含金銀花中成藥取樣表
[0045]
[0046] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 杜仲分子身份證，其特征在于，所述分子身份證中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸 序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子身份證，其特征在于，所述分子身份證為SEQ ID No.1所 示的核苷酸序列。3. -種金銀花提取物的鑒定方法，其特征在于，所述方法包括檢測(cè)樣品基因組DNA中是 否存在權(quán)利要求1-2中任意一項(xiàng)所述的分子身份證，如果含有則判斷金銀花提取物中摻有 杜仲提取物或杜仲葉。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，對(duì)所述分子身份證進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； 2) 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，拼接后去除引物區(qū)獲得擴(kuò)增片段，檢測(cè)擴(kuò)增片段中是否存在 所述分子身份證。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，檢測(cè)擴(kuò)增片段中是否存在SEQ ID No.1所 示的核苷酸序列。6. 權(quán)利要求1-2所述的分子身份證序列或權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的鑒定方法在 金銀花提取物鑒定中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011231SQ201610310759
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】韓建萍, 高梓童, 宋經(jīng)元, 陳士林
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所