一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用表達(dá)了L?賴氨酸2?單加氧酶DavB和δ?戊酰胺水解酶 DavA的大腸桿菌細(xì)胞作為催化劑，生物催化生產(chǎn)5?氨基戊酸的方法，是對表達(dá)了DavBA的E.coliBL21（DE3）進行低溫誘導(dǎo)表達(dá)，集菌，然后將其作為催化劑，在緩沖體系中，使體系中細(xì)胞OD600nm為5?90，賴氨酸濃度為0?400g/L，并在金屬離子及表面活性劑的輔助下，全細(xì)胞催化生產(chǎn)5?氨基戊酸的方法。本發(fā)明解決了發(fā)酵法生產(chǎn)周期長，代謝產(chǎn)物復(fù)雜，底物轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)物分離提取困難，及能耗高的問題，也解決了酶法催化中級聯(lián)催化過程不易實現(xiàn)的不足，提高了催化效率，同時省去了繁瑣的酶純化過程，生產(chǎn)成本更低。
【專利說明】
一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種高效全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，特別是涉及一種利用表達(dá)了L-賴氨酸2-單加氧酶DavB和S-戊酰胺水解酶DavA的大腸桿菌細(xì)胞作為催化劑， 生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。【背景技術(shù)】
[0002]5-氨基戊酸是一種重要的C5平臺化合物，在醫(yī)藥方面有著廣泛的應(yīng)用，例如可以作為合成5-羥基戊酸、戊二酸、1，5-戊二醇及其衍生物、戊二酸酐的重要前體，同時，它也可以用于合成尼龍_5,5(尸胺和戊二胺的共聚物)和尼龍-5(5-氨基戊酸均聚物)所以，5-氨基戊酸在紡織工業(yè)以及醫(yī)藥合成領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
[0003]目前，5-氨基戊酸的制備方法中，已有采用惡臭假單胞菌中來源的L-賴氨酸2-單加氧酶Dav B和5-戊酰胺水解酶DavA雙酶催化L-賴氨酸制備5-氨基戊酸的報道 (Enzymatic product1n of5-aminovalerate from L-lysine using L-lysine monooxygenase and5-aminovaleramide amidohydrolase)L_賴氛酸2-單加氧酶DavB和S-戊酰胺水解酶DavA的工程大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，并將獲得的細(xì)胞懸液中蛋白進行分離純化，分別得到L-賴氨酸2-單加氧酶DavB和S-戊酰胺水解酶 DavA，將DavBA作為催化劑催化L-賴氨酸生成5-氨基戊酸，但此方法酶的純化過程相對繁瑣，且5-氨基戊酸的最終摩爾收率較低，制備成本較高。
[0004]Sijae等人采用來源于惡臭假單胞菌的DavBA片段與表達(dá)載體PKE112相連(High-level convers1n of L-lysine into 5-aminovalerate that can beused fornylon6,5 synthesis)，得到重組質(zhì)粒pKE112_DavBA，構(gòu)建到i?.co^i WL3110中，重組菌經(jīng)高密度分批培養(yǎng)，待〇D至60時補加120g/L L-賴氨酸，96h后，5-氨基戊酸積累至90.59g/L，此方法采用發(fā)酵法與全細(xì)胞相耦合的催化體系，但此方法耗時較長，且存在繼續(xù)補加L-賴氨酸時，體系中PH會迅速上升，需立刻加入大量HC1來降低PH，因此限制了 5-氨基戊酸的進一步積累。
[0005]Park等人采用來源于惡臭假單胞菌的DavBA片段與表達(dá)載體pKEl 12相連，得到重組質(zhì)粒pKE112-DavBA，構(gòu)建到五.coh￥L3110中，重組菌在含有10 g/LL-賴氨酸的MR培養(yǎng)基中發(fā)酵48小時，5-氨基戊酸產(chǎn)量達(dá)到30.7mM( Metabolic engineering of Escherichia coli for the product1n of5-aminova1 erateand glutarate as C5platform chemicals.Metab Eng2013.16,42-47)。此方法采用全細(xì)胞催化反應(yīng)體系，但 5_氨基戊酸產(chǎn)量很低，且反應(yīng)周期較長。
[0006]Jake等人采用來源于惡臭假單胞菌的DavBA片段與表達(dá)載體pSTV相連，得到重組質(zhì)粒pSTV-davBA，構(gòu)建到五.co^i BW25113(DE3)中，在48h內(nèi)，重組菌將2.25g/L的L-lys，轉(zhuǎn)化生成了〇.86g/L 5_氨基戊酉愛(Engineering Escherichia coli for Renewable Product1n of the 5-Carbon Polyamide Building-BlocksandGlutarate)〇此法米用發(fā)酵法的催化體系，5-氨基戊酸的產(chǎn)量較低，耗時較長。
[0007]經(jīng)檢索，一種高效利用全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法尚未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明需要解決的問題是提供一種高效全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，包括以下步驟:(1)構(gòu)建并篩選過表達(dá)DavBA菌株；(2)將步驟(1)構(gòu)建的菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)并集菌，濃縮至細(xì)胞0D6QQnmS0-90，添加L-賴氨酸、 表面活性劑和金屬離子催化生產(chǎn)5-氨基戊酸。
[0009]步驟(1)所述過表達(dá)DavBA菌株的構(gòu)建方法是:將davA片段與表達(dá)載體pET-22b相連，將davB片段與表達(dá)載體pRSF-dute相連，分別得到重組質(zhì)粒pET-22b-DavA和pRSF-davB， 將重組質(zhì)粒pET-22b-DavA和pRSF-davB導(dǎo)入五.BL21的感受態(tài)細(xì)胞中，得到過表達(dá)了 davBA的重組菌BL-22A-RB;另外將davA及davB片段與表達(dá)載體pET-22b相連，得到重組質(zhì)粒 pET22b-DavBA，將重組質(zhì)粒pET22b-DavBA導(dǎo)入[BL21的感受態(tài)細(xì)胞中，得到過表達(dá)了 davBA的重組菌Eco2iBL-22AB;將davA片段與表達(dá)載體pRSF-dute相連，得到重組質(zhì)粒 pRSF-DavA，將重組質(zhì)粒pRSF-DavA導(dǎo)入重組菌五.co^iBL-22AB的感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株五.co2iBL-22AB-RA;最后，將davB片段與表達(dá)載體pACYC-dute相連，得到重組質(zhì)粒pACYC-davB，將重組質(zhì)粒pACYC-davB導(dǎo)入重組菌BL-22A-RB的感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株五.co』iBL-22A-RB-YB。[〇〇1〇]所述的篩選方法為:將重組菌進行低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到過表達(dá)了 davBA的工程菌細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液在6000g條件，離心5min，得到靜息細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞作為催化劑，在相同的催化體系及條件下進行全細(xì)胞催化，得到5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液，采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測5-氨基戊酸的濃度并計算最終的摩爾收率，篩選出催化速率最快，摩爾收率最高的菌株作為后續(xù)催化菌株。經(jīng)檢測，四株重組菌株中，重組菌株BL-22A-RB-YB催化速率最快并將此重組菌株作為后續(xù)催化菌株進行低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)并收集細(xì)胞作為催化劑。[〇〇11 ]具體地，所述的表面活性劑為SDS，Triton X-100，Tween-20，Tween-80中的一種或幾種，優(yōu)選Triton X-100。[0〇12]所述的金屬離子為Fe2+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+中的一種或幾種。
[0013]所述L-賴氨酸的初始添加量為60?400g/L，優(yōu)選160g/L。所述的催化反應(yīng)在通氧速率為2 ? 5vvm，37 °C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm條件下反應(yīng)。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:這種高效利用全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法中，通過調(diào)節(jié)DavBA片段的構(gòu)建方式，篩選出了最優(yōu)的構(gòu)建方式，相比于原始菌株BL-22A-RB，菌株i co2iBL-22A-RB-YB使5-氨基戊酸得摩爾收率提高了22.03%，其次通過細(xì)胞通透劑的添加，解決了 L-賴氨酸向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的傳質(zhì)阻力問題，使5-氨基戊酸的積累速率有了一定的提升，再者通過金屬離子的篩選，篩選出的Ca2+，Mn2+對酶的活性有進一步的提升，使 5_氨基戊酸的摩爾收率分別提高了 15.11 %，15.48%，最后通過分批補料解決了底物L(fēng)-賴氨酸對酶活的抑制，最終得到了一種高效全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法。【附圖說明】[〇〇15]圖1 ODsoo?為40，L_賴氨酸130g/L，5-氨基戊酸的生成情況。[〇〇16]圖2 ODsoo?為40，L-賴氨酸150g/L，5-氨基戊酸的生成情況。
[0017]圖3 0D_?為40,初始L-$負(fù)氨酸160g/L，多次補加賴氨酸鹽酸鹽后5-氨基戊酸的生成情況?！揪唧w實施方式】
[0018]實施例1:5_氨基戊酸的液相檢測方法樣品的檢測:色譜柱:GRACE C18(5ul，5wn，4 ? 6mm X 250mm)，柱溫:28 ? 5 °C，流動相:0 ? 7% (v/v)三氟乙酸水溶液，流速:lml/min，檢測器:蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD);檢測器溫度:115 °C，載氣:氮氣(純度99.9%)，載氣流速:3.2L/min，進樣體積:10ul。[〇〇19]實施例2:過表達(dá)DavBA菌株的構(gòu)建過程五.co2iBL-22A-RB菌株的構(gòu)建過程:(1 )davA由金唯智合成，酶切位點為Ndel和HindllI，將davA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel 和Hindll I處理回收后，與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的載體pET-22b相連，使用T4DNA連接酶 25°C 連接 30min。[0〇2〇](2)將(1)中的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 1-T1(由全式金生物技術(shù)有限公司提供)的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有氨芐青霉素抗性的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。
[0021](3)挑取(2)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基里，然后提取質(zhì)粒，再利用限制性內(nèi)切酶Ndel和Hindlll進行酶切驗證，最后得到了載體pET-22b-davA〇[〇〇22](4)將步驟(3)中得到的載體pET-22b-davA轉(zhuǎn)入BL2UDE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，并將其涂布在帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。
[0023](5)挑取(4)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基里，得到表達(dá)了 davA的菌株，并將其做成感受態(tài)細(xì)胞。[〇〇24](6)davB由金唯智合成，酶切位點為NdeI和Xhol，將davB片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和Xhol處理回收后，與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的載體pRSFDuet-1相連，使用T4DNA連接酶 25°C 連接 30min。[〇〇25](7)將(6)中的連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transl-Tl的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有卡那霉素抗性的LB平板，37 °C過夜培養(yǎng)。[〇〇26](8)挑取(7)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基里，然后提取質(zhì)粒，再利用限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol進行酶切驗證，最后得到了載體pRSFDuet-davB〇[〇〇27](9)將載體pRSFDuet-davB轉(zhuǎn)入到步驟(5)中的表達(dá)了davA的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有氨芐青霉素抗性和卡那霉素抗性的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。
[0028](10)挑取(9)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性和卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基里培養(yǎng)8-10h后，用30%的甘油保存在-80°C冰箱里，得到了 ic〇JiBL-22A-RB 菌株五.co2iBL21(DE3) pET 22b- davAB菌株的構(gòu)建過程:(1)酶切位點為Xmal和Agel的davA片段的獲??；(2)davA由金唯智合成，酶切位點為Ndel和Hindlll。[〇〇29](3)所用引物為:davA-F: ggCCCGGGcgCCTAGGCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG，含 Xmal 酶切位點； davA-R: cccACTAGTggACCGGTCAAAAAACCCCTCAAGACCCG，含 Age I 酶切位點。
[0030](4)經(jīng)過PCR，將得到的PCR產(chǎn)物連接到經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Xmal和Age頂每切過的載體pET-22b上，并將連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transl-Tl的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，37 °C過夜培養(yǎng)。[〇〇31](5)挑取(4)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，然后提取質(zhì)粒，再利用限制性內(nèi)切酶Xmal和Agel進行酶切驗證，最后得到了載體pET-22b-davA〇[〇〇32](6)davB由金唯智合成，酶切位點為NdeI和Xhol，將davB片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和Xhol處理回收后，與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的載體pET-22b-davA相連，使用T4DNA連接酶 25°C 連接 30min。[〇〇33](7)將(6)中的連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transl-Tl的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。[〇〇34](8)挑取(7)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基里，然后提取質(zhì)粒，再利用限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol進行酶切驗證，最后得到了載體pET-22b-davA-davB〇[〇〇35](9)將載體pET-22b-davA-davB轉(zhuǎn)入到五.co^iBL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有氨芐青霉素抗性的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。
[0036](10)挑取(9)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基里培養(yǎng)8-10h后，用30%的甘油保存在-80°C冰箱里，得到了五.co2iBL-22AB菌株五.co2iBL-22A-RB-YB菌株的構(gòu)建:(1 )davA由金唯智合成，酶切位點為Ndel和HindllI，將davA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel 和Hindlll處理回收后，與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的載體pRSFDuet-1相連，使用T4DNA連接酶25°C連接30min。[〇〇37](2)將(1)中的連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transl-Tl的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有卡那霉素抗性的LB平板上，37 °C過夜培養(yǎng)。[〇〇38](3)挑取(2)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基里，然后提取質(zhì)粒，再利用限制性內(nèi)切酶Ndel和Hindi II進行酶切驗證，最后得到了載體 pRSFDuet-davA。[〇〇39](4)將載體pRSFDuet-davA轉(zhuǎn)入到BL-22AB的感受態(tài)細(xì)胞里，涂布在帶有氨芐青霉素抗性和卡那霉素抗性的LB平板，37 °C過夜培養(yǎng)。
[0040](5)挑取(4)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性和卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基里培養(yǎng)8-10h后，用30%的甘油保存在-80°C冰箱里，得到了五.co^iBL-22AB-RA菌株菌株。[0041 ]兄co2iBL-22A-RB-YB菌株的構(gòu)建過程:(1)davB由金唯智合成，酶切位點為Nde I和Xho I，將davB片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和 Xhol處理回收后，與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的載體pACY⑶uet-1相連，使用T4DNA連接酶 25°C 連接 30min。[〇〇42](2)將(1)中的連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transl-Tl的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有氯霉素抗性的LB平板上，37 °C過夜培養(yǎng)。[〇〇43](3)挑取(2)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基里，然后提取質(zhì)粒，再利用限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol進彳丁酶切驗證，最后得到了載體pACY⑶uet_l_ davB〇[〇〇44](4)將載體pACYCDuet-1-davB轉(zhuǎn)入到ico2iBL-22A-RB的感受態(tài)細(xì)胞里，涂布在帶有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。[〇〇45](5)挑取(4)中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基里培養(yǎng)8-10h后，用30%的甘油保存在-80°C冰箱里，得到了五.co2iBL-22A-RB-YB菌株。
[0046]實施例3:全細(xì)胞催化(1)將實施例2中保存在凍存管中的菌株iC〇WBL-22A-RB-YB接種在含有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性以及LB的搖管里，37°C 200rpm條件下培養(yǎng)8h，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的500ML搖瓶里，37°C 200rpm震蕩培養(yǎng)至0D6QQnm為0.3 ;(2)向上述搖瓶中加入終濃度為0.5mM的IPTG進行誘導(dǎo)，在20 °C 200rpm條件下培養(yǎng)12h；(3)12h后，將上述菌液在6000g條件下離心5min，棄上清，并將收集的細(xì)胞用PH7.0的 PBS洗兩遍，得到用于催化反應(yīng)的細(xì)胞。[〇〇47](4)將收集的細(xì)胞用PH7.0的PBS重懸并濃縮加入到催化體系中，使體系中0D6Q()nd40，并加入配制好的PH7.0的L-賴氨酸母液，使體系中的L-賴氨酸終濃度為130g/L，Ca2+終濃度為 0 ? 02mol/L，Mn2+終濃度為 0 ? 003mol/L，TritonX-100 添加量為 0 ? 5%。[〇〇48](5)催化反應(yīng)體系在通氧速率為2.5vvm，37 °C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm條件下反應(yīng)，并定期取樣(樣品12000rpm離心3min)并用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測5-氨基戊酸的積累情況。[〇〇49](6)經(jīng)液相檢測，130g/L的L-賴氨酸經(jīng)過22h的全細(xì)胞催化反應(yīng)，基本被消耗完全，5_氨基戊酸積累到103.89g/L，摩爾收率為99%。見圖1。
[0050]實施例4:全細(xì)胞催化(1)按照實施例3中的方法進行收集細(xì)胞。[〇〇511(2)將收集的細(xì)胞用PH7.0的roS重懸并濃縮加入到催化體系中，使體系中0D6QQnmS40，并加入配制好的PH7.0的L-賴氨酸母液，使體系中的L-賴氨酸終濃度為150g/L，Ca2+終濃度為 0 ? 02mol/L，Mn2+終濃度為 0 ? 003mol/L，TritonX-100 添加量為 0 ? 5%。[0〇52](3)催化反應(yīng)體系在通氧速率為2.5vvm，37°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm條件下反應(yīng)，并定期取樣(樣品12000rpm離心3min)并用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測5-氨基戊酸的積累情況。[〇〇53](4)經(jīng)液相檢測，150g/L的L-賴氨酸經(jīng)過5h的全細(xì)胞催化反應(yīng)，消耗了 82.73%的L-賴氨酸，5-氨基戊酸積累到90.02g/L，34h后，5-氨基戊酸積累至110.46g/L，摩爾收率為 91.92%。見圖 2。[〇〇54]實施例5:分批補料全細(xì)胞催化生產(chǎn)5-氨基戊酸 (1)按照實施例3中的方法進行收集細(xì)胞。
[0055](2)將收集的細(xì)胞用PH7.0的PBS重懸并濃縮加入到催化體系中，使體系中細(xì)胞ODsoonm為40，并加入配制好的PH7.0的L-賴氨酸母液，使體系中的L-賴氨酸終濃度為160g/L， Ca2+終濃度為 0.02mol/L，Mn2+終濃度為0.003mol/L，TritonX-100 的添加量為 0.5%。[0〇56](3)催化反應(yīng)體系在通氧速率為2.5vvm，37°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm條件下反應(yīng)，并定期取樣(樣品12000rpm離心3min)，并用生物傳感儀檢測L-賴氨酸的剩余量。[0〇57]待L-賴氨酸基本耗盡時，向催化體系中補加賴氨酸鹽酸鹽粉末，使體系中的L-賴氨酸維持在合適的濃度，直至反應(yīng)達(dá)到平衡，并用蒸發(fā)光散射檢測器檢測5-氨基戊酸的積累情況。[〇〇58](4)經(jīng)蒸發(fā)光散射檢測器檢測，通過多次補料，48h后反應(yīng)達(dá)到平衡，5-氨基戊酸積累到247.35g/L。見圖3。
[0059]實施例6:表面活性劑對催化速率的影響將實施例2構(gòu)建的重組菌株[c〇2iBL-22A-RB-YB的細(xì)胞作為催化劑。[0〇6〇]控制各催化體系中，細(xì)胞0D6_m為5，L-賴氨酸終濃度為10g/L，并在各體系中分別加入不同的表面活性劑:SDS，Triton X-100，Tween-20，Tween-80，在相同條件下進行全細(xì)胞催化。[〇〇61] 每隔3h取樣并檢測5-氨基戊酸積累情況，發(fā)現(xiàn)Triton X-100能顯著提高5-氨基戊酸的生成速率。
[0062]實施例7:金屬離子對5-氨基戊酸生成的影響(1)同樣利用誘導(dǎo)表達(dá)了DavBA的重組菌株[co2iBL-22A-RB-YB的細(xì)胞作為催化劑。 [〇〇63](2)控制各體系的催化體系相同，然后在體系1中不加金屬離子，體系2中加入Fe2+，體系3中加入Ca2+，體系4中加入Mn2+，體系5中加入Zn2+，體系6中加入Cu2+，然后在相同條件下進行催化反應(yīng)。[〇〇64](3)反應(yīng)10h后取樣，采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測5-氨基戊酸的積累情況。[〇〇65](4)無金屬離子添加的體系1作為空白對照，5-氨基戊酸的產(chǎn)量為6.74g/L，摩爾收率為84.14%，添加了鈣離子的體系中3,5_氨基戊酸的產(chǎn)量為7.95g/L，摩爾收率為99.25%， 與空白對照相比，摩爾收率提高了 15.11%。添加了錳離子的體系4中，5-氨基戊酸的產(chǎn)量為 7.98g/L，摩爾收率為99.62%，與空白對照相比，摩爾收率提高了 15.48%。
【主權(quán)項】
1.一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)構(gòu)建并篩選過表達(dá)DavBA菌株；(2)將步驟(1)構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞0D6QQnmS0-90,添加L-賴氨酸、表面活性劑和金屬 離子催化反應(yīng)生產(chǎn)5-氨基戊酸。2.如權(quán)利要求1所述的一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，其特征在于:步驟 (1)所述過表達(dá)DavBA菌株的構(gòu)建方法是:將davA片段與表達(dá)載體pET-22b相連，將davB片段 與表達(dá)載體pRSF-dute相連，分別得到重組質(zhì)粒pET-22b-DavA和pRSF-davB，將重組質(zhì)粒 pET-22b-DavA和pRSF-davB導(dǎo)入五.BL21的感受態(tài)細(xì)胞中，得到過表達(dá)了davBA的重組 菌BL-22A-RB;另外將davA及davB片段與表達(dá)載體pET-22b相連，得到重組質(zhì)粒pET22b-DavBA，將重組質(zhì)粒pET22b-DavBA導(dǎo)入五.BL21的感受態(tài)細(xì)胞中，得到過表達(dá)了davBA的 重組菌i co2iBL-22AB;將davA片段與表達(dá)載體pRSF-dute相連，得到重組質(zhì)粒pRSF-DavA， 將重組質(zhì)粒pRSF-DavA導(dǎo)入重組菌五.C〇2iBL-22AB的感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株 五.coWBL-22AB-RA;最后，將davB片段與表達(dá)載體pACYC-dute相連，得到重組質(zhì)粒pACYC-davB，將重組質(zhì)粒pACYC-davB導(dǎo)入重組菌BL-22A-RB的感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株 五.co』iBL-22A-RB-YB。3.如權(quán)利要求1或2所述的一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，其特征在于: 所述的篩選方法為:將重組菌進行低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到過表達(dá)了 davBA的工程菌細(xì)胞懸液， 將細(xì)胞懸液在6000g條件，離心5min，得到靜息細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞作為催化劑，在相同的催 化體系及條件下進行全細(xì)胞催化，得到5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液，液相檢測5-氨基戊酸的濃度 并計算最終的摩爾收率，篩選出催化速率最快，摩爾收率最高的菌株作為后續(xù)催化菌株。4.如權(quán)利要求1所述一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，其特征在于:所述的 表面活性劑為SDS，Triton X-100，Tween-20，Tween-80中的一種或幾種，優(yōu)選Triton X-100〇5.如權(quán)利要求1所述一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，其特征在于:所述的 金屬離子為Fe2+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+中的一種或幾種。6.如權(quán)利要求1所述一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，其特征在于:所述L-賴氨酸的初始添加量為60?400g/L，優(yōu)選160g/L。7.如權(quán)利要求2所述一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，其特征在于:所述的 過表達(dá)DavBA菌株為i co2iBL-22A-RB-YB，將該重組菌株i coii BL-22A-RB-YB進行低溫誘 導(dǎo)培養(yǎng)并收集細(xì)胞作為催化劑。8.如權(quán)利要求1所述一種全細(xì)胞生物催化生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，其特征在于:所述的 催化反應(yīng)在通氧速率為2.5vvm，37 °C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm條件下反應(yīng)。
【文檔編號】C12P13/00GK106011191SQ201610500252
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】陳可泉, 蔡沛沛, 王昕 , 應(yīng)晗笑, 王璟, 歐陽平凱
【申請人】南京工業(yè)大學(xué)